Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come il principio della termociclicizzazione PCR mediante convezione termica possa essere applicato per eseguire una reazione reale. Questo risultato si ottiene innanzitutto presentando il concetto di come funziona la termociclicizzazione per convezione naturale, insieme ai principi fondamentali di progettazione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel mostrare come preparare la cartuccia del reattore e caricare al suo interno i reagenti.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'assemblare la cartuccia del reattore nell'unità di riscaldamento ed eseguire la reazione. L'ultimo passaggio della procedura è rimuovere i reagenti al termine della reazione e verificare i risultati mediante elettroforesi su gel. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una rapida replicazione del DNA attraverso il termociclaggio PCR mediante convezione naturale.

Ciao, sono Radha OU del laboratorio UGAs presso la Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire un rapido termociclaggio PCR mediante convezione naturale, simile al funzionamento di una lampada lava. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare la progettazione e l'ottimizzazione di dispositivi per il termociclaggio che sfruttano questo principio.

Iniziamo. Questo protocollo inizia con la progettazione e la costruzione di un semplice dispositivo termociclatore a convezione. Il dispositivo utilizzato per questa dimostrazione è costituito da cartucce intercambiabili in plastica per la camera di reazione, inserite tra due piastre di alluminio le cui temperature sono controllate in modo indipendente.

I pozzetti del reattore cilindrico sono stati ricavati fresando matrici di fori in blocchi di policarbonato, utilizzando diverse combinazioni di diametro dei fori e spessore del foglio di plastica per ottenere i rapporti d'aspetto desiderati. La progettazione ottimale prevede la scelta della corretta geometria del reattore in grado di generare un flusso circolatorio capace di trasportare i reagenti attraverso le temperature chiave coinvolte nel processo di PCR. I parametri geometrici che possono essere variati nei reattori cilindrici qui considerati sono l'altezza e il diametro, o in modo equivalente, il rapporto d'aspetto.

La superficie inferiore del reattore viene riscaldata mediante un blocco in alluminio contenente resistenze cartuccia collegate a un controllore di temperatura a microprocessore. La temperatura sulla superficie superiore del reattore è regolata tramite un blocco in alluminio collegato a un bagno d'acqua a circolazione ricircolante. L'intero montaggio viene fissato con viti in nylon per limitare la conduzione termica tra i due blocchi di alluminio opposti.

Preparare ogni rilascio di 100 mic della reazione PCR mescolando soluzione tampone 10 volte, cloruro di magnesio 25 millimolare, due DTPs di acqua distillata, la sonda per il primer diretto e inverso dell'actina beta, il DNA genomico umano come stampo e la polimerasi K-O-D-D-N-A. Prima di caricare i reagenti, sigillare la superficie inferiore della camera PCR utilizzando un sottile foglio di nastro di alluminio, risciacquare i pozzetti del reattore con una soluzione acquosa di albumina sierica bovina a 10 milligrammi per millilitro, seguita da Rain X anti-appannamento. Infine, pipettare i reagenti nei pozzetti del reattore utilizzando punte per caricamento di gel e sigillare la superficie superiore con nastro in teflon FEP.

Prima di iniziare la reazione, preriscaldare entrambi i blocchi di alluminio alle temperature desiderate per le superfici superiore e inferiore. Inserire il reattore in plastica caricato con i reagenti PCR tra i blocchi riscaldanti in alluminio e fissare rapidamente l'insieme utilizzando viti in nylon. Dopo che la reazione è proseguita per il tempo desiderato, spegnere i riscaldatori e posizionare la superficie riscaldata inferiore del dispositivo sopra un blocco metallico refrigerato per raffreddarlo rapidamente e arrestare il flusso convettivo.

Rimuovere il reattore in plastica e pipettare i prodotti fuori dalle pozzette per l'analisi successiva. Preparare un gel all'agarosio al 2% riscaldando 10 grammi di agarosio con 500 millilitri di tampone 1x su una piastra magnetica riscaldata fino a quando la soluzione diventa limpida. Caricare il gel all'agarosio nella camera di colata e inserire il pettine.

Lasciare solidificare il gel per circa 30 minuti. Rimuovere il pettine e aggiungere tampone TAE una volta fino a quando il gel è completamente ricoperto. Preparare campioni di DNA marcati con fluorescenza utilizzando due microlitri di verde cyber 100 volte.

Una soluzione composta da due microlitri di campione di DNA, due microlitri di colorante arancione di caricamento sei volte e quattro microlitri di tampone TAE. Caricare un marcatore di dimensione per DNA da 100 paia di basi e i campioni di DNA nei pozzetti del gel. Separare il DNA eseguendo l'elettroforesi a 60 volt per un'ora.

Rimuovere il gel e fotografarlo sotto luce UV per ottenere il risultato. I campi di flusso tridimensionali all'interno di reattori PCR convettivi sono stati studiati in un intervallo di diversi rapporti di aspetto utilizzando la dinamica dei fluidi computazionale, o CFD. Questi dati hanno rivelato che possono emergere schemi complessi e che un sottoinsieme di questi campi di flusso complessi può accelerare significativamente la reazione.

Questi effetti geometrici possono essere chiaramente osservati confrontando i campi di flusso in reattori con elevati e bassi rapporti di forma, a parità di elevato rapporto di forma. Gli elementi del fluido sono influenzati lungo traiettorie che descrivono percorsi sostanzialmente costituiti da anelli chiusi, vincolati a seguire gli stessi percorsi per lunghi periodi di tempo. Di conseguenza, vi è scarsa possibilità di scambio tra le traiettorie di flusso che espongono i reagenti alla sequenza ottimale di condizioni termiche per la PCR e l'insieme molto più ampio delle rimanenti traiettorie che non contribuiscono all'amplificazione.

Il campo di flusso è molto diverso a un rapporto di forma più piccolo. Il campo di flusso è più caotico, in quanto le traiettorie degli elementi fluidi non seguono più percorsi chiusi. Sebbene le reazioni siano soggette a un profilo termico più complesso, gli elementi fluidi sono in grado di esplorare un intervallo molto più ampio di traiettorie, in modo che una maggiore parte del volume del reagente abbia l'opportunità di sperimentare profili termici ottimali.

Questi risultati suggeriscono che, sebbene le singole traiettorie di flusso con H su D uguale a nove possano apparire più favorevoli per la PCR, generando profili di temperatura simili a quelli impiegati in un termociclatore convenzionale, la natura caotica del campo di flusso con HOD uguale a tre domina su scala globale promuovendo uno scambio potenziato, in modo che i reagenti non rimangano intrappolati in traiettorie sfavorevoli per periodi prolungati. Per verificare questa ipotesi e determinare quale geometria del reattore fosse più favorevole per la PCR, entrambi i cilindri sono stati utilizzati per eseguire la replicazione PCR di un target di 295 paia di basi associato al gene della beta-actina a partire da un template di DNA genomico umano; l'amplificazione del prodotto target corretto è stata ripetutamente ottenuta in soli 10 minuti con H su D uguale a tre.

Al contrario, la stessa reazione richiedeva almeno 20 minuti prima che fossero osservati prodotti rilevabili a H su D pari a nove. La specificità della reazione è anche molto maggiore a H su D pari a tre, dove si ottiene un singolo prodotto PCR. Mentre a H su D pari a nove vengono generati multipli prodotti non specifici, dove il campo di flusso intrappola elementi del fluido in traiettorie termiche sfavorevoli per periodi di tempo prolungati.

È stato appena mostrato come eseguire una reazione PCR utilizzando un termociclatore a flusso convettivo. Durante questa procedura, è importante ricordare di sigillare i reagenti all'interno della camera del reattore senza intrappolare bolle d'aria. Queste ultime disturberebbero il campo di flusso interno e inibirebbero la reazione.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.