Name: Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri la PCR termica rapida mediante convezione termica naturale utilizzando dispositivi a microscala con geometrie ottimizzate. Questo metodo semplifica l'amplificazione del DNA con flussi caotici che migliorano l'efficienza reattiva.

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Si ringrazia T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, e B. Wallek a Lynntech, Inc. per l&#39;assistenza tecnica e molte utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla US National Science Foundation (NSF) sotto concedere cbet-0933688.

1. Progettazione di base del termociclatore convettivo <ol><li> Abbiamo costruito un dispositivo semplice ciclo termico convettivo composto da intercambiabili in plastica reazione da camera "cartucce" che sono inserito tra due lastre di alluminio le cui temperature sono controllati indipendentemente 7 (Figura 2). </li><li> Pozzi reattore cilindrico vengono incorporati per gli array lavorazione di fori in blocchi in policarbonato, con diverse combinazioni di diametro del foro e spessore del foglio di plastica utilizzato per ottenere le proporzioni desiderate (altezza / diametro = h / d). Due diverse geometrie del reattore sono considerati nei risultati qui presentati: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 microlitri volume; h / d = 3: h = 6.02 mm, d = 1,98 millimetri, 18,5 microlitri volume. </li><li> La superficie inferiore del reattore è riscaldata utilizzando un blocco di alluminio contenenti riscaldatori a cartuccia interfacciato con un regolatore di temperatura guidato microprocesser. </li><li> La temperatura alla superficie superiore del reattore è regolata utilizzando un blocco di alluminio collegato a un bagno d'acqua di ricircolo. </li><li> Tutta l'assemblea è bloccato insieme usando viti di nylon per limitare conduzione termica tra i blocchi contrapposti in alluminio. </li></ol> 2. Preparazione e caricamento della miscela di reazione PCR <ol><li> Una tipica miscela di reazione 100 microlitri contiene 10 ml di soluzione tampone 10x, 6 ml di 25 mM MgCl 2, 10 l di dNTPs (2 mm ciascuno), 41,2 ml di acqua deionizzata, 10 ml di β-actina sonda, 10 ml di β -actina in avanti fondo, 10 ml di β-actina fondo inverso, 2 l di DNA umano modello genomico (10 ng / mL) e 0,8 l di DNA polimerasi KOD (2,5 unità / mL). </li><li> Prima di caricare i reagenti, sigillare la superficie inferiore della camera di PCR utilizzando un sottile strato di nastro di alluminio. </li><li> Sciacquare i pozzi reattore con 10 mg / mL di soluzione acquosa di albumina sierica bovina seguito da Rain-X Anti-Fog. </li><li> Reagenti Pipettare nei pozzetti reattore usando lungo gel-loading puntali e sigillare la superficie superiore con del nastro Teflon FEP. </li></ol> 3. Esecuzione della reazione nel termociclatore convettivo <ol><li> Prima di iniziare la reazione, preriscaldare i due blocchi di alluminio per le temperature desiderate superficie superiore e inferiore. </li><li> Sandwich il reattore di plastica cariche di reagenti PCR tra i blocchi di riscaldamento in alluminio, e rapidamente morsetto l'assemblea insieme con le viti in nylon. </li><li> Dopo la reazione è proceduto per il tempo desiderato, spegnere il riscaldamento e il luogo inferiore (a caldo) della superficie del dispositivo sulla cima di un blocco di metallo refrigerato per raffreddare rapidamente e fermare il flusso convettivo. </li><li> Rimuovere il reattore di plastica e pipetta prodotti dalle fonti (con punte di carico lungo il gel) per successive analisi. </li></ol> 4. Esecuzione di analisi gel elettroforesi <ol><li> Preparare un peso del 2% gel riscaldando 10 g di agarosio con 500 ml di tampone 1x su un piatto caldo mescolando fino a quando la soluzione diventa chiara. </li><li> Caricare il gel nel cassetto casting e inserire il pettine. Lasciate che i set di gel per circa 30 min. </li><li> Togliere il pettine e aggiungere 1x tampone TAE fino a quando il gel è sommerso. </li><li> Fluorescenza campioni di DNA macchiato contenere 2 microlitri 100x SYBR Green soluzione I, 2 campione di DNA microlitri, 2 microlitri 6x Dye Caricamento Orange, e 4 microlitri di buffer TAE. </li><li> Aggiungere i campioni di DNA nei pozzetti ed eseguire il distacco a 60 V per 1 h con un DNA di 100 bp scala marcatore dimensionamento. </li><li> Rimuovere il gel e fotografare sotto la luce UV per ottenere il risultato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Progettazione ottimale di termociclatori convettivi comporta la scelta della corretta geometria del reattore che genererà un flusso circolatorio in grado di trasportare i reagenti attraverso le temperature chiave coinvolti nel processo di PCR. I parametri geometrici che possono essere modificate in reattori cilindrici qui considerati sono l'altezza (h) e diametro (d), o equivalentemente il rapporto di aspetto (h / d). Abbiamo esplorato il 3-D campi di flusso convettivo all'interno dei reattori PCR su una gamma di differenti formati utilizzando fluidodinamica computazionale (CFD), ed ha trovato che i modelli complessi possono insorgere inaspettatamente. Ancora più importante, la nostra analisi ha scoperto un sottoinsieme di questi campi di flusso complessi che accelerare in maniera significativa la reazione 12. Questi effetti geometrici può essere vista chiaramente confrontando i campi di flusso nei reattori a proporzioni alte e basse. Nel caso in alto rapporto di aspetto (h / d = 9; un alto, magro cilindro), elementi fluidi sono convogliati lungo traiettorie tracciare percorsi che sono essenzialmente perimetri chiusi, e sono locked-in per seguire gli stessi percorsi per lunghi periodi di tempo (Figura 3a). Di conseguenza, ci sono poche opportunità di scambio tra ftraiettorie basso che esporre i reagenti per la sequenza ottimale delle condizioni termiche per la PCR (oscillante tra il ricottura e denaturazione estremi sulle superfici superiore e inferiore del reattore) e l'insieme molto più grande di traiettorie rimanenti che non contribuiscono alla amplificazione (localizzata vicino al centro del reattore). Il campo di flusso è molto diverso in un rapporto di formato più piccolo (h / d = 3; una più breve, cilindro più ampio), diventando sempre più caotica, nel senso che le traiettorie elemento fluido non seguono più tracciati chiusi (Figura 3b). Così, anche se i reagenti vengono sottoposti ad un profilo di temperatura più complesso, elementi fluidi sono in grado di esplorare una gamma molto più ampia di traiettorie in modo che più del volume di reagente ha l'opportunità di un'esperienza ottimale profili termici. Counterintuitively Questi risultati suggeriscono che, mentre le traiettorie del flusso singoli h / d = 9 può apparire più favorevole per PCR con la produzione di profili di temperatura che "look" simile a quelli impiegati in un termociclatore convenzionale, la natura caotica del campo di moto in h / d = 3 domina in ultima analisi, su scala globale, promuovendo lo scambio migliorato in modo che i reagenti non restare intrappolati nelle traiettorie sfavorevoli per molto tempo. Per verificare questa ipotesi e stabilire quali la geometria del reattore è stata più favorevole per la PCR, abbiamo usato tutti e due a eseguire la replica di un obiettivo PCR 295 bp associata alla β-actina gene da un modello umano del DNA genomico. Sorprendentemente, abbiamo raggiunto regolarmente l'amplificazione del prodotto bersaglio corretto in soli 10 min a h / d = 3 (Figura 4a), mentre la stessa reazione richiesto almeno 20 minuti prima che i prodotti rilevabili sono stati osservati h / d = 9 (Fig. 4b) . La specificità di reazione è molto maggiore di h / d = 3, dove un singolo prodotto PCR è ottenuta, pur essendo più prodotti non specifici vengono generati h / d = 9 dove le trappole flusso di elementi fluidi in campo sfavorevole traiettorie termica per lunghi periodi di tempo. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Convezione termica in una camera cilindrica di cui sopra e sotto le superfici sono mantenuti a diverse temperature fisso. Se la temperatura alla superficie inferiore è più alto nella parte superiore, un gradiente di densità verticale è stabilita entro il fluido racchiuso in grado di generare un modello di flusso circolatorio. Con la giusta scelta dei parametri geometrici (altezza h e diametro d), il campo di flusso convettivo può essere sfruttata per azionare termici PCR quando le superfici superiore e inferiore sono manintained vicino ricottura e denaturazione temperature, rispettivamente (gravità agisce verticalmente verso il basso). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) I componenti chiave di un flusso convettivo PCR thermocyler. Una cartuccia reattore è costituito da un blocco di policarbonato contenente una serie di camere cilindriche. Il blocco è inserita tra una piastra superiore progettato per essere collegato ad un bagno d'acqua in circolazione e un piatto fondo incorporando riscaldamento incorporato. (B) I reagenti PCR vengono caricati e sigillati all'interno della cartuccia reattore, dopo di che il dispositivo è montato di effettuare la reazione. Al termine, la procucts può essere facilmente pipettati per successive analisi. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Simulazioni computazionali di 3-D campi di flusso convettivo generato all'interno dei reattori cilindrici con temperature di 53 e 96 ° C imposto alle superfici superiore e inferiore, rispettivamente. I risultati sono mostrati in proporzioni di (a) h / d = 9 (38.2 volume del reattore mL) e (b) h / d = 3 (18.5 volume del reattore mL). Un rappresentante traiettoria seguita da un elemento fluido che viaggiano attraverso il campo di flusso 3D è visibile a sinistra insieme a proiezioni di vista superiore e laterale del percorso, la trama corrispondente della temperatura in funzione del tempo a seguito di un elemento fluido è mostrato a destra. Il profilo termico in h / d = 9 sembra vicina a quella di un termociclatore convenzionale, ma il campo di flusso caotico di h / d = 3 è counterintuitively più favorevole per la PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Replicazione del DNA risultati ottenuti nelle geometrie del reattore mostrato nella Figura 3 (superiore ed inferiore superfici sono state mantenute a 53 e 96 ° C, rispettivamente). (A) PCR è fortemente accelerato a h / d = 3, come risulta evidente dai prodotti forti visibili dopo soli 10 minuti di tempo di reazione (M: 100 bp scaletta, corsie 1-4: i prodotti da reazioni parallele in 4 differenti camere cilindriche). (B h / d = 9 sono necessari almeno 20 minuti prima che i prodotti visibili sono osservate, e le bande sono più evidenti che indicano la replicazione del DNA non specifico obiettivo, oltre al prodotto desiderato (M: 100 bp scala, corsie 1-2: i prodotti da reazioni parallele in due differenti camere cilindriche).

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;interazione tra flusso e la reazione chimica può cambiare drasticamente sotto l&#39;influenza di avvezione caotica. Ma questi stati di flusso complessi sono difficili da studiare, in particolare nelle geometrie reale, in cui gli effetti 3D diventano importanti. Rayleigh-Bénard convezione a / p&gt; 1 non solo fornisce una comoda piattaforma per esplorare questi fenomeni, la loro applicazione per eseguire PCR permette anche l&#39;accoppiamento tra flusso e reazioni chimiche di essere indagato. Questa funzionalità unica consente di selezionare gli stati di flusso ottimale dove caotico agire effetti (counterintuitively) per accelerare la velocità di replicazione del DNA.

<table><tbody><tr><td>Kit della polimerasi KOD per DNA</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti di controllo TaqMan &amp;#946;-actina</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Nastro in alluminio</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Fog</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta per caricamento di gel lunghe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>Nastro in teflon FEP</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Gel di agarosio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di corsa TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Colorante arancione di caricamento 6x</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore di dimensione per DNA ladder da 100 pa</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

rapido pcr termici utilizzando microscala convezione termica

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Molti test di biologia molecolare dipendono in qualche modo la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare un inizialmente diluire il campione di DNA bersaglio a livelli di concentrazione rilevabile. Ma la progettazione di hardware convenzionale termocicli PCR, prevalentemente sulla base di massicci blocchi di riscaldamento metallo la cui temperatura è regolata da riscaldamento termoelettrico, limita fortemente la velocità raggiungibile di reazione 1. Notevole energia elettrica è necessaria anche per riscaldare e raffreddare ripetutamente la miscela di reazione, limitando la possibilità di distribuire questi strumenti in un formato portatile. Convezione termica è emerso come un approccio promettente termici alternativa che ha il potenziale per superare queste limitazioni 2-9. Flussi convettivi sono all&#39;ordine del giorno in una vasta gamma di impostazioni che vanno dalla atmosfera terrestre, gli oceani, e gli interni, di lampade lava decorativa e colorata. Movimento fluido è iniziato nello stesso modo in ogni caso: una instabilità dell&#39;assetto guidato nasce quando un volume limitato di liquido è sottoposto ad un gradiente di temperatura spaziale. Questi stessi fenomeni offrire un modo interessante per eseguire termici PCR. Applicando un gradiente di temperatura statica attraverso una geometria del reattore concepiti in modo appropriato, un continuo flusso circolatorio può essere stabilito che ripetutamente trasporto reagenti PCR attraverso zone di temperatura associata alla denaturazione, ricottura, estensione e le fasi della reazione (Figura 1). Termici può quindi essere azionato in una pseudo-isotermico maniera semplicemente tenendo due superfici opposte a temperature fisse, eliminando completamente la necessità di riscaldare e raffreddare ripetutamente lo strumento. Una delle principali sfide per la progettazione di termociclatori convettiva è la necessità di controllare con precisione la velocità spaziale e distribuzione della temperatura all&#39;interno del reattore per assicurare che i reagenti in sequenza occupano le zone di temperatura corretta per un periodo di tempo sufficiente 10,11. Qui si descrivono i risultati dei nostri sforzi per sondare la piena 3-D di velocità e distribuzione della temperatura in microscala convettivo termociclatori 12. Inaspettatamente, abbiamo scoperto un sottoinsieme delle traiettorie di flusso complessi che sono molto favorevoli per PCR a causa di una combinazione sinergica di (1) lo scambio continuo tra i percorsi di flusso che offre l&#39;opportunità migliore per i reagenti per assaggiare l&#39;intera gamma di profili di temperatura ottimale, e ( 2) aumento del tempo speso all&#39;interno della zona di temperatura estensione il fattore limitante della PCR. Estremamente rapidi tempi di amplificazione del DNA (sotto i 10 min) sono realizzabili in reattori progettati per generare questi flussi.

Descriviamo un nuovo metodo per eseguire la replicazione del DNA tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Convezione termica viene sfruttata per reagenti navetta continuo tra denaturazione, ricottura, e le condizioni di estensione, mantenendo opposte superfici del reattore a temperatura costante. Questo design intrinsecamente semplice promette di rendere rapido PCR più accessibile.

Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

Molti saggi di biologia molecolare dipendono in qualche modo dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare un campione di DNA bersaglio inizialmente diluito fino a una concentrazione rilevabile...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come il principio della termociclicizzazione PCR mediante convezione termica possa essere applicato per eseguire una reazione reale. Questo risultato si ottiene innanzitutto presentando il concetto di come funziona la termociclicizzazione per convezione naturale, insieme ai principi fondamentali di progettazione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel mostrare come preparare la cartuccia del reattore e caricare al suo interno i reagenti.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'assemblare la cartuccia del reattore nell'unità di riscaldamento ed eseguire la reazione. L'ultimo passaggio della procedura è rimuovere i reagenti al termine della reazione e verificare i risultati mediante elettroforesi su gel. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una rapida replicazione del DNA attraverso il termociclaggio PCR mediante convezione naturale.Ciao, sono Radha OU del laboratorio UGAs presso la Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire un rapido termociclaggio PCR mediante convezione naturale, simile al funzionamento di una lampada lava. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare la progettazione e l'ottimizzazione di dispositivi per il termociclaggio che sfruttano questo principio.Iniziamo. Questo protocollo inizia con la progettazione e la costruzione di un semplice dispositivo termociclatore a convezione. Il dispositivo utilizzato per questa dimostrazione è costituito da cartucce intercambiabili in plastica per la camera di reazione, inserite tra due piastre di alluminio le cui temperature sono controllate in modo indipendente.I pozzetti del reattore cilindrico sono stati ricavati fresando matrici di fori in blocchi di policarbonato, utilizzando diverse combinazioni di diametro dei fori e spessore del foglio di plastica per ottenere i rapporti d'aspetto desiderati. La progettazione ottimale prevede la scelta della corretta geometria del reattore in grado di generare un flusso circolatorio capace di trasportare i reagenti attraverso le temperature chiave coinvolte nel processo di PCR. I parametri geometrici che possono essere variati nei reattori cilindrici qui considerati sono l'altezza e il diametro, o in modo equivalente, il rapporto d'aspetto.La superficie inferiore del reattore viene riscaldata mediante un blocco in alluminio contenente resistenze cartuccia collegate a un controllore di temperatura a microprocessore. La temperatura sulla superficie superiore del reattore è regolata tramite un blocco in alluminio collegato a un bagno d'acqua a circolazione ricircolante. L'intero montaggio viene fissato con viti in nylon per limitare la conduzione termica tra i due blocchi di alluminio opposti.Preparare ogni rilascio di 100 mic della reazione PCR mescolando soluzione tampone 10 volte, cloruro di magnesio 25 millimolare, due DTPs di acqua distillata, la sonda per il primer diretto e inverso dell'actina beta, il DNA genomico umano come stampo e la polimerasi K-O-D-D-N-A. Prima di caricare i reagenti, sigillare la superficie inferiore della camera PCR utilizzando un sottile foglio di nastro di alluminio, risciacquare i pozzetti del reattore con una soluzione acquosa di albumina sierica bovina a 10 milligrammi per millilitro, seguita da Rain X anti-appannamento. Infine, pipettare i reagenti nei pozzetti del reattore utilizzando punte per caricamento di gel e sigillare la superficie superiore con nastro in teflon FEP.Prima di iniziare la reazione, preriscaldare entrambi i blocchi di alluminio alle temperature desiderate per le superfici superiore e inferiore. Inserire il reattore in plastica caricato con i reagenti PCR tra i blocchi riscaldanti in alluminio e fissare rapidamente l'insieme utilizzando viti in nylon. Dopo che la reazione è proseguita per il tempo desiderato, spegnere i riscaldatori e posizionare la superficie riscaldata inferiore del dispositivo sopra un blocco metallico refrigerato per raffreddarlo rapidamente e arrestare il flusso convettivo.Rimuovere il reattore in plastica e pipettare i prodotti fuori dalle pozzette per l'analisi successiva. Preparare un gel all'agarosio al 2% riscaldando 10 grammi di agarosio con 500 millilitri di tampone 1x su una piastra magnetica riscaldata fino a quando la soluzione diventa limpida. Caricare il gel all'agarosio nella camera di colata e inserire il pettine.Lasciare solidificare il gel per circa 30 minuti. Rimuovere il pettine e aggiungere tampone TAE una volta fino a quando il gel è completamente ricoperto. Preparare campioni di DNA marcati con fluorescenza utilizzando due microlitri di verde cyber 100 volte. Una soluzione composta da due microlitri di campione di DNA, due microlitri di colorante arancione di caricamento sei volte e quattro microlitri di tampone TAE. Caricare un marcatore di dimensione per DNA da 100 paia di basi e i campioni di DNA nei pozzetti del gel. Separare il DNA eseguendo l'elettroforesi a 60 volt per un'ora.Rimuovere il gel e fotografarlo sotto luce UV per ottenere il risultato. I campi di flusso tridimensionali all'interno di reattori PCR convettivi sono stati studiati in un intervallo di diversi rapporti di aspetto utilizzando la dinamica dei fluidi computazionale, o CFD. Questi dati hanno rivelato che possono emergere schemi complessi e che un sottoinsieme di questi campi di flusso complessi può accelerare significativamente la reazione.Questi effetti geometrici possono essere chiaramente osservati confrontando i campi di flusso in reattori con elevati e bassi rapporti di forma, a parità di elevato rapporto di forma. Gli elementi del fluido sono influenzati lungo traiettorie che descrivono percorsi sostanzialmente costituiti da anelli chiusi, vincolati a seguire gli stessi percorsi per lunghi periodi di tempo. Di conseguenza, vi è scarsa possibilità di scambio tra le traiettorie di flusso che espongono i reagenti alla sequenza ottimale di condizioni termiche per la PCR e l'insieme molto più ampio delle rimanenti traiettorie che non contribuiscono all'amplificazione.Il campo di flusso è molto diverso a un rapporto di forma più piccolo. Il campo di flusso è più caotico, in quanto le traiettorie degli elementi fluidi non seguono più percorsi chiusi. Sebbene le reazioni siano soggette a un profilo termico più complesso, gli elementi fluidi sono in grado di esplorare un intervallo molto più ampio di traiettorie, in modo che una maggiore parte del volume del reagente abbia l'opportunità di sperimentare profili termici ottimali.Questi risultati suggeriscono che, sebbene le singole traiettorie di flusso con H su D uguale a nove possano apparire più favorevoli per la PCR, generando profili di temperatura simili a quelli impiegati in un termociclatore convenzionale, la natura caotica del campo di flusso con HOD uguale a tre domina su scala globale promuovendo uno scambio potenziato, in modo che i reagenti non rimangano intrappolati in traiettorie sfavorevoli per periodi prolungati. Per verificare questa ipotesi e determinare quale geometria del reattore fosse più favorevole per la PCR, entrambi i cilindri sono stati utilizzati per eseguire la replicazione PCR di un target di 295 paia di basi associato al gene della beta-actina a partire da un template di DNA genomico umano; l'amplificazione del prodotto target corretto è stata ripetutamente ottenuta in soli 10 minuti con H su D uguale a tre.Al contrario, la stessa reazione richiedeva almeno 20 minuti prima che fossero osservati prodotti rilevabili a H su D pari a nove. La specificità della reazione è anche molto maggiore a H su D pari a tre, dove si ottiene un singolo prodotto PCR. Mentre a H su D pari a nove vengono generati multipli prodotti non specifici, dove il campo di flusso intrappola elementi del fluido in traiettorie termiche sfavorevoli per periodi di tempo prolungati.È stato appena mostrato come eseguire una reazione PCR utilizzando un termociclatore a flusso convettivo. Durante questa procedura, è importante ricordare di sigillare i reagenti all'interno della camera del reattore senza intrappolare bolle d'aria. Queste ultime disturberebbero il campo di flusso interno e inibirebbero la reazione.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

PCR è emerso come una tecnica comune in molti laboratori di biologia molecolare. A condizione: ecco un breve resoconto di diversi protocolli convenzionali di PCR. Poiché ogni reazione è un esperimento unico, condizioni ottimali richiesti per generare un prodotto variare. Comprendere le variabili in una reazione permetterà di migliorare notevolmente l'efficienza di risoluzione dei problemi, aumentando così la possibilità di ottenere il risultato desiderato.

Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è un test in vitro per lo studio della conversione prionica e barriere deformazione e specie. Può anche essere usato come un test di rilevazione prione.

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici, e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione microbica amplicone, amplicone pyrosequencing, e l'analisi di sequenza del DNA.

Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.

Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

La genotipizzazione completa di un campione coda di topo, tra cui la digestione dei tessuti e la lettura della PCR, è fatto in un'ora e mezza con Sigma SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue kit.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

Il Solaris qPCR saggi di espressione genica sono nuovi pre-progettati qPCR primer / sonda combinazioni progettato per semplificare il processo di qPCR senza sacrificare la specificità e la robustezza del test.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Scopri la PCR termica rapida mediante convezione termica naturale utilizzando dispositivi a microscala con geometrie ottimizzate. Questo metodo semplifica l'amplificazione del DNA con flussi caotici che migliorano l'efficienza reattiva.

Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

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