Induzione e Monitoraggio di Active ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in ratti

Ciao, sono Christine Beaton. Lavoro nel laboratorio di George Chandy presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'UCI. Oggi vi mostrerò come indurre una risposta DTH attiva nei ratti.

Per questo preparerò un'emulsione di KLH, che è il mio antigene, in adiuvante France. Poi inietterò questa emulsione alla base della coda di ratti Lewis. Questo indurrà l'immunizzazione dei ratti contro il KLH. E dopo una settimana sfiderò i ratti con KLH e misurerò la reazione di ipersensibilità ritardata (DTH) mediante la misurazione del gonfiore.

Questo è il sito di sfida e lo stiamo utilizzando in laboratorio per osservare l'effetto degli inibitori dei canali PO sulle reazioni infiammatorie come la DTH. Ecco l'adjuvante trans incompleto che userò per preparare l'emulsione. Potrei anche utilizzare l'adjuvante trans completo.

Ecco del quarzo di KLH, che è il mio antigene oggi, e ho una soluzione qui a due milligrammi per ml. In PBS, userò questa siringa da cinque ml per prelevare l'adjuvante incompleto e trasferirlo in un tubo da 15 ml. Poi metterò un tubo sul vortex e, mentre agito, aggiungerò l'antigene goccia a goccia all'adjuvante.

Poi agiterò al vortex per altri cinque minuti. Una volta terminato, riempirò questa siringa di vetro da 5 M con la mia miscela; deve essere una siringa di vetro perché l'adjuvante tende a degradare la plastica. Le siringhe da 5 M che abbiamo trovato si sono rivelate le migliori per preparare l'emulsione.

Dimensioni più piccole o più grandi non sono altrettanto buone. Una volta riempita la mia siringa con la miscela, userò questo ponte metallico per collegare questa siringa di vetro a un'altra siringa di vetro da cinque millilitri. Poi applicherò pressione sulle siringhe in modo da far passare la miscela da una siringa all'altra il più rapidamente possibile, finché non diventa davvero dura, finché l'emulsione non diventa davvero compatta, e a quel punto sarà pronta per l'iniezione.

Quindi aggiungerò 2,5 ml del mio adjuvante. Inietto prima dell'aria per poter prelevare più facilmente l'adjuvante, quindi trasferisco tutto l'adjuvante nel mio tubo. A questo punto prelevo 2,5 ml di questa soluzione e li aggiungo al vortice.

Dato che ho prelevato 2,5 ml dell'adjuvante, preleverò anche 2,5 ml del mio KLH. Quindi, mentre aggiungo goccia a goccia, vedrete che la miscela cambierà colore e diventerà bianca. Ora ho aggiunto tutto l'antigene all'adjuvante.

Quindi, quello che farò sarà agitare la miscela al vortex per ulteriori cinque minuti. Ma poiché non voglio tenere il tubo in mano per cinque minuti, lo fisserò con del nastro adesivo al vortex per creare il vortice all'interno del tubo; in questo modo non dovete tenerlo voi, ma volete che ruoti il più velocemente possibile senza farlo traboccare. Quindi lo lascerò così per cinque minuti.

Quindi i cinque minuti sono terminati. Ora smetterò di agitare a vortice e il mio campione è bianco. Prendo quindi il tubo. Oops.

Il composto è completamente bianco ormai, ma è ancora piuttosto liquido. Tuttavia, desidero una consistenza più densa per l'iniezione. Pertanto, trasferirò l'intero composto in una siringa di vetro da 5 ml.

Quindi quelle siringhe sono state autoclavate. Collego quindi una siringa completa al mio ponte. Dall'altra siringa, collego soltanto il corpo.

Lascio fuori lo stantuffo e poi verserò la mia miscela nella siringa superiore. Trasferirò tutto nella siringa inferiore. Dopodiché dovrò spingere la bolla d'aria che ho qui.

Quindi stacco la siringa superiore e spingo la bolla d'aria. La bolla è difficile da vedere, ma è proprio qui. Quindi spingo la bolla d'aria.

Lo spingo anche fuori dal ponte, quindi ricollego la siringa superiore. Verifico che tutto sia collegato saldamente, quindi passerò il mio mix da una siringa all'altra. All'inizio è facile, ma presto il mix diventerà duro.

Stasera sta diventando più difficile e non voglio rompere il ponte, quindi giro semplicemente le mie siringhe. A volte ci vuole più tempo. Varia da emulsione a emulsione.

Probabilmente dipende dalla temperatura e dal livello di umidità. Ma penso che la mia emulsione sia pronta. È molto più densa rispetto a quando l'ho versata.

È completamente bianco. E c'è una sola fase. Non si dovrebbe mai verificare la separazione della fase ACO dall'olio.

Ora è pronto per l'iniezione. L'immersione è ora pronta per essere iniettata. Per iniettarla, utilizzo, inietterò 200 microlitri per capanna.

Per questo utilizzerò siringhe da tre millilitri. Uso siringhe con attacco a baionetta per evitare che l'ago si stacchi, poiché l'emulsione può essere molto densa e difficile da iniettare. Per quanto riguarda gli aghi, cerco di utilizzare gli aghi più piccoli possibile che comunque permettano il passaggio dell'emulsione.

E ho scoperto che le siringhe da 20 3G sono sufficientemente adatte per questa emulsione. Per emulsioni più dense, potrebbe essere necessario utilizzare siringhe più grandi. Ora, nel modo in cui lo eseguiamo, una persona tiene il ratto e l'altra effettua l'iniezione.

E per una sicurezza massima, la persona che tiene i ratti, anche se questi ratti sono molto tranquilli e abituati ad essere manipolati, utilizza comunque quei guanti resistenti ai denti dei roditori, giusto per garantire la massima sicurezza: non vogliamo certo essere morsi da un ratto. Quindi metto tutta l'emulsione in una siringa di vetro e scollego la siringa di vetro vuota dal ponte. Al suo posto inserisco la mia siringa di plastica da tre millilitri con blocco inferiore.

Ora trasferisco più di quanto ne abbia bisogno per un'incanalatura di emulsione. Spingo verso l'estremità la bolla d'aria. Poiché intendo iniettare 200 microlitri per canalatura, lascio 300 microlitri nella mia siringa.

Stacco il collegamento, posiziono l'ago sulla mia siringa di plastica, quindi riempio l'ago e abbasso lo stantuffo a 200 microlitri. In questo modo mi assicuro di non avere bolle d'aria. Ora siamo pronti per effettuare l'iniezione.

Quindi dobbiamo assicurarci che il ratto non si muova. Prendiamo il ratto e metto un dito sopra la spalla e uno sotto, quindi con l'altra mano tengo le zampe posteriori e la coda ed effettuiamo l'iniezione nei fianchi qui, iniettando microlitri su questo lato e poi microlitri sull'altro lato. La scorsa settimana ho immunizzato i ratti con un'emulsione contenente KLH come antigene.

Oggi li sottoporrò a una sfida intradermica sul dorso con KLH, che è il mio antigene, e con ovoalbumina, che è un antigene pertinente; ma per poterli iniettare intradermicamente sul dorso, prima devo rasarli. A tale scopo, utilizzo semplicemente un rasoio elettrico. Sì, beh, cambio ago tra un ratto e l'altro per assicurarmi che l'ago non sia smussato.

Rende molto più facile l'iniezione intradermica, specialmente quando inietto piccoli volumi di 20 microlitri per ogni antigene. Ho quindi iniettato i miei due antigeni in tutti i ratti e li lascerò nelle loro gabbie fino a domani. Domani saremo in grado di osservare un'infiammazione.

Pertanto, il sito di iniezione sarà arrossato e gonfio e potremo misurare il diametro della zona infiammata come indice di infiammazione. Ieri ho iniettato nei ratti, per via intradermica sul dorso, un antigene specifico, ovvero la KLH, e un antigene non specifico, ovvero l'albumina. Ora, a distanza di 24 ore, osserverò i ratti per verificare la presenza di un'infiammazione.

Quindi mi aspetto un'infiammazione solo nel sito di KLH e l'infiammazione si manifesterà come arrossamento e gonfiore. E dopo aver osservato l'infiammazione, misurerò l'area infiammata semplicemente misurando il diametro della zona. Questo qui è il sito iniettato con KH e si può vedere senza problemi che c'è una notevole infiammazione.

È molto rosso rispetto alla pelle normale ed è gonfio. Se ora osserviamo l'altro sito che ha ricevuto l'albumina, si può vedere il sito di iniezione proprio qui, ma non c'è arrossamento né gonfiore significativi. Quindi il controllo negativo ha funzionato.

Ora misurerò l'area dell'infiammazione. Per farlo, userò un comune righello e effettuerò una misurazione in millimetri. Questa misura è di sei millimetri e ne eseguo una seconda.

Questo misura cinque millimetri. C'è molto poca arrossatura; prenderò la misurazione, ma è appena un millimetro. Quindi quello che vi ho mostrato qui è come preparare un'emulsione con un antigene, come immunizzare i ratti con questa emulsione e poi sottoporli a una sfida una settimana dopo con l'antigene utilizzato per l'immunizzazione e anche con un antigene pertinente, e come visualizzare e misurare il grado di infiammazione utilizzato nel laboratorio Chan.

Utilizziamo regolarmente questa tecnica come un saggio semplice per misurare l'effetto degli inibitori dei canali del potassio sull'infiammazione nei ratti.