Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

I neuroni ippocampali e corticali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la polarizzazione neuronale del sistema nervoso centrale, la crescita assonale e dendritica e la formazione e funzione delle sinapsi. Un vantaggio della coltura di questi neuroni è che si polarizzano facilmente, formando assoni e dendriti distintivi su un substrato bidimensionale a densità molto basse. Questo video illustra una tecnica per dissezionare, coltivare e trasfettare neuroni ippocampali e corticali embrionali di topo mediante nucleofezione, che consente l'espressione di proteine di fusione marcate con fluorocromo fin dalle prime fasi dello sviluppo, approssimativamente quattro-otto ore dopo il seeding. L'espressione delle proteine marcate con fluorocromo viene mantenuta per tutta la vita del neurone, per oltre due mesi in coltura. Ciò permette di studiare la funzione delle proteine durante eventi precoci dello sviluppo, come la crescita dell'assone, e eventi successivi, come la sinaptogenesi e la plasticità sinaptica.

Per prima cosa, le cellule gliali vengono isolate dagli emisferi corticali di topi postnatali di età compresa tra uno e tre giorni e seminate in fiasche. Dopo aver raggiunto una confluenza compresa tra il 70 e il 100%, le cellule gliali vengono quindi riseminate su coprivetri di vetro.

Quindi, i neuroni ippocampali o corticali vengono isolati da topi E 15,5 e trasfettati mediante nucleofezione con plasmidi codificanti proteine fluorescenti di fusione come la proteina fluorescente rossa. I neuroni trasfettati vengono quindi seminati in camere per imaging per studi a breve termine. Per colture a lungo termine, cellule gliali su coprioggetti di vetro vengono capovolte sopra colture ippocampali o corticali per fornire supporto trofico; singoli neuroni possono quindi essere osservati mediante imaging per mostrare la localizzazione dinamica delle proteine di fusione lungo gli assoni o le dendriti dei neuroni.

Ciao, sono Eric Dent, professore assistente di anatomia presso l'Università del Wisconsin di Madison. Oggi, tre dei miei studenti universitari, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard, illustreranno una procedura per l'isolamento, la semina e il mantenimento di colture di neuroni corticali e ippocampali per colture a breve e lungo termine. Queste colture possono essere utilizzate per studiare la dinamica di proteine fluorescenti di fusione durante tutto lo sviluppo neuronale, dalla crescita iniziale dei neuriti fino allo sviluppo di assoni e dendriti e alla sinaptogenesi.

Per preparare le camere per l'acquisizione di immagini di neuroni ippocampali e corticali di topo embrionali, iniziare con piastre di Petri da 35 millimetri dotate di fori da 15 millimetri praticati sul fondo, rimuovendo tutte le bave. Sciogliere un miscuglio di paraffina e vaselina in rapporto tre a uno in un tubo conico, ponendolo in un bagno di acqua bollente.

Quindi utilizzare un piccolo pennello per ricoprire la parte inferiore della piastra intorno al foro. Assicurarsi di mescolare la miscela di paraffina e vaselina tra una camera e l'altra, poiché tende a separarsi. Posizionare il vetrino coprioggetto sopra il foro.

Dopo aver preparato tutte le capsule, posizionarle in un forno a 80 gradi Celsius fino a quando la miscela di paraffina non si sarà sciolta. Questo processo richiede circa 10 minuti. Successivamente, rimuovere le capsule e appoggiarle su una superficie piana, lasciando solidificare la miscela di paraffina per almeno un minuto.

Rovesciare le piastre e posizionarle sotto una cappa. Accendere la luce UV per 30 minuti per sterilizzare sia l'interno dei coperchi sia la parte inferiore delle camere. Successivamente rivestire.

Incubare le lamelle della camera con poli-D-lisina per un'ora. Successivamente, risciacquare accuratamente le lamelle rivestite da tre a cinque volte con acqua deionizzata sterile filtrata per rimuovere ogni traccia di buffer borico. Dopo l'ultimo risciacquo, utilizzare un vuoto per asciugare le camere. Queste possono essere utilizzate immediatamente o conservate in una stanza per colture cellulari per un uso successivo.

Le camere rivestite devono essere utilizzate entro una settimana dalla preparazione, se si prevede di allestire colture a lungo termine. Gli strati di cellule gliali corticali da usare come feeder devono essere avviati da due a tre settimane prima di procedere con le dissezioni corticali o ippocampali. Posizionare i cervelli di quattro topi P1-P3 in una piastra contenente mezzo di dissezione freddo e collocarla sotto la lente del microscopio stereoscopico.

Rimuovere i bulbi olfattivi, i due emisferi cerebrali e le meningi. Trasferire gli emisferi in una nuova piastra contenente nessun mezzo. Utilizzando una lama di rasoio sterile e pulita, tritare le cortecce nel modo più fine possibile.

Quindi, con una pipetta di plastica, trasferire il tessuto tritato in un tubo conico da 50 millilitri contenente 12 millilitri di dissection.Medium freddo. Aggiungere tripsina e DNAsi a concentrazioni finali rispettivamente dello 0,25% e dello 0,1%. Incubare in un bagno a 37 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione intermittente.

Dopo l'incubazione, rimuovere il tubo dal bagno termico e pulirlo accuratamente con etanolo al 70% prima di introdurlo nell'incubatrice per colture cellulari. Pipettare il tessuto corticale su e giù.

Con una pipetta da 10 millilitri, aspirare e rilasciare circa 10-15 volte o fino a quando la maggior parte dei frammenti scompare, quindi rimettere il tubo nel bagnomaria per altri 10 minuti con agitazioni intermittenti. Nuovamente, pulire accuratamente il tubo con etanolo al 70% e riportarlo nell'ambiente sterile per colture cellulari.

Pipettare il tessuto corticale su e giù. Come in precedenza, questa volta con una pipetta da cinque millilitri, aggiungere 15 millilitri di mezzo gliale caldo e centrifugare a 1000 giri al minuto per 10 minuti. Scartare il soprannatante e risospendere le cellule pellettizzate in 20 millilitri di mezzo gliale fresco.

Utilizzare un citometro ematico per contare le cellule. Quindi seminare da cinque a 7,5 milioni di cellule in 15 millilitri di mezzo gliale per ogni fiala da 75 centimetri quadrati. Dopo un giorno, posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e ogni due o tre giorni successivi in coltura, staccare le cellule eventualmente rimaste libere battendo la fiala contro la superficie della cappa.

Rimuovere il mezzo insieme a eventuali cellule staccatesi e sostituirlo con 15 millilitri di mezzo gliale fresco. Il mezzo gliale può essere raccolto dopo una o due settimane di crescita nei flaconi, quando sono quasi confluenti al 100%. Per preparare coprioggetti singoli rivestiti di glia, iniziare posizionando sei coprioggetti puliti con acido nitrico e sterilizzati.

25 millimetri di coprioggetti rotondi in una piastra da 10 centimetri e, utilizzando un piccolo pennello, applicare tre gocce della miscela tre a uno di paraffina e vaselina. Su ciascun coprioggetto disponendole in un modello triangolare. Posizionare due gocce sui bordi del coprioggetto per fissarlo alla piastra.

Trattare le piastre aperte con luce UV per 30 minuti. Rivestire i coverslip con poli-D-lisina per un'ora. Quindi lavare accuratamente da tre a cinque volte con acqua deionizzata sterile filtrata e lasciare asciugare, rimuovendo le cellule gliali dall'incubatore.

Scartare il mezzo e lavare con cinque millilitri di tripsina preriscaldata. Aggiungere tre millilitri di tripsina al matraccio e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di mezzo gliale per arrestare l'azione della tripsina.

Rimuovere il GL dal matraccio aspirando e dispensando su e giù da 10 a 15 volte. Successivamente, trasferire il mezzo in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1000 giri al minuto per otto minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo gliale.

Quindi, dopo aver contato le cellule, piastrare cinque volte 10 alla quinta cellule in 12,5 millilitri di mezzo gliale per ogni piastra da 10 centimetri contenente i coverslip. Cambiare il mezzo con mezzo gliale fresco preriscaldato ogni due o tre giorni, il giorno precedente la dissezione dei neuroni. Rimuovere il mezzo gliale e sostituirlo con mezzo privo di siero.

Utilizzare successivamente questo mezzo condizionato da cellule gliali privo di siero. Durante l'afflusso, per colture corticali o ippocampali, viene aggiunta una C a una concentrazione finale di cinque micromolar. Per prevenire la proliferazione gliale dei reagenti per trasfezione indicati nelle istruzioni del produttore, riscaldare quindi la soluzione a temperatura ambiente.

Posizionare una piastra contenente cervelli di topo E 15,5 in un mezzo di dissezione freddo. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un ago di tungsteno piegato per rimuovere entrambe le neocortici. Successivamente, con pinzette fini, rimuovere le meningi e trasferire le cortici in una nuova piastra contenente mezzo di dissezione freddo.

L'ippocampo e la corteccia sono visibili lungo il lato mediale dell'emisfero cerebrale con forbici da iride. Rimuovere con attenzione l'ippocampo. Successivamente, rimuovere la corteccia rimanente.

Ripetere la dissezione sui cervelli provenienti da tutta la nidiata. Posizionare le cortecce dell'ippocampo in provette microcentrifuga separate da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mezzo di dissezione freddo. Mettere le provette sul ghiaccio dopo aver dissezionato tutte le cortecce negli ippocampi.

Aggiungere 110 microlitri di tripsina al 2,5% nei tubi microcentrifuga contenenti il tessuto e posizionare i tubi in un incubatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Utilizzando una pipetta P1000, rimuovere dal tubo la maggior quantità possibile di liquido. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di semina in ciascun tubo e lavare il tessuto capovolgendo delicatamente il tubo microcentrifuga.

Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di mezzo di semina. Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare i frammenti 15 volte. Trasferire quindi il soprannatante e le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo di semina, lasciando nel tubo microcentrifuga eventuali frammenti rimanenti.

Centrifugare il tubo da 15 millilitri a 350 giri al minuto per sette minuti con la frenata disattivata al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e aggiungere 100 microlitri di soluzione per la trasfezione nucleare a temperatura ambiente pre-miscelata. Pipettare su e giù cinque volte per miscelare, quindi trasferire 100 microlitri della soluzione per la trasfezione nucleare e della sospensione cellulare in ciascun nuovo tubo microcentrifuga contenente una quantità appropriata di DNA, da uno a due microgrammi di DNA per trasfezione. Per colture a lungo termine, verranno etichettati meno del 10% dei neuroni nella coltura.

Sebbene da cinque a dieci microgrammi di DNA per trasfezione determinino una maggiore efficienza di trasfezione per la coltura, aggiungere la sospensione cellulare e la miscela di DNA a un vete per elettroporazione. Quindi posizionare il vete nell'elettro. Per i neuroni del sistema nervoso centrale del mouse, impostare il programma del nucleo effettore su oh 0 0 5; lavorando rapidamente, aggiungere 500 microlitri del mezzo di semina preriscaldato ed equilibrato al qve e trasferire la soluzione cellulare in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere un volume sufficiente di mezzo di semina in modo da portare il volume di ciascuna trasfezione a un millilitro. Dopo aver contato le cellule, seminare da tre a cinque volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato per colture giovani, oppure da cinque a dieci volte 10 alla terza cellule per percento di metro quadrato per colture a lungo termine, generalmente cinque volte 10 alla quinta o una volta 10 alla sesta. Le cellule vengono utilizzate per ogni trasfezione per preparare colture a breve termine.

Un'ora dopo la semina, inondare le piastre da coltura da 35 millimetri con due millilitri di mezzo privo di siero, riscaldato e saturato con anidride carbonica. Le camere per imaging determinano un contenuto molto basso di siero, inferiore allo 0,5%. Le colture a breve termine non necessitano di essere coltivate con uno strato di cellule gliali come supporto e non devono essere rigenerati. Per preparare colture a lungo termine, aggiungere un millilitro di mezzo condizionato da cellule gliali al mezzo privo di siero.

Rimuovere un'ampolla coperta con vetro coprioggetto contenente tre gocce di vaselina paraffinica e capovolgerla sopra il foro da 15 millimetri nella piastra da 35. Quindi aggiungere un altro millilitro di mezzo per nutrire le colture a lungo termine. Sostituire un terzo del mezzo privo di siero ogni due o tre giorni.

Dopo cinque a sette giorni di coltura, viene aggiunta citosina Arab IDE o aee a una concentrazione finale di cinque micromolari per prevenire la proliferazione gliale. Le seguenti coppie di immagini di neuroni ippocampali viventi rappresentativi mostrano sia un'immagine a contrasto di interferenza differenziale sia una microfotografia fluorescente corrispondente. Ognuna di queste cellule è stata trasfettata con EGFP, tubulina e DS red due in vettori PA.

Nella fase uno, i neuroni si attaccano inizialmente e, nell'arco di un giorno circa, sviluppano lamellipodi a forma di lamina e filopodi a forma di dita attorno alla periferia del corpo cellulare. Nella fase due, le protrusioni iniziali si differenziano in diversi neuriti che si estendono dal corpo cellulare, rimanendo solitamente di una lunghezza compresa tra 30 e 50 micrometri. Nella fase tre, in modo stocastico, uno dei neuriti inizia ad allungarsi rapidamente per diventare l'assone.

Gli altri neuriti rimangono corti e sono denominati processi minori. La maggior parte dei neuroni ippocampali e corticali progredisce alla fase tre entro due o tre giorni in coltura; durante la fase quattro, che si verifica nell'arco della settimana o delle due settimane successive, i processi minori si ispessiscono, si allungano e si ramificano per diventare i dendriti, mostrati qui in verde. Nel frattempo, l'assone si assottiglia mentre continua a crescere e ramificarsi entro due o tre settimane.

In coltura, i dendriti si differenziano formando spine dendritiche, piccole protuberanze lungo i dendriti. I neuroni allo stadio cinque possono variare per forma e dimensione, ma la maggior parte dovrebbe attraversare questa serie di stadi di sviluppo. I neuroni trasfettati potrebbero non progredire attraverso questi stadi se la sovraespressione di proteine altera lo sviluppo neuronale.

Inoltre, i neuroni potrebbero non progredire attraverso tutte le fasi dello sviluppo. Se le lamelle non vengono pulite correttamente o se la polilisina non aderisce in modo adeguato, le cellule gliali possono proliferare in modo eccessivo, soprattutto se non viene utilizzato un C. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura di due settimane in cui le cellule gliali hanno invaso eccessivamente la coltura nelle colture a lungo termine.

Cambiare il mezzo troppo spesso o non abbastanza spesso può compromettere anche la vitalità dei neuroni. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura in cui la maggior parte dei neuroni è morta e i neuroni rimanenti presentano corpi cellulari ridotti e prolungamenti a perlina. A scopo comparativo, questa è un'immagine a contrasto di fase di neuroni ippocampali sani dopo due settimane di coltura. Si noti la maggiore dimensione dei corpi cellulari e l'assenza di rigonfiamenti a perlina nei prolungamenti.

Inoltre, a questo stadio, i processi dendritici si sono ispessiti e si osserva una fitta rete di processi assonali. Una volta acquisita padronanza, l'esecuzione dell'espianto embrionale, corticale, della dissezione, della trasfezione e della semina dell'intera cucciolata di feti può essere completata in due ore, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i neuroni ippocampali e corticali sono molto sensibili alle sollecitazioni meccaniche.

Inoltre, è importante mantenere le soluzioni il più fredde possibile durante l'isolamento dei neuroni per ridurre al minimo l'attività metabolica. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immagine in tempo reale di cellule vive e la registrazione dell'attività fisiologica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio in che modo le proteine fuse fluorescenti di interesse si distribuiscono in diverse regioni del neurone. Se la localizzazione proteica è associata a modifiche nell'attività sinaptica, o in che modo le funzioni di queste proteine sono influenzate da diversi trattamenti farmacologici.