Name: Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Impara la nucleofezione e la coltura primaria di neuroni ippocampali e corticali embrionali di topo. Questo metodo consente di studiare la crescita assonale, la sinaptogenesi e la plasticità sinaptica con proteine fluorescenti.

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Tutte le procedure sono state approvate dalla University of Wisconsin commissione per cura degli animali ed erano in conformità alle direttive NIH. Ringraziamo il Dott. Katherine Kalil per l&#39;uso generoso del suo dispositivo Nucleofector. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Dent per commenti sul protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-NS064014, Dana Foundation e Whitehall Fondazione EWD Christopher Viesselmann, Jason Ballweg e Derek lombardo contribuito in maniera uguale a questo articolo.

1. Preparazione di Coprivetrini e delle Camere <ol><li> Preparazione del coprioggetto pulito e camere è essenziale per le culture sane. Scorciatoie non dovrebbe essere presa in qualsiasi di questi passaggi. </li><li> Lavare i coprioggetti (rotondo 12 mm o 22 mm, vetro tedesco - Carolina Marca Assistant) pernottamento in acido nitrico concentrato (HNO3) in un vaso di vetro dedicato o bicchiere. </li><li> Togliere i coprioggetti dai acido nitrico e lavare ampiamente (5-7x) in acqua deionizzata. </li><li> Separare il coprioggetto ed asciugare in una cappa a flusso laminare o un armadietto biosicurezza. Una volta asciutta, li sterilizzare con raggi UV per 30 minuti. Luogo sterilizzato coprioggetto in una sterile piatti di Petri per la conservazione. Se i neuroni placcatura su vetrini coprioggetto 12 millimetri direttamente posto in un piatto sterile da 35 mm e passare alla Sezione 2. </li><li> Camere di imaging sono costruite da 15 millimetri perforazione di un foro nella parte inferiore di 35mm piastre Petri (rimuovere tutte le sbavature) e allegando il coprioggetto pulito con una miscela 03:01 di paraffina e di vaselina. </li><li> Fate sciogliere la paraffina / petrolio miscela gelatina in un tubo conico all'interno di un bagno di acqua bollente. Utilizzare un pennello piccolo strato di vernice e la parte inferiore del piatto attorno al foro 15mm. Assicurarsi di mantenere mescolare la paraffina / petrolio miscela gelatinosa come si separeranno. Questo di solito si traduce in camere incollati insieme con una maggiore concentrazione di vaselina, che diventerà viscoso quando i piatti sono posti in incubatrice, con conseguente distacco coprioggetto. La paraffina rimanenti / vaselina può essere conservato a temperatura ambiente. </li><li> Collocare il piatto capovolto su un vassoio piatto e posizionare il vetrino sul foro. Calore nel forno a 80 ° C fino miscela paraffina è sciolto (~ 10 minuti). Rimuovere i piatti su una superficie piana e lasciare che la miscela di paraffina. </li><li> Girare i piatti più e sterilizzare sia l'interno delle copertine e il fondo delle camere con raggi UV. </li><li> Coprioggetto cappotto o regioni bicchiere di camere con 1.0mg/mL Poly-d-lisina (30kDa) in tampone borato (borato di sodio 0,1 M, pH 8,5) per un'ora. Lavare 3-5 volte con abbondante acqua deionizzata di grado coltura dei tessuti. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di tampone borato. Asciutto e utilizzare immediatamente o conservare camere / lamelle per un uso successivo. Noi di solito utilizzare coprioggetto pulito entro un mese dalla preparazione. </li></ol> 2. Preparazione dei Dissection neuronale e medie Cultura <ol><li> Preparare il supporto dissezione (DM) con l'aggiunta di quantità appropriata di HBSS 10x e HEPES 100X all'acqua grado coltura dei tessuti. Conservare a 4 ° C. Tenere sul ghiaccio durante la dissezione. </li><li> Il giorno prima della dissezione preparare la placcatura medio (PM) e mezzo privo di siero (SFM). PM è costituito da medie Neurobasal, B27 supplemento, 2 mM glutammina, 0,3% di glucosio, 37.5 mM NaCl e il 5% di siero fetale bovino (FBS). SFM consiste in Medio Neurobasal, B27 supplemento, 2 mM glutammina, 0,3% di glucosio e del 37,5 mM NaCl. </li><li> Fare solo sufficiente per la dissezione e conservare in una cultura dei tessuti durante la notte con il tappo incubatore leggermente socchiusa in modo che i 2 contenuti temperatura e CO della equilibra mezzo. Aggiungiamo glucosio in più e aumentare la osmolalità a circa 310mOsm con NaCl. Troviamo le culture fare meglio in una osmolalità più fisiologico (osmolalità Neurobasal è tipicamente 205-245mOsm). </li></ol> 3. Gliali strato corticale Preparazione Alimentatore per lungo termine Culture <ol><li> Se a lungo termine le culture devono essere preparati, di eseguire questa parte di due o tre settimane il protocollo prima di continuare con la dissezione corticale o dell'ippocampo. </li><li> Preparare medio gliali (GM) con MEM, 0,3% di glucosio, penicillina / streptomicina e siero di cavallo 10%. </li><li> Euthanize P1-P3 cuccioli di topo da un raffreddamento in ghiaccio per 5 minuti. Rimuovere ogni cucciolo dal ghiaccio e spruzzare con il 70% di etanolo. Velocemente decapitare con le forbici. Rimuovere l'intero cervello di un piatto contenente freddo DM (punto 2.1). </li><li> Rimuovere i due emisferi cerebrali e meningi. Accise la neocorteccia e trasportarlo in un nuovo piatto che contiene alcun supporto. Preparare cortecce da 4 cervelli totale. </li><li> Tritare le cortecce con un panno pulito, lama di rasoio sterile più finemente possibile e rimuovere il tessuto tagliato con una pipetta di plastica per un tubo da 50 ml conica contenente 12 ml di freddo DM. Aggiungere tripsina e DNasi a concentrazioni finali dello 0,25% (1,5 ml) e lo 0,1% (1,5 ml), rispettivamente. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 minuti, rimestando intermittente. </li><li> Rimuovere la provetta contenente il tessuto corticale e pulire accuratamente con etanolo al 70% prima di portare all'interno della cappa coltura di tessuti. Pipettare tessuto corticale su e giù con una pipetta 10 ml circa 10-15 volte, o fino a quando la maggior parte pezzi di scomparire. </li><li> Ritorna il tubo a 37 ° C a bagnomaria per altri 10 minuti con intermittente vorticoso. </li><li> Pulire accuratamente il tubo con il 70% di etanolo e riportarlo alla cappa coltura dei tessuti. Pipettare il tessuto corticale su e giù con un 5 mL pipetta di circa 10-15 volte, o fino a quando i pezzi di scomparire. </li><li> Aggiungere 15 mL di caldo GM e centrifugare a 200xg (1000rpm) per 10 minuti. </li><li> Gettare il surnatante, risospendere le cellule pellet in 20 ml di fresca GM e contare con un emocitometro. Tavola 5-7.5x10 6 celle in 15 ml di GM per 75 centimetri 2 pallone. </li><li> Dopo un giorno e ogni 2-3 giorni successivi in ​​coltura, staccare le cellule allentato battendo il pallone contro la mano. Rimuovere il supporto insieme a tutte le cellule sloggiato e sostituire con 15 ml di fresca GM. </li><li> Glia può essere raccolto dopo 1-2 settimane di crescita in fiaschi, quando sono circa 70-100% confluenti. Per preparare coprioggetto singoli rivestiti con glia, posto 6 acido nitrico puliti e sterilizzati coprioggetto 25 millimetri rotonda in un piatto da 10 cm, e posto 3 punti della miscela 03:01 di paraffina / vaselina su ogni vetrino in uno schema triangolare con un pennello piccolo . Trattare piatti aperti con luce UV per 30 minuti. Rivestire il coprioggetto con 0,1 mg / mL Poly-d-lisina (30kDa) in tampone borato per un'ora, poi lavare ampiamente (3-5x) con acqua sterile grado coltura tissutale deionizzata e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere il gliali contenenti pallone di incubatore, eliminare il medio e sciacquare con 5 ml di pre-riscaldato tripsina / EDTA soluzione. Rimuovere la tripsina / EDTA soluzione dal pallone e Pipettare 3 ml di fresca pre-riscaldato tripsina / EDTA nel pallone. Incubare il pallone per 1 minuto a 37 ° C prima di aggiungere 5 ml di GM per fermare il tripsinizzazione. </li><li> Rimuovere la glia da pallone ripetuto pipettaggio 10-15 volte, e poi trasferire i media ad un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200xg (1000rpm) per 8 minuti. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di GM, le cellule conta, e la piastra di 5x10 5 cellule in 12,5 ml di GM per piatto 10 centimetri contenente i coprioggetti. </li><li> Scambiare il mezzo con fresca preriscaldata GM ogni 2-3 giorni. Il giorno prima della dissezione neurone, rimuovere il GM e sostituirlo con SFM (sezione 2.2). Utilizzare questa gliali condizionata SFM al passo 4,12, quando le inondazioni culture corticale o ippocampale. </li></ol> 4. Dissezione corticale e / o ippocampale ed elettroporazione <ol><li> Rimuovere quantità appropriata di soluzioni nucleofection (Lonza), unire e riscaldare a temperatura ambiente prima di iniziare la dissezione. Dal momento che la soluzione Nucleofection ha una durata limitata se combinati, si limita a combinare l'importo necessario per ogni preparazione (100 microlitri per trasfezione). </li><li> Eutanasia di un mouse incinta E15.5 con CO 2 (giorno della spina è E0.5) e togliere l'utero per una piastra di Petri di 10 cm. Rimuovere i feti e decapitare in freddo DM (paragrafo 2.1). </li><li> Rimuovere l'intero cervello in un piatto separato di freddo DM e con un ago di tungsteno piegato, rimuovere entrambi neocortices. Rimuovere le meningi con microforceps e corteccia posto in nuovo piatto di freddo DM. Con una forbice piccola iris o Wecker, togliere la corteccia e ippocampo e posto in una provetta Eppendorf 1,5 ml riempito con 1,0 mL di freddo DM. Tenere questo provetta in ghiaccio. </li><li> Dopo dissezione tutti cortecce o dell'ippocampo, aggiungere 110 ml di tripsina 2,5% per il tubo Eppendorf contenente il tubo del tessuto e porlo in un incubatore a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare cortecce o dell'ippocampo con 1,0 mL PM (sezione 2.2) delicatamente invertendo il tubo Eppendorf. Ripetere il lavaggio due volte, lasciando 1 mL di PM nel tubo. </li><li> Triturare i pezzi 15 volte con una pipetta P1000, e rimuovere le cellule surnatante / a un nuovo tubo 15 ml contenente 4 ml di PM, lasciando tutti pezzi che rimangono in provetta Eppendorf. </li><li> Spin i 15 ml al tubo 20xg (350rpm) per 7 minuti con il freno. Scartare il surnatante e aggiungere 100 ml di premiscelati, soluzione nucleofection temperatura ambiente (Lonza) per ogni trasfezione. Triturare 5 volte con un delicato movimento su e giù della pipetta P1000. </li><li> Rimuovere 100 l di miscela nucleofection soluzione / cella ad ogni provetta Eppendorf nuovi e aggiungere la giusta quantità di DNA. A lungo termine culture generalmente usiamo 1-2μg di DNA per trasfezione. Tuttavia, questa etichetta solo una piccola percentuale &lt;10% dei neuroni nella cultura. Generalmente usiamo 5-10μg di DNA per trasfezione se vogliamo efficienza di trasfezione superiore per breve termine cultura. Abbiamo usato fino ad un totale di 40μg di DNA quando trasfezione con due plasmidi diversi. I plasmidi sono memorizzati in TE buffer 1μg / mL. </li><li> Aggiungi sospensione cellulare / DNA alla cuvetta (Lonza) e electroporate le cellule del Nucleofector (Lonza), utilizzando il programma di O-005 (SNC topo neuroni). </li><li> Lavorare velocemente, aggiungere 500 microlitri di PM pre-riscaldato ed equilibrato alla cuvetta e rimuovere soluzione / cellule ad un nuovo tubo di 1,5 ml Eppendorf. Aggiungi PM abbastanza per portare il volume di ogni trasfezione a 1,0 ml. Contare le cellule con un emocitometro e piastra a 3-5x10 3 celle / cm 2 per le culture giovani, o 5-10x10 3 celle / cm 2 di lunga durata culture. &lt;/ Li&gt; </li><li> Per le colture a breve termine, inondare la cultura piatti da 35 mm con 2,0 ml di riscaldato, CO 2-SFM equilibrato dopo un'ora di placcatura. Se si utilizza coprioggetto, togliamo la metà del PM e sostituirlo con SFM, quindi ripetere due volte. O le inondazioni delle camere di imaging o lavare i risultati coprioggetto in un bassissimo contenuto di siero (&lt;0,5%). Colture a breve termine non hanno bisogno di essere coltivato con uno strato alimentatore gliale e non hanno bisogno di essere ri-alimentata. </li><li> A lungo termine le culture, togliamo un coprioggetto glia coperto contenente tre puntini di paraffina / vaselina e capovolgere sopra il foro 15 mm di piatto da 35 mm, un'ora dopo placcatura iniziale. Due millilitri del SFM condizionato dal piatto gliali viene quindi aggiunto alla camera di imaging. Per alimentare a lungo termine le culture, togliamo un terzo del SFM ogni 2-3 giorni e sostituirlo con fresco, pre-riscaldata e CO 2-SFM equilibrato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vivere i neuroni dell'ippocampo in fasi successive di sviluppo. Immagini associati di rappresentante vivente neuroni dell'ippocampo sono mostrati sia come immagine contrasto differenziale di interferenza e di un microscopio a fluorescenza corrispondente. Ognuna di queste cellule è stata transfettate con EGFP-tubulina e DsRed2 in vettori pCAX. I neuroni sono stati fotografato nei giorni seguenti in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Fase 2 (1DIV), Stage 3 (2DIV), Stage 4 (11DIV) e Stage 5 (32DIV). Barra di scala è 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo per la coltura embrionali di topo neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia è stato sviluppato come una modifica del protocollo Banker, che utilizza ratto 1,2 neuroni. Abbiamo usato questo protocollo per il mouse coltura e neuroni criceto anche 3,4,5,6,7. Questo protocollo funziona altrettanto bene per entrambi i neuroni dell&#39;ippocampo e neocorticale, è simile ad un protocollo pubblicato da Meberg e Miller 8. In generale, usiamo i neuroni dell&#39;ippocampo a lungo termine cultura, perché sono ben caratterizzati e un sistema modello più affermati. Inoltre, essi possono contenere una popolazione più omogenea di neuroni che neocorteccia. Tuttavia, i neuroni neocorticali colto utilizzando questo protocollo anche sopravvivere e differenziarsi in modo simile (dati non pubblicati). Noi abitualmente uso neuroni dell&#39;ippocampo e neocorticale per breve termine cultura. Dissezione di neocorteccia risultati anche nei neuroni sostanzialmente più (1.5x10 6 neuroni per coppia di cortecce) rispetto alla dissezione dell&#39;ippocampo (2.5x10 5 neuroni per ogni coppia di ippocampo), che lo rende una scelta migliore dei materiali per il Western blotting, per esempio. Come per ogni coltura primaria, è essenziale ridurre al minimo il tempo impiegato dalla morte dell&#39;animale per la placcatura delle cellule. Si assumerà generalmente 10-20 dissezioni per diventare sempre veloce a dissezione e placcatura. Inoltre, quando si lavora con la Nucleofector Lonza, è fondamentale per lavorare velocemente durante la procedura di elettroporazione, in quanto la vitalità dei neuroni decresce rapidamente se sono rimasti nel buffer nucleofection. Gran parte della nostra immagine è condotta con un totale di microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRFM). Questo tipo di microscopia è solo in grado di imaging diverse centinaia di nanometri al di là del coprioggetto. Pertanto, le aree dei neuroni che spesso l&#39;immagine, il cono di crescita assonale e spine dendritiche, devono essere rispettate direttamente al coprioggetto. Quindi, usiamo le culture a bassa densità che richiedono alimentazione gliali a lungo termine cultura. Abbiamo usato le culture più alta densità (&gt; 2x10 4 cellule / cm 2), senza strati alimentatore gliali, a lungo termine le culture e hanno scoperto che sopravvivono molto bene con l&#39;alimentazione poco. Tuttavia, le spine dendritiche di questi neuroni sono spesso troppo lontano dal substrato di immagine in TIRFM, anche se possono essere facilmente rilevato con grande campo microscopia o microscopia confocale. Nella maggior parte dei nostri studi abbiamo trasfezione neuroni prima della placcatura, e hanno ripreso le proteine ​​fluorescenti marcate per un massimo di tre mesi in cultura. Questo a lungo termine espressione di proteine ​​fluorescenti con etichetta ci dà fiducia che utilizzando basse concentrazioni di DNA (1-2μg) non producono artefatti sovraespressione nei neuroni. Tuttavia, questa procedura può essere utilizzata anche per studiare l&#39;iperespressione delle proteine ​​se elevate quantità di DNA siano usati (10-20μg). I plasmidi che usiamo per trasfettare neuroni di solito contengono proteine ​​di fusione EGFP o mCherry, anche se abbiamo anche l&#39;etichetta del citoplasma neuronale con DsRed2 EGFP o da soli. Questa tecnica di elettroporazione funziona bene con un certo numero di vettori. Noi preferiamo plasmidi che contengono un β-actina promotore con un potenziatore CMV e β-globina poli-Una coda (pCAGGs o pCAX plasmidi) 9, a causa dei livelli relativamente alti di espressione, e il fatto che non siano ben tollerate dai neuroni in entrambe le culture a breve e lungo termine. In generale, le proteine ​​cominciano a esprimere entro circa 4 ore di placcatura e raggiungere livelli sufficienti per l&#39;imaging in 10-24 ore 10. Abbiamo utilizzato con successo CMV-promotore-driven plasmidi culture in breve termine, ma hanno scoperto che possono causare alti livelli di iperespressione che uccidono i neuroni a lungo termine cultura. Tuttavia, abbiamo trovato che il condizionamento gliali di culture a bassa densità aiuta con la sopravvivenza dei neuroni transfettate con plasmidi CMV-promotore guidato, rispetto a maggiore densità (non alimentato gliali) culture.

* La maggior parte dei reagenti che conservare a -80 ° C possono essere conservati a -20 ° C pure. La conservazione a -80 ° C allunga la loro durata e dei risultati in culture un po &#39;più consistente.

nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia sono stati ampiamente utilizzati per studiare il sistema nervoso centrale (SNC) polarizzazione neuronale, assone / dendrite escrescenza, e formazione di sinapsi e la funzione. Un vantaggio di coltura di questi neuroni è che essi prontamente polarizzano, formando assoni e dendriti distintivo, su un substrato a due dimensioni a densità molto bassa. Questa proprietà li ha resi estremamente utile per determinare molti aspetti dello sviluppo neuronale. Inoltre, fornendo condizionata gliali di questi neuroni che continuerà a svilupparsi, formando funzionali connessioni sinaptiche e sopravvivere per diversi mesi nella cultura. In questo protocollo abbiamo delineare una tecnica per analizzare, alla cultura e trasfezione embrionali di topo neuroni dell&#39;ippocampo e della corteccia. Transfezione è compiuta electroporating DNA nei neuroni prima della placcatura via nucleofection. Questo protocollo ha il vantaggio di esprimere proteine ​​di fusione fluorescenti-tagged presto nello sviluppo (~ 4-8 ore dopo la placcatura) per studiare la dinamica e la funzione delle proteine ​​durante la polarizzazione, escrescenza assone e la ramificazione. Abbiamo anche scoperto che questo trasfezione singolo prima della placcatura mantiene fluorescenza-tagged espressione della proteina di fusione a livelli adeguati per l&#39;imaging per tutta la durata del neurone (&gt; 2 mesi in cultura). Così, questa metodologia è utile per studiare la localizzazione e funzione delle proteine ​​durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale con interruzioni poca o nessuna funzione neuronale.

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell&#39;ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

I neuroni ippocampali e corticali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la polarizzazione neuronale del sistema nervoso centrale (SNC), la crescita assonale e dendritica e...

I neuroni ippocampali e corticali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la polarizzazione neuronale del sistema nervoso centrale, la crescita assonale e dendritica e la formazione e funzione delle sinapsi. Un vantaggio della coltura di questi neuroni è che si polarizzano facilmente, formando assoni e dendriti distintivi su un substrato bidimensionale a densità molto basse. Questo video illustra una tecnica per dissezionare, coltivare e trasfettare neuroni ippocampali e corticali embrionali di topo mediante nucleofezione, che consente l'espressione di proteine di fusione marcate con fluorocromo fin dalle prime fasi dello sviluppo, approssimativamente quattro-otto ore dopo il seeding. L'espressione delle proteine marcate con fluorocromo viene mantenuta per tutta la vita del neurone, per oltre due mesi in coltura. Ciò permette di studiare la funzione delle proteine durante eventi precoci dello sviluppo, come la crescita dell'assone, e eventi successivi, come la sinaptogenesi e la plasticità sinaptica.Per prima cosa, le cellule gliali vengono isolate dagli emisferi corticali di topi postnatali di età compresa tra uno e tre giorni e seminate in fiasche. Dopo aver raggiunto una confluenza compresa tra il 70 e il 100%, le cellule gliali vengono quindi riseminate su coprivetri di vetro.Quindi, i neuroni ippocampali o corticali vengono isolati da topi E 15,5 e trasfettati mediante nucleofezione con plasmidi codificanti proteine fluorescenti di fusione come la proteina fluorescente rossa. I neuroni trasfettati vengono quindi seminati in camere per imaging per studi a breve termine. Per colture a lungo termine, cellule gliali su coprioggetti di vetro vengono capovolte sopra colture ippocampali o corticali per fornire supporto trofico; singoli neuroni possono quindi essere osservati mediante imaging per mostrare la localizzazione dinamica delle proteine di fusione lungo gli assoni o le dendriti dei neuroni.Ciao, sono Eric Dent, professore assistente di anatomia presso l'Università del Wisconsin di Madison. Oggi, tre dei miei studenti universitari, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard, illustreranno una procedura per l'isolamento, la semina e il mantenimento di colture di neuroni corticali e ippocampali per colture a breve e lungo termine. Queste colture possono essere utilizzate per studiare la dinamica di proteine fluorescenti di fusione durante tutto lo sviluppo neuronale, dalla crescita iniziale dei neuriti fino allo sviluppo di assoni e dendriti e alla sinaptogenesi.Per preparare le camere per l'acquisizione di immagini di neuroni ippocampali e corticali di topo embrionali, iniziare con piastre di Petri da 35 millimetri dotate di fori da 15 millimetri praticati sul fondo, rimuovendo tutte le bave. Sciogliere un miscuglio di paraffina e vaselina in rapporto tre a uno in un tubo conico, ponendolo in un bagno di acqua bollente.Quindi utilizzare un piccolo pennello per ricoprire la parte inferiore della piastra intorno al foro. Assicurarsi di mescolare la miscela di paraffina e vaselina tra una camera e l'altra, poiché tende a separarsi. Posizionare il vetrino coprioggetto sopra il foro.Dopo aver preparato tutte le capsule, posizionarle in un forno a 80 gradi Celsius fino a quando la miscela di paraffina non si sarà sciolta. Questo processo richiede circa 10 minuti. Successivamente, rimuovere le capsule e appoggiarle su una superficie piana, lasciando solidificare la miscela di paraffina per almeno un minuto.Rovesciare le piastre e posizionarle sotto una cappa. Accendere la luce UV per 30 minuti per sterilizzare sia l'interno dei coperchi sia la parte inferiore delle camere. Successivamente rivestire.Incubare le lamelle della camera con poli-D-lisina per un'ora. Successivamente, risciacquare accuratamente le lamelle rivestite da tre a cinque volte con acqua deionizzata sterile filtrata per rimuovere ogni traccia di buffer borico. Dopo l'ultimo risciacquo, utilizzare un vuoto per asciugare le camere. Queste possono essere utilizzate immediatamente o conservate in una stanza per colture cellulari per un uso successivo.Le camere rivestite devono essere utilizzate entro una settimana dalla preparazione, se si prevede di allestire colture a lungo termine. Gli strati di cellule gliali corticali da usare come feeder devono essere avviati da due a tre settimane prima di procedere con le dissezioni corticali o ippocampali. Posizionare i cervelli di quattro topi P1-P3 in una piastra contenente mezzo di dissezione freddo e collocarla sotto la lente del microscopio stereoscopico.Rimuovere i bulbi olfattivi, i due emisferi cerebrali e le meningi. Trasferire gli emisferi in una nuova piastra contenente nessun mezzo. Utilizzando una lama di rasoio sterile e pulita, tritare le cortecce nel modo più fine possibile.Quindi, con una pipetta di plastica, trasferire il tessuto tritato in un tubo conico da 50 millilitri contenente 12 millilitri di dissection.Medium freddo. Aggiungere tripsina e DNAsi a concentrazioni finali rispettivamente dello 0,25% e dello 0,1%. Incubare in un bagno a 37 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione intermittente.Dopo l'incubazione, rimuovere il tubo dal bagno termico e pulirlo accuratamente con etanolo al 70% prima di introdurlo nell'incubatrice per colture cellulari. Pipettare il tessuto corticale su e giù.Con una pipetta da 10 millilitri, aspirare e rilasciare circa 10-15 volte o fino a quando la maggior parte dei frammenti scompare, quindi rimettere il tubo nel bagnomaria per altri 10 minuti con agitazioni intermittenti. Nuovamente, pulire accuratamente il tubo con etanolo al 70% e riportarlo nell'ambiente sterile per colture cellulari.Pipettare il tessuto corticale su e gi&ugrave;. Come in precedenza, questa volta con una pipetta da cinque millilitri, aggiungere 15 millilitri di mezzo gliale caldo e centrifugare a 1000 giri al minuto per 10 minuti. Scartare il soprannatante e risospendere le cellule pellettizzate in 20 millilitri di mezzo gliale fresco.Utilizzare un citometro ematico per contare le cellule. Quindi seminare da cinque a 7,5 milioni di cellule in 15 millilitri di mezzo gliale per ogni fiala da 75 centimetri quadrati. Dopo un giorno, posizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e ogni due o tre giorni successivi in coltura, staccare le cellule eventualmente rimaste libere battendo la fiala contro la superficie della cappa.Rimuovere il mezzo insieme a eventuali cellule staccatesi e sostituirlo con 15 millilitri di mezzo gliale fresco. Il mezzo gliale può essere raccolto dopo una o due settimane di crescita nei flaconi, quando sono quasi confluenti al 100%. Per preparare coprioggetti singoli rivestiti di glia, iniziare posizionando sei coprioggetti puliti con acido nitrico e sterilizzati.25 millimetri di coprioggetti rotondi in una piastra da 10 centimetri e, utilizzando un piccolo pennello, applicare tre gocce della miscela tre a uno di paraffina e vaselina. Su ciascun coprioggetto disponendole in un modello triangolare. Posizionare due gocce sui bordi del coprioggetto per fissarlo alla piastra.Trattare le piastre aperte con luce UV per 30 minuti. Rivestire i coverslip con poli-D-lisina per un'ora. Quindi lavare accuratamente da tre a cinque volte con acqua deionizzata sterile filtrata e lasciare asciugare, rimuovendo le cellule gliali dall'incubatore.Scartare il mezzo e lavare con cinque millilitri di tripsina preriscaldata. Aggiungere tre millilitri di tripsina al matraccio e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di mezzo gliale per arrestare l'azione della tripsina.Rimuovere il GL dal matraccio aspirando e dispensando su e gi&ugrave; da 10 a 15 volte. Successivamente, trasferire il mezzo in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 1000 giri al minuto per otto minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo gliale.Quindi, dopo aver contato le cellule, piastrare cinque volte 10 alla quinta cellule in 12,5 millilitri di mezzo gliale per ogni piastra da 10 centimetri contenente i coverslip. Cambiare il mezzo con mezzo gliale fresco preriscaldato ogni due o tre giorni, il giorno precedente la dissezione dei neuroni. Rimuovere il mezzo gliale e sostituirlo con mezzo privo di siero.Utilizzare successivamente questo mezzo condizionato da cellule gliali privo di siero. Durante l'afflusso, per colture corticali o ippocampali, viene aggiunta una C a una concentrazione finale di cinque micromolar. Per prevenire la proliferazione gliale dei reagenti per trasfezione indicati nelle istruzioni del produttore, riscaldare quindi la soluzione a temperatura ambiente.Posizionare una piastra contenente cervelli di topo E 15,5 in un mezzo di dissezione freddo. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un ago di tungsteno piegato per rimuovere entrambe le neocortici. Successivamente, con pinzette fini, rimuovere le meningi e trasferire le cortici in una nuova piastra contenente mezzo di dissezione freddo.L'ippocampo e la corteccia sono visibili lungo il lato mediale dell'emisfero cerebrale con forbici da iride. Rimuovere con attenzione l'ippocampo. Successivamente, rimuovere la corteccia rimanente.Ripetere la dissezione sui cervelli provenienti da tutta la nidiata. Posizionare le cortecce dell'ippocampo in provette microcentrifuga separate da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mezzo di dissezione freddo. Mettere le provette sul ghiaccio dopo aver dissezionato tutte le cortecce negli ippocampi.Aggiungere 110 microlitri di tripsina al 2,5% nei tubi microcentrifuga contenenti il tessuto e posizionare i tubi in un incubatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Utilizzando una pipetta P1000, rimuovere dal tubo la maggior quantità possibile di liquido. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di semina in ciascun tubo e lavare il tessuto capovolgendo delicatamente il tubo microcentrifuga.Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di mezzo di semina. Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare i frammenti 15 volte. Trasferire quindi il soprannatante e le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo di semina, lasciando nel tubo microcentrifuga eventuali frammenti rimanenti.Centrifugare il tubo da 15 millilitri a 350 giri al minuto per sette minuti con la frenata disattivata al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e aggiungere 100 microlitri di soluzione per la trasfezione nucleare a temperatura ambiente pre-miscelata. Pipettare su e giù cinque volte per miscelare, quindi trasferire 100 microlitri della soluzione per la trasfezione nucleare e della sospensione cellulare in ciascun nuovo tubo microcentrifuga contenente una quantità appropriata di DNA, da uno a due microgrammi di DNA per trasfezione. Per colture a lungo termine, verranno etichettati meno del 10% dei neuroni nella coltura.Sebbene da cinque a dieci microgrammi di DNA per trasfezione determinino una maggiore efficienza di trasfezione per la coltura, aggiungere la sospensione cellulare e la miscela di DNA a un vete per elettroporazione. Quindi posizionare il vete nell'elettro. Per i neuroni del sistema nervoso centrale del mouse, impostare il programma del nucleo effettore su oh 0 0 5; lavorando rapidamente, aggiungere 500 microlitri del mezzo di semina preriscaldato ed equilibrato al qve e trasferire la soluzione cellulare in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.Aggiungere un volume sufficiente di mezzo di semina in modo da portare il volume di ciascuna trasfezione a un millilitro. Dopo aver contato le cellule, seminare da tre a cinque volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato per colture giovani, oppure da cinque a dieci volte 10 alla terza cellule per percento di metro quadrato per colture a lungo termine, generalmente cinque volte 10 alla quinta o una volta 10 alla sesta. Le cellule vengono utilizzate per ogni trasfezione per preparare colture a breve termine.Un'ora dopo la semina, inondare le piastre da coltura da 35 millimetri con due millilitri di mezzo privo di siero, riscaldato e saturato con anidride carbonica. Le camere per imaging determinano un contenuto molto basso di siero, inferiore allo 0,5%. Le colture a breve termine non necessitano di essere coltivate con uno strato di cellule gliali come supporto e non devono essere rigenerati. Per preparare colture a lungo termine, aggiungere un millilitro di mezzo condizionato da cellule gliali al mezzo privo di siero.Rimuovere un'ampolla coperta con vetro coprioggetto contenente tre gocce di vaselina paraffinica e capovolgerla sopra il foro da 15 millimetri nella piastra da 35. Quindi aggiungere un altro millilitro di mezzo per nutrire le colture a lungo termine. Sostituire un terzo del mezzo privo di siero ogni due o tre giorni.Dopo cinque a sette giorni di coltura, viene aggiunta citosina Arab IDE o aee a una concentrazione finale di cinque micromolari per prevenire la proliferazione gliale. Le seguenti coppie di immagini di neuroni ippocampali viventi rappresentativi mostrano sia un'immagine a contrasto di interferenza differenziale sia una microfotografia fluorescente corrispondente. Ognuna di queste cellule è stata trasfettata con EGFP, tubulina e DS red due in vettori PA.Nella fase uno, i neuroni si attaccano inizialmente e, nell'arco di un giorno circa, sviluppano lamellipodi a forma di lamina e filopodi a forma di dita attorno alla periferia del corpo cellulare. Nella fase due, le protrusioni iniziali si differenziano in diversi neuriti che si estendono dal corpo cellulare, rimanendo solitamente di una lunghezza compresa tra 30 e 50 micrometri. Nella fase tre, in modo stocastico, uno dei neuriti inizia ad allungarsi rapidamente per diventare l'assone.Gli altri neuriti rimangono corti e sono denominati processi minori. La maggior parte dei neuroni ippocampali e corticali progredisce alla fase tre entro due o tre giorni in coltura; durante la fase quattro, che si verifica nell'arco della settimana o delle due settimane successive, i processi minori si ispessiscono, si allungano e si ramificano per diventare i dendriti, mostrati qui in verde. Nel frattempo, l'assone si assottiglia mentre continua a crescere e ramificarsi entro due o tre settimane.In coltura, i dendriti si differenziano formando spine dendritiche, piccole protuberanze lungo i dendriti. I neuroni allo stadio cinque possono variare per forma e dimensione, ma la maggior parte dovrebbe attraversare questa serie di stadi di sviluppo. I neuroni trasfettati potrebbero non progredire attraverso questi stadi se la sovraespressione di proteine altera lo sviluppo neuronale.Inoltre, i neuroni potrebbero non progredire attraverso tutte le fasi dello sviluppo. Se le lamelle non vengono pulite correttamente o se la polilisina non aderisce in modo adeguato, le cellule gliali possono proliferare in modo eccessivo, soprattutto se non viene utilizzato un C. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura di due settimane in cui le cellule gliali hanno invaso eccessivamente la coltura nelle colture a lungo termine.Cambiare il mezzo troppo spesso o non abbastanza spesso può compromettere anche la vitalità dei neuroni. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura in cui la maggior parte dei neuroni è morta e i neuroni rimanenti presentano corpi cellulari ridotti e prolungamenti a perlina. A scopo comparativo, questa è un'immagine a contrasto di fase di neuroni ippocampali sani dopo due settimane di coltura. Si noti la maggiore dimensione dei corpi cellulari e l'assenza di rigonfiamenti a perlina nei prolungamenti.Inoltre, a questo stadio, i processi dendritici si sono ispessiti e si osserva una fitta rete di processi assonali. Una volta acquisita padronanza, l'esecuzione dell'espianto embrionale, corticale, della dissezione, della trasfezione e della semina dell'intera cucciolata di feti può essere completata in due ore, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i neuroni ippocampali e corticali sono molto sensibili alle sollecitazioni meccaniche.Inoltre, è importante mantenere le soluzioni il più fredde possibile durante l'isolamento dei neuroni per ridurre al minimo l'attività metabolica. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immagine in tempo reale di cellule vive e la registrazione dell'attività fisiologica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio in che modo le proteine fuse fluorescenti di interesse si distribuiscono in diverse regioni del neurone. Se la localizzazione proteica è associata a modifiche nell'attività sinaptica, o in che modo le funzioni di queste proteine sono influenzate da diversi trattamenti farmacologici.

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