Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

I neuroni ippocampali e corticali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la polarizzazione neuronale del sistema nervoso centrale, la crescita dei dendriti assonici e la formazione e la funzione delle sinapsi, e il vantaggio di coltivare questi neuroni è che si polarizzano facilmente formando assoni e dendriti distintivi su un substrato bidimensionale a densità molto basse. Questo video mostra una tecnica per sezionare la coltura e trasfettare i neuroni embrionali, ippocampali e corticali di topo tramite l'affezione del nucleo, che consente l'espressione di proteine di fusione marcate in fluorescenza all'inizio dello sviluppo circa quattro-otto ore dopo la placcatura L'espressione delle proteine marcate in fluorescenza viene mantenuta per tutta la vita del neurone per più di due mesi in coltura. Ciò consente lo studio della funzione delle proteine durante gli eventi di sviluppo precoci come la crescita degli assoni e gli eventi successivi come la sinaptogenesi e la plasticità sinaptica.

Le prime cellule gliali vengono isolate dagli emisferi corticali del postnatale. Dal primo al terzo giorno il topo si apre e viene impiattato in fiasche. Dopo aver raggiunto una fluenza compresa tra il 70 e il 100%, le cellule gliali vengono quindi ripiagate su vetrini di vetro.

Quindi i neuroni ippocampali o corticali vengono isolati da topi E 15.5 e trasfettati tramite nucleo affettivo con plasmidi che codificano proteine di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente rossa. I neuroni trasfettati vengono quindi piastrati in camere di imaging per studi a breve termine. Per le colture a lungo termine, le cellule gliali su vetrini coprioggetti vengono invertite su colture ippocampali o corticali Per fornire supporto trofico, i singoli neuroni possono quindi essere visualizzati per mostrare la localizzazione dinamica delle proteine di fusione attraverso gli assoni o i dendriti dei neuroni.

Ciao, sono Eric Dent, un assistente professore di anatomia presso l'Università del Wisconsin Madison. Oggi, tre dei miei studenti universitari, Chris Wezelman, Jason Bwe e Derek Lombard stanno per dimostrare una procedura per isolare la placcatura e mantenere colture di neuroni corticali e ippocampali per la coltura a breve e lungo termine. Queste colture possono essere utilizzate per studiare le dinamiche delle proteine di fusione fluorescenti durante lo sviluppo neuronale, dalla crescita iniziale dei neuriti fino allo sviluppo di assoni e dendriti e alla sinaptogenesi.

Per preparare le camere per l'imaging, i neuroni embrionali, ippocampali e corticali di topo. Inizia con piastre di Petri da 35 millimetri con fori da 15 millimetri praticati sul fondo e tutte le frese rimosse. Scioglie una miscela di vaselina di paraffina tre a uno in un tubo conico mettendola in un bagno d'acqua bollente.

Quindi usa un piccolo pennello per rivestire la parte inferiore del piatto attorno al foro. Assicurati di mescolare la miscela di vaselina di paraffina tra le camere poiché si separerà. Posizionare il vetrino coprioggetti sul foro.

Una volta che tutti i piatti sono stati preparati, metterli in un forno a 80 gradi Celsius fino a quando la miscela di paraffina non si sarà sciolta. L'operazione dovrebbe richiedere circa 10 minuti. Quindi rimuovere i piatti su una superficie piana e lasciare solidificare la miscela di paraffina per almeno un minuto.

Capovolgere i piatti e metterli sotto una cappa. Accendere la luce UV per 30 minuti per sterilizzare sia l'interno dei coperchi che il fondo delle camere. Prossima mano.

Il coperchio della camera scivola con poli D luccina per un'ora. Quindi sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetto rivestiti da tre a cinque volte con acqua deionizzata con filtro sterile per rimuovere tutte le tracce di tampone Dopo il risciacquo finale, utilizzare un aspirapolvere per asciugare le camere. Questi possono essere utilizzati immediatamente o conservati in una sala di coltura tissutale per dopo. Usare.

Le camere rivestite devono essere utilizzate entro una settimana dalla preparazione se verranno preparate colture a lungo termine. Gli strati di alimentazione gliale corticale dovranno essere iniziati due o tre settimane prima di continuare con le dissezioni corticali o ippocampali. Posizionare il cervello di quattro pop di topo P uno a P tre in un piatto contenente terreno di dissezione freddo e posizionarlo sotto il cannocchiale da dissezione.

Rimuovere i bulbi olfattivi, i due emisferi cerebrali e le meningi. Trasferire gli emisferi in un nuovo piatto privo di media. Usando una lama di rasoio sterile pulita, tritare le cortecce il più finemente possibile.

Quindi, con una pipetta di plastica, trasferire il tessuto tagliato in una provetta conica da 50 millilitri contenente 12 millilitri di dissezione a freddo. Medio. Aggiungere tripsina e DNA a concentrazioni finali rispettivamente dello 0,25% e dello 0,1%. Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti con roteazione intermittente.

Dopo l'incubazione, rimuovere la provetta dal bagnomaria e pulirla accuratamente con etanolo al 70% prima di inserirla nel fazzoletto. Cappa di cultura. Pipettare il tessuto corticale su e giù.

Con una pipetta da 10 millilitri circa 10-15 volte o fino a quando la maggior parte dei pezzi scompare, rimettere la provetta a bagnomaria per altri 10 minuti con un vortice intermittente. Anche in questo caso, pulire accuratamente il tubo con etanolo al 70% e riportarlo nel tessuto. Cappa di cultura.

Pipettare il tessuto corticale su e giù. Come prima questa volta con una pipetta da cinque millilitri, aggiungere 15 millilitri di gliale calda, medio e centrifugare a 1000 giri/min per 10 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 20 millilitri di terreno gliale fresco.

Usa un emocitometro per contare le cellule. Quindi piastrate da cinque a 7,5 milioni di cellule in 15 millilitri di terreno gliale per pallone quadrato di 75 centimetri. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius dopo un giorno e ogni due o tre giorni successivi in coltura, rimuovere le cellule sciolte sbattendo il pallone contro la superficie della cappa.

Rimuovere il terreno insieme a eventuali cellule staccate e sostituirlo con 15 millilitri di gliale fresca. La glia media può essere raccolta dopo una o due settimane di crescita nei fiaschi, quando sono circa al 100% confluenti. Per preparare i vetrini coprioggetti individuali rivestiti con glia, iniziare posizionando sei acido nitrico puliti e sterilizzati.

Coprivetrini rotondi da 25 millimetri in un piatto da 10 centimetri e usando un piccolo pennello, posizionare tre punti della miscela tre a uno di vaselina di paraffina. Su ogni vetrino coprioggetto in uno schema triangolare. Posizionare due punti sui bordi del vetrino coprioggetto per ancorarlo al piatto.

Trattare i piatti aperti con luce UV per 30 minuti. Rivestire i vetrini coprioggetti con poli-D lisina per un'ora. Quindi lavare abbondantemente da tre a cinque volte con filtro sterile, acqua deionizzata e lasciare asciugare, rimuovere le cellule gliali dall'incubatore.

Scartare il terreno e lavare con cinque millilitri di tripsina preriscaldata. Aggiungere tre millilitri di tripsina al pallone e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno gliale per fermare il trippin.

Rimuovere il GL dal pallone pipettandolo su e giù da 10 a 15 volte. Quindi trasferire il terreno in una centrifuga a provette coniche da 15 millilitri a 1000 giri/min per otto minuti. Dopo la centrifugazione reus, sospendere le cellule in 10 millilitri di terreno gliale.

Quindi, dopo aver contato le cellule, lastra cinque volte 10 fino alla quinta cellula in 12,5 millilitri di terreno gliale per piatto da 10 centimetri contenente i vetrini di copertura. Sostituire il terreno con un terreno gliale preriscaldato fresco ogni due o tre giorni il giorno prima della dissezione neuronale. Rimuovere il terreno gliale e sostituirlo con un terreno privo di siero.

Utilizzare questo terreno libero dal siero per la condizione gliale in un secondo momento. In caso di allagamento, colture corticali o ippocampali, viene aggiunta una C a una concentrazione finale di cinque micromolari. Al fine di prevenire la proliferazione gliale dei reagenti nucleo affection per trasfezione come indicato nelle istruzioni del produttore, riscaldare la soluzione a temperatura ambiente.

Mettere un piatto contenente cervelli di topo E 15.5 in un mezzo di dissezione freddo. Al microscopio da dissezione, utilizzare un ago di tungsteno piegato per rimuovere entrambe le neocorteccia. Quindi, utilizzando una micro pinza, rimuovere le meningi e posizionare le cortecce in una nuova piastra di terreno di dissezione freddo.

L'ippocampo e la corteccia sono visibili lungo il lato mediale dell'emisfero cerebrale con piccole forbici dell'iride. Rimuovere con cautela l'ippocampo. Quindi, rimuovi la corteccia rimanente.

Ripetere la dissezione sul cervello dell'intera cucciolata. Posizionare l'ippopotamo Camp Corteces in microprovette separate da 1,5 millilitri riempite con un millilitro di dissezione fredda. Medio. Mettere i tubi sul ghiaccio Dopo aver sezionato tutte le cortecce in ippopotamo Campi.

Aggiungere 110 microlitri di tripsina al 2,5% alle provette per microfughe contenenti il tessuto e posizionare le provette in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Utilizzando una pipetta P 1000, rimuovere quanto più liquido possibile dalla provetta. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di placcatura a ciascun tubo e lavare il tessuto capovolgendo delicatamente il tubo di microfuga.

Ripetere il lavaggio due volte Dopo il lavaggio finale, aggiungere un millilitro di mezzo di placcatura. Utilizzare una pipetta P 1000 per tri Rateare i pezzi 15 volte. Quindi trasferire il surnatante e le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente quattro millilitri di terreno di placcatura, lasciando i pezzi che rimangono in un tubo per micro fuge.

Centrifugare la provetta da 15 millilitri a 350 giri/min per sette minuti con la pausa dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e aggiungere 100 microlitri di temperatura ambiente premiscelata. Soluzione di affezione del nucleo per ogni pipetta di trasfezione su e giù cinque volte per miscelare il trasferimento successivo. 100 microlitri di soluzione di affezione nucleare e miscela cellulare in ogni nuova provetta per microsfere contenente una quantità appropriata di DNA, uno o due microgrammi di DNA per trasfezione per colture a lungo termine etichetteranno meno del 10% dei neuroni nella coltura.

Mentre da cinque a 10 microgrammi di DNA per trasfezione si tradurranno in una maggiore efficienza di trasfezione per la coltura, aggiungere la sospensione cellulare e la miscela di DNA a un vete di elettroporazione. Quindi posiziona il veterinario nell'elettro. Per i neuroni del SNC di topo, impostare il programma del nucleo effettore su oh 0 0 5 lavorando rapidamente, aggiungere 500 microlitri del mezzo di placcatura prebellico ed equilibrato al qve e trasferire la soluzione cellulare in un nuovo tubo micro fuge da 1,5 millilitri.

Aggiungere una quantità sufficiente di mezzo di placcatura per portare il volume di ogni trasfezione a un millilitro. Dopo aver contato le cellule, la piastra da tre a cinque volte 10 al terzo centimetro quadrato per le colture giovani, o da cinque a 10 volte 10 al terzo cilindro, percentuale di metro quadrato per le colture a lungo termine, generalmente cinque volte 10 al quinto o una volta 10 al sesto. Le cellule vengono utilizzate per trasfezione per preparare colture a breve termine.

Un'ora dopo la piastratura, inondare le piastre di coltura da 35 millimetri con due millilitri di anidride carbonica calda bilanciata e priva di siero. Le camere di imaging producono un contenuto sierico molto basso, inferiore allo 0,5%Le colture a breve termine non devono essere coltivate con uno strato di alimentazione gliale e non devono essere reed. Per preparare colture a lungo termine, aggiungere un millilitro di condizione gliale al terreno privo di siero.

Rimuovere un vetrino coprioggetto coperto da GL contenente tre punti di vaselina di paraffina e capovolgerlo sul foro da 15 millimetri nel piatto 35. Quindi aggiungere un altro millilitro di terreno per alimentare le colture a lungo termine. Sostituire un terzo del terreno privo di siero ogni due o tre giorni.

Dopo cinque-sette giorni di coltura, la citosina Arab IDE o aee viene aggiunta a una concentrazione finale di cinque micromolari per prevenire la proliferazione gliale. Le seguenti immagini accoppiate di neuroni ippocampali viventi rappresentativi mostrano sia un'immagine di contrasto interferenziale differenziale che una corrispondente micrografia fluorescente. Ciascuna di queste cellule è stata trasfettata con EGFP, tubulina e DS red two in vettori PA.

Durante la prima fase, i neuroni si attaccheranno inizialmente e, per un periodo di un giorno o giù di lì, sporgeranno come un foglio e un dito intorno alla periferia del corpo cellulare. Durante la seconda fase, le sporgenze iniziali si differenzieranno in diversi neuriti che emanano dal corpo cellulare, di solito rimanendo di circa 30-50 micron di lunghezza. Durante la terza fase, stocasticamente, uno dei neuriti inizia a estendersi rapidamente fino a diventare l'assone.

Gli altri neuriti rimangono corti e sono chiamati processi minori. La maggior parte dei neuroni ippocampali e corticali è progredita allo stadio tre da due a tre giorni in coltura durante la fase quattro, che si verifica nella settimana successiva o due processi minori, si ispessiscono, si allungano e si ramificano per diventare i dendriti qui, questi sono mostrati in verde. Nel frattempo, l'assone si assottiglia mentre continua a crescere e si ramifica di due o tre settimane.

In coltura, i dendriti si differenziano formando spine dendritiche, piccole protuberanze lungo i dendriti. I neuroni del quinto stadio variano nella loro forma e dimensione, ma la maggior parte dovrebbe sottoporsi a questa serie di fasi di sviluppo. I neuroni trasfettati potrebbero non progredire attraverso queste fasi se la sovraespressione delle proteine interrompe lo sviluppo neuronale.

Inoltre, i neuroni potrebbero non progredire attraverso tutte le fasi dello sviluppo. Se i vetrini coprioggetti non vengono puliti correttamente o la polilisina non aderisce correttamente, anche la glia può proliferare ampiamente, soprattutto se non viene utilizzata una C. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura di due settimane in cui le glia hanno ricoperto la crescita della coltura nelle colture a lungo termine.

Cambiare i media troppo frequentemente o non abbastanza frequentemente può anche compromettere la vitalità dei neuroni. Questa è un'immagine a contrasto di fase di una coltura in cui la maggior parte dei neuroni è morta e i neuroni rimanenti hanno corpi cellulari rimpiccioliti e processi perlati Per confronto, questa è un'immagine a contrasto di fase di neuroni ippocampali sani a due settimane di coltura. Si notino i corpi cellulari più grandi e la mancanza di battitura nei processi.

Inoltre, in questa fase, i processi dendritici si sono ispessiti e c'è un'estesa filigrana di processi assonali. Una volta padroneggiata, l'embrione, la corticale e la dissezione, la trasfezione e la placcatura dell'intera cucciolata di feti possono essere eseguite in due ore se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i neuroni ippocampali e corticali sono molto sensibili alla distruzione meccanica.

Inoltre, è importante mantenere le soluzioni il più fredde possibile durante l'isolamento dei neuroni per mantenere bassa l'attività metabolica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging di cellule vive e la registrazione fisiologica dell'attività per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui le proteine di fusione fluorescenti di interesse si segregano in diverse regioni del neurone. Se la localizzazione delle proteine è associata a cambiamenti nell'attività sinaptica, o come le funzioni di queste proteine sono influenzate da diversi trattamenti farmacologici.