Name: Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri la microdissezione delle ghiandole sericigene del ragno vedova nera per studi molecolari e biochimici. Questo metodo consente l'isolamento rapido e purificato dei sette tipi di ghiandole.

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Questo lavoro è stato supportato da una RUI NSF Concessione MCB-0950372 dal titolo Caratterizzazione molecolare di Sete Ragno Nero Widow.

1. Anestetizzare il ragno e l'isolamento del ventre <ol><li> Trasferire il ragno da un vaso di vetro in una scatola di cartone foderato con plastica (Figura 1A). Noi di solito raccolgono ragni da cataste di legna, garage o cespugli e ospitarli in laboratorio in contenitori di vetro. Perché il ragno non può salire il rivestimento in plastica, fornisce un metodo efficiente per trasferire il ragno da un vaso di vetro o di latta di caffè in una piccola fiala per scopi anestetizzante. Durante la manipolazione del ragno, a questo punto, si dovrebbe indossare due paia di guanti in lattice o guanti da giardinaggio per motivi di sicurezza. </li><li> Mentre il ragno è in cassa foderata con la plastica, l'approccio del ragno dalla sua parte posteriore e lascia la diapositiva ragno nel flaconcino cultura di plastica. Dopo il ragno entra nella fiala, immediatamente posto il tappo sopra la parte superiore (Figura 1B). Si consiglia di utilizzare un flacone che è di circa 101,6 millimetri x 31,75 millimetri (L x P). Questo minimizza la quantità di anidride carbonica necessaria per la fase di anestetizzante. </li><li> Anestetizzare il ragno con l'introduzione di anidride carbonica a 5-10 libbre per pollice quadrato per 10 min (Figura 1C). Questa quantità di gas solo battere il ragno fuori per circa 5 minuti, così dopo anestesia si deve immediatamente procedere ai passaggi 1,4-1,5. </li><li> Posizionare il ragno anestetizzato in un piatto dissezione piccole e utilizzare pinze per posizionare il lato dorsale fino ragno (clessidra rosso rivolto verso il basso). </li><li> Agganciare il pedicello (fusto stretto che collega il cefalotorace e l'addome) per rilasciare l'addome dal resto del ragno (Figura 1D). Conservare il cefalotorace nel congelatore durante la notte in una capsula di Petri e scartare dopo congelato il giorno successivo. Fare attenzione quando si sposta il cefalotorace come le zanne del ragno sono presenti su questo segmento. </li><li> Fissare l'addome al materiale Sylgard nel piatto dissezione piccolo utilizzando un singolo pin di insetti. Inserire il perno degli insetti attraverso il foro fatto dal ritaglio pedicello (figura 1E). Questo può essere facilmente identificata come il luogo in cui il fluido è che emerge dal taglio della pedicello. Assicurarsi che la filiera (estremità opposta del pedicello) è orientata verso il basso (più vicino). </li></ol> 2. La rimozione del esoscheletro <ol><li> Fare la prima incisione attraverso l'esoscheletro usando un paio di microscissors, partendo dal foro dal ritaglio pedicello. Tagliare lateralmente fino a quando il lato dorsale si raggiunge su entrambi i lati (Figura 1F). Usando un paio di pinze, staccare il segmento anteriore esoscheletro e inserire un secondo perno in questa posizione. Dopo l'inserimento del secondo perno, girare il vassoio dissezione caudale (90 ° angolo) dai tagli laterali iniziale e continuare a tagliare fino al raggiungimento filiere (figura 1G). Questa incisione sarà perpendicolare o verticale per il taglio iniziale laterale. Non tagliare le filiere in cui l'incisione verticale è fatto (relativamente posteriori alla clessidra e ha un aspetto circolare). Il mancato inserire il secondo perno si tradurrà in addome filatura quando le incisioni verticali vengono eseguiti. </li><li> Immergere l'addome nella dissezione soluzione tampone (0,1 M cloruro di sodio, citrato di sodio 0,015 M, 0,1% dietilico pirocarbonato). </li><li> Sbucciate l'esoscheletro residua a partire dalla iniziale, incisione laterale. Quando questo è completato, il tessuto adiposo deve essere chiaramente visibile (Figura 1H). </li></ol> 3. Isolamento della seta ghiandole che producono <ol><li> Forcipe utilizzando cominciare prendere in giro via lo strato di grasso (Figura 1H). Il grasso avrà un aspetto biancastro a giallastro. Continuare fino a quando la maggior parte del grasso viene rimosso e le ghiandole della seta sono chiaramente visibili. La ghiandola tubuliform è composto da tre coppie di molto lungo, tubi cilindrici che sono abbondanti nella cavità addominale. Il ampullate principali, che si trova in coppia, è un grande ampolla a forma di mezzaluna con una lunga coda contorti distali e prossimali un condotto che riduce in larghezza che si avvicina filiere del ragno. Il ampullate minori è molto simile nella morfologia del ampullate importanti, ma è significativamente più piccola. La ghiandola flagelliform, si verificano anche in coppia, è rotonda e multilobari con un cilindrico piccolo zig-zag condotto che si estende verso il filiere. La ghiandola aggregato (che si trova in coppia) è un grande, ghiandola multilobari che ha un dotto escretore di grandi dimensioni che ha grandi lobi irregolari su di esso. Le ghiandole aciniforme si verificano in gran numero e assomigliano a breve, proiezioni fingerlike piccoli. La ghiandola piriforme è la più piccola ghiandola nell'addome e ha molte compattato, condotti cilindrica che assomigliano a un ventilatore con molti dotti escretori piccoli che si estendono fino al filiere. </li><li> Si consiglia di rimuovere le ghiandole nel seguente ordine: tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, ampullate minori, aggregati, aciniforme, e poi il piriforme (Figura 2A-B). </li><li> A partire dal tubuliform, prendere in giro queste ghiandole fuori del resto del secologhiandole e - dovrebbero essere seduto sulla cima delle altre ghiandole (Figura 2A). Ci sono tre coppie di ghiandole tubuliform in un ragno singolo. Consentire loro di galleggiare liberamente, ma rimangono attaccati alla loro filiere da loro condotti. </li><li> Poi, via i stuzzicare ghiandole ampullate principali. Ci sono due ghiandole ampullate principali presenti in un ragno. Durante la procedura di rimozione, assicurarsi che i condotti rimangono attaccati alle ghiandole (Figura 2A). </li><li> Continuare a stuzzicare il resto delle ghiandole distanza gli uni dagli altri, lavorando con attenzione per evitare la puntura qualsiasi delle ghiandole, in particolare l'aggregato e delle ghiandole flagelliform. Ogni ghiandola dovrebbe essere libero flottante fino al punto di uscita in esoscheletro al filiere. Queste ghiandole si trovano anche in coppia. Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita. Il ampullate principali, flagelliform, ampullate minori, e le ghiandole aggregati si trovano a coppie. Le ghiandole aciniforme e piriforme si verificano in molte coppie più. </li><li> Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita dalla filiera. Noi di solito archiviare le ghiandole bagnato, tuttavia, non aggiungere ulteriore cuscinetto. </li><li> Come le ghiandole vengono rimossi, mettetele in sterili pre-etichettati tubi da 1,5 ml microcentrifuga. Ghiandole individuale sono indicati nella figura 3A-G. Tenere queste ghiandole sul ghiaccio e poi il flash li congelare in azoto liquido. A seguito di congelamento flash in azoto liquido, deve tenerli a -80 ° C per la conservazione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Durante la rimozione delle ghiandole differenti, la cura estrema dovrebbe essere presa durante la manipolazione del flagelliform e delle ghiandole aggregata, in quanto queste due strutture possono essere facilmente perforati e danneggiato con le pinze. Inoltre, vale la pena notare che morfologicamente le ghiandole flagelliform e aggregati sono molto simili prima della loro rimozione e sono spesso intrecciate tra loro. Per evitare la contaminazione incrociata di questi tessuti dopo la rimozione, il dissettore attentamente prendere in giro queste strutture a parte. Inoltre, dopo l'esposizione iniziale della seta ghiandole che producono, le ghiandole aciniforme piriforme e sarà la più difficile da visualizzare immediatamente a causa della loro dimensione e della localizzazione anatomica. Spesso vi è la presenza di molte uova. Inoltre, la cura supplementare deve essere presa durante la rimozione della ghiandola piriforme, in quanto questo tessuto è estremamente appiccicoso e spesso aderiscono al forcipe. Quando questa procedura viene effettuata correttamente, è possibile ottenere tutte e sette le ghiandole che producono la seta di un ragno solo in un modo altamente purificato. Tipicamente, si può recuperare quantità microgrammi di RNA totale e proteine ​​da una dissezione ragno singolo. Un esempio di utilizzo del RNA totale per qPCR di esaminare i livelli di mRNA di un gene tubuliform limitato fibroina, TuSp1, viene visualizzato (Figura 4). Esperimenti di rappresentanza che coinvolgono proteine ​​lisati raccolti dalle ghiandole ad esempio in soluzione digestione trittico seguito da MS (potrebbe anche essere utilizzato per MS / MS) o un aminoacido analisi composizione in acidi è mostrato (Figura 5-6, rispettivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1e"> Figura 1. Manipolazione, anestetizzante, e la rimozione del esoscheletro dall'addome di un ragno femmina vedova nera. A) Cessione del ragno in una scatola di cartone rivestito in plastica per facilitare lo spostamento il ragno in un flacone di plastica più piccoli. B) Spider inserito in una fiala di plastica con tappo. C) Anestesia il ragno con il gas di anidride carbonica. D) La separazione del cefalotorace con l'addome con microscissors. E) Immobilizzazione dell'addome nel cassetto sezionare con perni di insetti. F) Visualizza dopo una incisione laterale è realizzato con le forbici e una porzione di esoscheletro è sbucciata indietro con le pinze. G) Le incisioni in corso perpendicolare al taglio iniziale laterale. H) La rimozione del esoscheletro e l'esposizione dello strato di grasso. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualizzazione dei sette diverse ghiandole che producono la seta, mentre intatto nell'addome del ragno così come i tessuti circostanti. A) Immagini della tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, aggregare, tessuti ampullate minori con ingrandimento 12X. B) Immagine delle ghiandole aciniforme e piriforme con ingrandimento 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3e"> Fotografie Figura 3. Dei sette seta ghiandole che producono dopo la loro rimozione dall'addome. Tutte le immagini sono state catturate a 20X di ingrandimento, con l'eccezione del aciniforme e ghiandole piriforme, che sono stati fatti a 40X. A) maggioreampullate ghiandola; B) ampullate maggiori e minori (lato destro) per la valutazione del peso; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregato, F) aciniforme; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> I risultati rappresentativi figura 4. Dei pattern di espressione del gene di seta, TuSp1, dopo i rilievi TuSp1 livelli di mRNA nelle diverse ghiandole che producono la seta (esclusa la ghiandola piriforme) utilizzando quantitativa real-time PCR (qPCR) isolamento successivo di RNA totale da le ghiandole. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Esempio di analisi MS di estratti proteici ottenuti dalla ghiandola piriforme seguenti soluzione digestione trittico. Nota: x2 rappresenta 2 volte ingrandimento di intensità dello spettro. Spettro masse di ioni peptide che corrispondono alle regioni del fibroina PySp1 sono indicati con il simbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Risultato tipico del profilo di composizione amino acidi delle proteine ​​estratte dalla ghiandola tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Colorazione blu riflette aminoacidi con gruppi polari catena laterale, mentre la colorazione rossa rappresenta residui di aminoacidi con gruppi laterali non polari a catena.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La nostra metodologia per la microdissezione della seta ghiandole che producono dalla vedova nera offre un mezzo efficace per ottenere altamente purificato seta ghiandole che producono. Dissezioni può essere completato in 1,5 a 3 ore, producendo un set completo di sette distinte seta ghiandole che producono da cobweavers. Ottenere altamente purificato seta ghiandola campioni consente agli investigatori la possibilità di eseguire una vasta gamma di studi biochimici, inclusa l&#39;identificazione di seta o di nuove protei...

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0,1 M in acqua</td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0,1% v/v</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0,015 M in acqua</td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera digitale per microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Forbici di Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette in acciaio inossidabile</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Spilli per insetti</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Spilli per insetti #2</td></tr><tr><td>Piatti di dissezione piccoli o grandi</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S o DD-90-S</td><td>52 mm di diametro x 18 mm H (profondità Sylgard ~6 mm) o 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; provette per colture</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Dimensione: 31,75 mm di diametro x 101,6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissezione di black widow spider silk ghiandole che producono

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Ragni moderni rotazione ad alte prestazioni fibre di seta con una vasta gamma di funzioni biologiche, compresa la cattura delle prede locomozione, lo sviluppo e la protezione di 1,2 figli. Ragni eseguire queste operazioni da diversi tipi di filatura di fibre distinte che hanno diverse proprietà meccaniche. Specializzazione di tale tipi di fibre si è verificato attraverso l&#39;evoluzione delle diverse ghiandole che producono la seta, che funzionano come biofabbriche di piccole dimensioni. Queste produzione biofabbriche e archiviare grandi quantità di proteine ​​della seta alla produzione di fibre. Attraverso una complessa serie di eventi biochimici, queste proteine ​​della seta vengono convertite da un liquido in un materiale solido su di estrusione. Gli studi hanno dimostrato che la meccanica seta di ragno sono più forti di acciaio ad alta resistenza 3. Le analisi per comprendere la relazione tra la struttura e la funzione di fili di seta di ragno hanno rivelato che la seta di ragno è costituito in gran parte delle proteine, o fibroins, che hanno ripete blocco all&#39;interno del loro sequenze di proteine ​​4. Comune firme molecolari che contribuiscono alla resistenza alla trazione incredibile e l&#39;estensibilità di seta di ragno vengono svelati attraverso l&#39;analisi di cDNA seta tradotte. Date le straordinarie proprietà del materiale di ragno sete, laboratori di ricerca in tutto il mondo fanno a gara per capire e simulare il processo di filatura per la produzione di fibre di seta sintetica per applicazioni commerciali, industriali e militari. Una delle sfide principali di filatura della seta artificiale ragno in laboratorio di ricerca comporta una completa comprensione dei processi biochimici che si verificano durante l&#39;estrusione di fibre della seta ghiandole che producono. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento di sette diverse ghiandole che producono la seta dal ragno cobweaving vedova nera, che include le ghiandole ampullate maggiori e minori [produce seta dragline e ponteggi] 5,6, tubuliform [seta uovo sintetizza caso] 7 , 8, flagelliform [funzione sconosciuta in pannocchia-tessitori], aggregato [rende seta colla], aciniforme [preda sintetizza il confezionamento e le discussioni caso uovo] 9 e piriforme [attaccamento produce seta disco] 10. Questo approccio si basa su anestetizzare il ragno con il gas di anidride carbonica, successiva separazione del cefalotorace con l&#39;addome, e microdissezione del ventre per ottenere le ghiandole che producono la seta. Dopo la separazione dei diversi seta ghiandole che producono, questi tessuti possono essere utilizzati per recuperare le macromolecole diverse per distinte analisi biochimiche, tra cui quantitativa real-time PCR, nel nord-ovest e assorbente, la spettrometria di massa (MS o MS / MS), analisi per identificare nuove sequenze di proteine ​​della seta, ricerca per le proteine ​​che partecipano al percorso di assemblaggio di seta, o utilizzare il tessuto intatto per colture cellulari o esperimenti istologici.

Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l&#39;addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l&#39;isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l&#39;assemblaggio delle fibre.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

I ragni moderni filano fibre di seta ad alte prestazioni con un'ampia gamma di funzioni biologiche, tra cui la locomozione, la cattura delle prede e la protezione di...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le sette ghiandole distinte produttrici di seta dall'addome del ragno e utilizzare questi tessuti per studi molecolari e biochimici. Ciò viene ottenuto anestetizzando innanzitutto il ragno. Il secondo passaggio della procedura consiste nel separare la parte cefalica, il torace e l'addome, quindi fissare l'addome con spilli entomologici in una piccola bacinella per dissezione.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'effettuare incisioni nell'esoscheletro per esporre le ghiandole produttrici di seta. L'ultimo passaggio della procedura è la rimozione delle diverse ghiandole produttrici di seta. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le diverse ghiandole produttrici di seta esprimano mRNA o proteine di seta distinti mediante approcci molecolari e biochimici, come la PCR quantitativa in tempo reale o la spettrometria di massa, rispettivamente.Questo metodo fornirà informazioni fondamentali per la ricerca sulla biologia dei ragni, rivelando le proteine immagazzinate nelle ghiandole produttrici di seta. Queste proteine hanno applicazioni nel settore militare e medico, oltre a numerose applicazioni commerciali e industriali. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di condurre questo studio specifico quando abbiamo avuto la necessità di approfondire la conoscenza delle proteine contenute nelle ghiandole produttrici di seta.Il vantaggio principale di questa tecnica è che le ragni femmine della vedova nera hanno addomi molto grandi, il che rende molto semplice isolare le ghiandole produttrici della seta. Gli individui alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché spesso le ghiandole si rompono durante la dissezione. Inoltre, alcune strutture anatomiche sono difficili da isolare.La dimostrazione visiva è fondamentale per una buona dissezione. La procedura sarà dimostrata da Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame e Y Shaw prima dell'inizio della dissezione. Preparare 500 millilitri di soluzione tampone per dissezione composta da cloruro di sodio 0,1 molare, citrato di sodio 0,015 molare e bicarbonato etilico 0,1%.Preparare quindi una scatola di cartone con rivestimento in plastica per contenere il ragno e impedirgli di uscire strisciando. Di solito otteniamo ragni vedova nera da cataste di legna, capannoni o garage, e utilizziamo barattoli di vetro per ospitarli in laboratorio. Una volta ottenuto, trasferire il ragno da un barattolo di vetro alla scatola, maneggiandolo con cura.Indossare due paia di guanti in lattice o da giardinaggio per motivi di sicurezza. Quindi, utilizzando una piccola provetta di plastica per colture, avvicinarsi al ragno da dietro e far scivolare il ragno all'interno della provetta, chiudendola immediatamente. Introdurre gas di anidride carbonica nella provetta a una pressione compresa tra 5 e 10 PSI per 10 minuti per anestetizzare il ragno; la dissezione iniziale dell'addome dalla teca cefalica deve essere eseguita entro cinque minuti, mentre il ragno è ancora sotto anestesia.Posizionare il ragno anestetizzato in una piccola bacinella per dissezione. Recidere il peduncolo, l'istmo stretto, che collega il cefalotorace all'addome per staccare l'addome. Il cefalotorace contiene le cheliceri del ragno e richiede un'idonea eliminazione.Rimuovere con attenzione il tórace cefalico posizionato in una capsula di Petri e congelarlo durante la notte. Prima di smaltirlo, individuare il foro nell'addome del ragno prodotto dal prelievo della cellula peduncolare identificando il punto da cui fuoriesce del liquido. Utilizzando un singolo ago da dissezione, inserire l'ago attraverso il foro e nell'addome per fissare l'addome al vassoio di dissezione, orientando il ragno in modo che il peduncolo sia il più lontano possibile dal dissecatore e la parte spinosa sia la più vicina al dissecatore.Utilizzando un paio di forbici microchirurgiche, iniziare dal foro lasciato dal distacco della cellula pedale e tagliare lateralmente su ciascun lato attraverso l'esoscheletro fino a raggiungere il lato dorsale. Con l'aiuto di una pinzetta, sollevare il segmento anteriore dell'esoscheletro ed inserire un secondo perno in questa posizione. Successivamente, ruotare il vassoio di dissezione di 90 gradi rispetto ai tagli laterali iniziali.Continuare a tagliare fino a raggiungere gli spints. L'incisione sarà perpendicolare o verticale rispetto al taglio laterale iniziale. Gli spints si trovano al di sotto della forma a clessidra e hanno un aspetto circolare.Non tagliare gli apodemi durante l'incisione verticale. Immergere l'addome nella soluzione tampone per dissezione. Staccare il resto dell'esoscheletro a partire dall'incisione laterale iniziale. Al termine di questa operazione, il tessuto adiposo, di aspetto biancastro fino a giallastro, dovrebbe essere chiaramente visibile utilizzando una pinzetta. Iniziare a separare delicatamente lo strato di grasso finché la maggior parte del tessuto adiposo non viene rimossa e le ghiandole sericigene risultino chiaramente visibili. Se presenti, le uova devono essere rimosse.A questo punto, dissezionare le ghiandole nel seguente ordine: forma tubulare, forma dei flagelli delle ghiandole accessorie maggiori, aggregato delle ghiandole accessorie minori, forma e poi la forma piriforme. Descriveremo ciascuna ghiandola nell'ordine di dissezione.Le ghiandole di forma tubulare si trovano al di sopra di tutte le altre ghiandole e presentano tre paia di lunghi tubi cilindrici molto sviluppati nella cavità addominale. Separare con attenzione queste ghiandole dal resto delle ghiandole. Lasciarle galleggiare liberamente, ma rimanere attaccate ai filatoi rossi attraverso i loro dotti.Successivamente, isolare le due ghiandole ampollari principali presenti anche nelle pere. Queste ghiandole sono di grandi dimensioni e a forma di mezzaluna, con lunghi e tortuosi prolungamenti distali e dotti prossimali che diminuiscono in larghezza. Quando si raggiungono gli spunzoni del ragno, rimuovere le ghiandole ampollari principali e collocarle in provette sterili da 1,5 millilitri per microcentrifuga.Posizionare le ghiandole sul ghiaccio dopo il loro prelievo. Successivamente, rimuovere la ghiandola flagellare. La ghiandola flagellare è presente anche sotto forma di pera.Presenta una struttura multilobulata con un piccolo dotto cilindrico a zigzag che si estende verso il basso fino agli spuntoni; dopo il loro prelievo, questi vengono posti sul ghiaccio. Successivamente, l'alveolo minore risulta molto simile nell'aspetto morfologico all'alveolo maggiore, ma significativamente più piccolo. La ghiandola aggregata, presente in coppia, è grande e multilobulata, e possiede un dotto escretore molto ampio con lobi grandi e irregolari.Le ghiandole sino formm sono presenti in gran numero e assomigliano a brevi protuberanze simili a piccole dita. La ghiandola piriforme è la più piccola ghiandola dell'addome e presenta numerosi dotti cilindrici compatti che assomigliano a un ventaglio, con molti piccoli dotti escretori che si estendono fino agli spints. Ora che la ghiandola tubulare formm è l'unica ghiandola rimasta libera, rimuoverla pizzicando il dotto con una pinzetta ed estraendola con attenzione fino a quando si stacca dal punto di uscita vicino allo spint. Dopo la dissezione, congelare rapidamente tutte le ghiandole dissecate immergendo il tubo in azoto liquido fino a quando non si solidifica, quindi conservarle a meno 80 gradi Celsius per il successivo stoccaggio.In alternativa, le ghiandole possono essere congelate immediatamente dopo essere state asportate singolarmente durante la procedura di dissezione. Questa figura mostra l'isolamento del gene della seta, dei livelli di mRNA di TUSP one nelle diverse ghiandole produttrici di seta, escludendo la ghiandola piriforme, mediante analisi di PCR quantitativa in tempo reale dopo l'isolamento dell'RNA totale dalle ghiandole. Le ghiandole di forma tubulare contengono la maggiore abbondanza di mRNA di TUSP one.Questa figura mostra un risultato tipico del profilo di composizione degli aminoacidi delle proteine estratte dalla ghiandola tubulare. La colorazione blu indica aminoacidi con gruppi laterali polari, mentre la colorazione rossa rappresenta residui di aminoacidi con gruppi laterali apolari. Questa figura presenta l'analisi mediante spettrometria di massa di estratti proteici ottenuti dalla ghiandola piriforme a seguito della triade di insolubilizzazione.La digestione qui indicata con "times two" rappresenta un'ingrandimento bidimensionale dell'intensità dello spettro. Le masse degli ioni peptidici nello spettro contrassegnate con il simbolo # indicano peptidi derivati dalla fibroina della seta PYSP1 dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori della comunità scientifica della biologia del bagno.È stato utilizzato per esplorare i processi chimici e molecolari coinvolti nella produzione della fibra di bagno, nell'assemblaggio della fibra di seta e nell'estruzione. Se questa tecnica viene eseguita correttamente, può essere completata da un'ora e mezza a tre ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante indossare due paia di guanti fino a quando le zanne del ragno non vengono rimosse.Alla fine di questo metodo, le ghiandole produttrici di seta possono essere utilizzate per estrarre RNA e proteine. Questi materiali possono essere impiegati in applicazioni successive, come la PCR quantitativa in tempo reale, nonché la spettrometria di massa. Le informazioni ottenute da questi studi ci aiuteranno a comprendere meglio il processo di assemblaggio della seta e il percorso di estrusione della seta.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le sette distinte ghiandole produttrici di seta dalla ragno vedova nera femmina.

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Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Le ghiandole vegetali sono strutture specializzate responsabili della biosintesi e della secrezione di molti composti coinvolti nelle interazioni con l'ambiente biotico. Per consentire lo studio delle loro caratteristiche molecolari e biochimiche, è stata messa a punto una tecnica di micropreparazione meccanica per isolare singole ghiandole metabolicamente attive, qui dalla pianta carnivora Nepenthes.

Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Un protocollo per la filatura di microfluidica e caratterizzazione di microstruttura di monofilamento rigenerata seta fibroin è presentato.

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Dimensione di acinus ghiandole ipofaringee è una misura robusta di nutrizione di ape miele infermiera. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per dissezione, colorazione, imaging e misurazione dei acini infermiera ape hypopharyngeal ghiandola.

Formato di Acinus ghiandola Hypopharyngeal misurazione in lavoratori ape del miele (mellifera di Apis)

Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

La ghiandola salivare della zanzara adulta (SG) è necessaria per la trasmissione di tutti gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare ai loro ospiti umani, inclusi virus e parassiti. Questo video dimostra l'efficiente isolamento degli SG dalle zanzare Anopheles gambiae allo stadio larvale (L4) e la preparazione degli SG L4 per ulteriori analisi.

Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae

Scopri la microdissezione delle ghiandole sericigene del ragno vedova nera per studi molecolari e biochimici. Questo metodo consente l'isolamento rapido e purificato dei sette tipi di ghiandole.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

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