Name: Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: Impara a configurare un sistema di cellule di flusso per lo studio di biofilm microbici con microscopia confocale. Questo protocollo dettagliato mostra l'assemblaggio, la sterilizzazione e l'analisi di Pseudomonas aeruginosa e Saccharomyces cerevisiae.

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1. Assemblea del Cell System flusso con tutti i componenti Il sistema a flusso assemblato comprende: tubi autoclavabile, trappole bolla, medio / scarto e celle di flusso, come mostrato nella Figura 1. Tutte queste parti possono essere riutilizzate tra esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La cella di configurazione del flusso di sistema (componenti essenziali del setup). Il sistema di cella di flusso è composto da diversi componenti: una bottiglia di media, una pompa peristaltica, trappole bolla, la cella di flusso, una bottiglia di rifiuti, e diverse sezioni di tubi collegati tra loro da vari connettori. Figura gentilmente fornito da Rune Lyngklip. 2. Assemblea della cella di flusso <ol><li> La cella di flusso (Figura 2a) è trattata con corsie sottile di colla di silicone, con una siringa (Figura 3). </li><li> Inserire una copertura antiscivolo sulla parte superiore delle linee di silicone (Figura 3). Scivola copertura in vetro vengono utilizzati come substrato per P. aeruginosa, mentre scivola copertura in PVC vengono applicate per S. Saccharomyces biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schema di cella a flusso e gorgogliatore 2. Descrizione dettagliata delle dimensioni utilizzate per la produzione di: a) flusso bolla trappola cellulare b), DTU Systems Biology. Ristampato con il permesso di John Wiley &amp; Sons, Inc. (DTU Systems Biology era precedentemente intitolato Biocentrum, come illustrato in figura) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Illustrazione delle linee di silicone applicazione della colla per il montaggio del substrato di vetro. Il vetro di copertura indicata è posizionato sopra la colla siliconica per fissarlo alla cella di flusso. <ol start="3"><li> Girare la cella di flusso e posizionarlo su una superficie piana con il lato antiscivolo coperchio verso il basso. Premere delicatamente sulla parte posteriore della cella di flusso per spingere la polizza di copertura sulla base della cella di flusso. Girare la cella di flusso più e per ispezionare le zone che non sono sigillate dal silicone. L'(pistone) gestire parte di una siringa può essere utilizzato come uno strumento per premere delicatamente la cella di vetro e il flusso insieme. </li></ol> 3. Bottiglia di media <ol><li> Posizionare un tubo in silicone alimentare (2 mm di diametro interno) in una bottiglia di medie e inserire un connettore dritto all'altra estremità. </li><li> Aggiungi medio della bottiglia (per il contenuto medio vedi paragrafo "media") Coperchio del connettore e bottiglia con un foglio di metallo e autoclave del mezzo. Assicurarsi che l'estremità del tubo di alimentazione è fisso al di sopra del livello del liquido nella bottiglia medio o un effetto sifone può svuotare la bottiglia di media quando autoclave. </li></ol> 4. Collegamento del gorgogliatore, cella di flusso e Pompa Montare tutti i tubi secondo lo schema in Figura 1. Utilizza tubi al silicone, tranne per la parte che passa attraverso la pompa peristaltica in cui viene applicato tubi Marprene. <ol><li> Al fine di collegare il tubo dalla bottiglia medio-tutte le camere flusso individuali, dividere un tubo nel numero di ingressi applicati durante l'esperimento. Utilizzare connettori a T per rendere il numero auspicabile di tubi di collegamento dal tubo di alimentazione per i tubi Marprene nella pompa (vedi Figura 1, connettore a T). E 'generalmente una buona idea per mantenere lo stesso ordine sequenza di tubi e celle di flusso in tutto il sistema, per facilitare l'identificazione dei componenti in caso di guasti nel sistema. </li><li> Collegare ogni singolo tubo di alimentazione (2 mm di diametro) a Marprene tubi nella pompa utilizzando connettori diritti. Collegare il tubo Marprene ad un gorgogliatore (Figura 2b) tramite un tubo in silicone intermedio (1 mm di diametro). Assicurarsi che la pompa è collegata all'ingresso nella parte più alta del gorgogliatore. </li><li> Collegare il tubo di uscita risultante delle trappole bolla per l'ingresso cella di flusso (1 mm di diametro), assicurarsi che la lunghezza di questi tubi permette la cella di flusso per essere trasferito alla fase del microscopio confocale (in genere 1 m). </li><li> Mettere 5 ml siringhe in cima alla trappole bolla. Chiudere la parte superiore con tappi idonei. </li><li> Sulla presa di cella di flusso collegare un breve, circa 40 pezzi mm (1 mm di diametro), tubi e utilizzare una "riduzione" connettore dritto per collegare un tubo di scarico (2 mm di diametro) della lunghezza necessaria. Posizionare i tubi dei rifiuti nel contenitore dei rifiuti. </li><li> È importante sottolineare che il contenitore dei rifiuti deve essere sempre posizionato allo stesso livello come le cellule di flusso, mai al di sotto del flusso delle cellule livello. Inoltre, assicurarsi che la fine del tubo di scarico è fissato al di sopra del livello previsto di rifiuti liquidi per evitare la filo-back a causa di un effetto sifone quando si maneggiano le celle di flusso. </li></ol> 5. STERILIZZAZIONE E LAVAGGIO DEL SISTEMA DI FLUSSO <ol><li> Togliere i tappi gorgogliatore e metterli in etanolo al 70% per tenerli sterili. </li><li> Marcia a velocità massima della pompa per riempire il sistema con il 0,5% (v / v) di ipoclorito di sodio in acqua. &lt;/ Li&gt; </li><li> Posizionare i tappi bolla trappola indietro quando la bolla trappole sono completamente riempiti. </li><li> Toccare il flusso di cellule per rimuovere le bolle nella camera di flusso. Fare attenzione a non danneggiare il vetro fragile coperchio. </li><li> Consentono al sistema di sterilizzare per 3-4 ore ad un flusso di 3 ml / h / canale (portata 0,2 mm / s lineare). </li><li> Lavare il sistema 2-3 volte a lavare tutte le ipoclorito. Riempire e svuotare l'impianto con acqua sterile. Trappole bolla deve essere svuotato completamente tra ogni lavaggio. Questo può essere fatto mediante pompaggio in aria fino trappole bolla sono stati svuotati. Dopo lo svuotamento, togliere i tappi dalle trappole bolla prima di ricaricare il sistema. Rimettere i tappi dopo la bolla trappole sono state completamente riempita di liquido. Ripetere se necessario. </li><li> Esegui acqua sterile attraverso il sistema con un flusso basso (1-3 ml / h / canale) durante la notte o passare alla fase successiva. </li><li> Collegare la bombola di medie e di aspirazione e lavare il sistema con il mezzo durante la notte a bassa portata (3 ml / h / canale) alla temperatura in cui l'esperimento verrà eseguito. Nota: le trappole bolla deve essere svuotato per l'acqua prima che il sistema è pieno di media. </li></ol> 6. SEMINA DEL la cella di flusso <ol><li> Da un giorno all'altro cultura fare una diluizione di una densità ottico desiderato (per esempio, P. aeruginosa 0,001 OD 600 nm e 0,1 OD 600nm per S. cerevisiae). </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare inoculo sufficiente a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere di flusso che presentano le dimensioni specificate nel presente lavoro (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Morsetto fuori il tubo di silicone che porta alla cella di flusso per impedire il riflusso nel sistema. </li><li> Sterilizzare l'inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Inserire l'ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente l'inoculo nella camera (attenzione a non iniettare bolle d'aria). </li><li> Rimuovere l'ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da immediata sigillatura del foro con colla siliconica sul sito di iniezione. </li><li> Capovolgere la cella a flusso e lasciare che i microrganismi aderiscono al substrato per 1 ora senza che il flusso attraverso la cella di flusso. </li><li> Girare la cella di flusso, avviare la pompa di media (3 ml / h / canale) e prendere la pinza dal tubo di silicone. </li><li> Il sistema è posto per l'incubazione, a 37 ° C nel caso di P. aeruginosa e 30 ° C nel caso di S. cerevisiae. </li><li> Biofilm nelle camere a flusso possono ora essere visualizzati da CLSM. </li></ol> 7. COLORAZIONE di biofilm per la microscopia <ol><li> Fai una diluizione della colorazione appropriata (ad esempio 1:1000 Syto 9 vivere macchia di S. cerevisiae) </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Fascetta del tubo di silicone che porta alla cella a flusso. </li><li> Sterilizzare inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare soluzione abbastanza colorazione a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere flusso usato qui. </li><li> Inserire l'ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente la soluzione colorante nella camera (attenzione a non iniettare bolle). </li><li> Rimuovere l'ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da sigillatura immediata del sito di iniezione. </li><li> Lasciare la cella di flusso senza flusso per 15 minuti. </li><li> Togliere il morsetto e avviare il flusso (3 ml / h / canale) </li><li> Acquisire dati con il CLSM </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo dimostrato un sistema a celle di flusso che rappresenta un potente strumento nelle indagini biofilm. In combinazione con immagini 3D con la microscopia confocale, il sistema ha una gamma di vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi dei biofilm microbici mediante tecniche microscopiche più tradizionali. Questo sistema permette la visualizzazione in 3D di comunità vive biofilm microbico senza disturbo della comunità. Microscopia ottica non fornirà informazioni dettagliate sulle nicchie del biofilm e, mentre la microscopia elettronica fornisce una risoluzione nanometrica del biofilm, non permette l'imaging dal vivo delle cellule. Utilizzando il sistema descritto canale di flusso abbiamo già chiarito la distribuzione spaziale delle cellule batteriche sensibili ai diversi antibiotici 5-8 (Figura 4a), la distribuzione dei composti extracellulari, come ad esempio il DNA 9-11 e la distribuzione di cellule mobili e non mobili di la stessa specie all'interno di una comunità batterica 4,6,9 (Figura 4c). Prevediamo che il sistema di cella di flusso possono essere utilizzati per studiare gli aspetti di biofilm lievito. Questa potrebbe essere la distribuzione spazio temporale dei biofilm lievito in risposta a fattori ambientali come fungicidi così come l'identificazione di geni coinvolti nello sviluppo di lievito biofilm. Anche se il lievito non è noto a differenziarsi in cellule mobili e non mobili, altri aspetti di diversificazione biofilm possono essere studi come il cambiamento morfologico dal lievito alle cellule pseudohyphal e il passaggio da aploide a cellule diploidi. Abbiamo dimostrato un sistema che rispettano diverse specie microbiche e lavorerà con tecniche di colorazione diverse. Una varietà di sonde di colorazione diversa e proteine ​​fluorescenti, come GFP, consentono indagini specifica nicchia nel biofilm di sviluppo ed è uno strumento efficace per analizzare l'effetto degli agenti antimicrobici o di altri fattori ambientali. Le informazioni che si possono ottenere è molto dettagliata (Figura 4) e le caratteristiche nel biofilm può essere quantificato con programmi per computer come COMSTAT 12,13. Nel complesso, l'aspetto più critico del protocollo è il fatto che si tratta di un processo che richiede tempo. E 'anche una limitazione che le cellule devono essere in grado di crescere in modo non fluorescente, superficie trasparente. . Dato che il biofilm formato viene analizzato con un microscopio confocale, la profondità che può essere indagato è limitata a qualche centinaio di micrometri 14 Ci sono ulteriori limitazioni tecniche inerenti alla progettazione: il sistema non è adatto per screening ad alto rendimento, come un ricercatore esperto in grado di gestire al massimo circa 15 canali per esperimento, che a sua volta può richiedere diversi giorni per prepararsi. Tuttavia, gli antibiotici o mutanti che sono considerati rilevanti per gli studi di biofilm può inizialmente essere messa a screening con altri metodi come macchie di cristallo viola prima che i candidati più interessanti sono trasferite al sistema di cella di flusso. Le lamiere di copertura in vetro sono molto sottili e si rompono facilmente, e si deve prestare attenzione durante la manipolazione del sistema. Inoltre i tubi dovrebbero essere esaminati ogni giorno durante la corsa di un esperimento, come una notevole "back-crescita" nei tubi di aspirazione a monte delle cellule flusso può verificarsi. Tale contaminazione può essere risolto rimuovendo diversi centimetri di tubo di silicone dal lato ingresso delle cellule di flusso, con tecnica sterile. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 a) quattro giorni PAO1 vecchia -. Biofilm GFP trattati per 24 ore con colistina e ioduro di propidio per la colorazione morti (macchia rossa) b) presentazione in 3D di una tre giorni di vecchio P. PAO1 aeruginosa (P. aeruginosa tipo selvatico) - GFP biofilm 6 c) immagine di presentazione in 3D di un PAO1 - CFP pila mutante (blu) con un tipo di PAO1 YFP selvatico (giallo), d) 5 giorno di vita PAO1 - GFP biofilm presentato come un 3D e immagine) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante in CEN.PK sfondo) biofilm colorate con Syto-9 15.

<ul><li> Trappole Bubble, polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%%) </li><li> Connettori in plastica trasparente in polipropilene e T-connettori (Cole Parmer, 1 / 8 pollici (3,175 mm) e 1 / 16 pollici (1.588 mm)) </li><li> Morsetti </li><li> Microscopio confocale (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Coprioggetto, vetro (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Coprioggetto, PVC coprioggetti (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Celle di flusso, il polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%% </li><li> Bottiglie Media (Schott) </li><li> Pompa peristaltica (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rotolamento carrello per i sistemi di flusso e pompe </li><li> Silicone colla (3M Super Sigillante siliconico trasparente) </li><li> Siringa da 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml siringhe con aghi (27G, Terumo LU-100) </li><li> Contenitore dei rifiuti </li></ul> Tubi: <ul><li> Silicone, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Ole Dich) </li><li> Silicone, 4 mm di diametro esterno, 2 mm diametro interno (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Watson-Marlow) </li></ul> Media <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa media </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 ml di 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 l / L metalli in tracce (per P. aeruginosa-biofilm) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare A10 e FB in un rapporto di 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere la sorgente di carbonio ad una concentrazione desiderata. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae sintetico completo (SC) di media </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Solfato di adenina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-istidina-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arginina-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lisina HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-acido aspartico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> Acido L-glutammico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Lievito NitRogen Base w / o aminoacidi e di ammonio (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Solfato di ammonio </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Acido succinico </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio (autoclavato a parte) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa e biofilm saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Cellule microbiche Molti hanno la capacità di formare comunità microbiche sessili definito come biofilm che hanno modificato le proprietà fisiologiche e patologiche rispetto ai microrganismi che vivono liberi. Biofilm in natura sono spesso difficili da indagare e di soggiornare in condizioni di scarsa definite 1. Utilizzando un substrato trasparente è possibile al dispositivo di un sistema in cui biofilm semplici possono essere esaminate in maniera non distruttiva in tempo reale: qui dimostriamo il montaggio e il funzionamento di un sistema di modello di flusso di cellule, per studi in vitro 3D dei biofilm microbici generando alta riproducibilità sotto ben definite condizioni di 2,3. Il sistema è costituito da una cella di flusso che funge da camera di crescita per il biofilm. La cella di flusso è fornito con sostanze nutritive e ossigeno da una fiaschetta di media tramite una pompa peristaltica e medio speso è raccolto in un contenitore dei rifiuti. Questa costruzione del sistema di flusso consente un approvvigionamento continuo di sostanze nutritive e la somministrazione di antibiotici ad esempio, con il minimo disturbo delle cellule coltivate in camera di flusso. Inoltre, le condizioni di flusso all&#39;interno della cella di flusso consentono studi di biofilm esposti a sollecitazioni di taglio. Una bolla cattura confini dispositivo di bolle d&#39;aria dal tubo che altrimenti potrebbe disturbare la struttura di biofilm nella cella di flusso. Il sistema di cella di flusso è compatibile con microscopio confocale a scansione laser (CLSM) e può quindi fornire informazioni molto dettagliate 3D sullo sviluppo biofilm microbici. Cellule del biofilm possono essere etichettati con sonde fluorescenti o proteine ​​compatibile con l&#39;analisi CLSM. Ciò consente la visualizzazione on-line e permette di indagine di nicchie nel biofilm via di sviluppo. Interrelazione microbica, indagine degli agenti antimicrobici o l&#39;espressione di specifici geni, sono delle configurazioni molti sperimentale che può essere indagato nel sistema di cella di flusso.

Protocollo che descrive l&#39;applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l&#39;analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Ciao, sono Matt Ma Niton dell'Università Tecnica della Danimarca. Ciao, sono Reba dell'Università di Copenaghen. Lavoriamo su lieviti e biofilm batterici in sistemi di celle a flusso E in questo filmato vi mostreremo come impostare un sistema di celle a flusso e visualizzare il biofilm con un microfono convertibile.Dovremmo farlo ora? Sì, certo. Facciamolo.Incollaggio delle celle di flusso. Le celle di flusso si trovano tra la trappola a bolle d'aria e la bottiglia di scarto. Ora ti mostreremo come attaccare.Questo è lo strato della cella di flusso. Questa operazione viene eseguita dai diversi componenti visualizzati nella tabella. Una punta da 200 microlitri viene tagliata in due pezzi.La parte sottile viene ora inserita in una siringa, che diventerà lo strumento perfetto per applicare sottili linee di silicone. Per incollare il vetro di strato alla cella a flusso, spingere la punta sottile fuori dalla siringa. Ora, per facilitare l'applicazione del silicone alla base della cella a flusso, tagliare la parte più esterna della punta, estrarre il pistone e applicare una quantità appropriata di silicone nella siringa.Rimetti il pistone nella siringa e spingi fuori un po' di silicone per assicurarti che tutte le bolle siano sparite. Ora inizia ad applicare sottili linee di silicio alla cella a flusso. Cercate di creare linee di silicio lisce e ininterrotte verso la cella di flusso.Ciò assicurerà che il silicone si attacchi uniformemente al substrato quando si applica il silicone nella direzione opposta. Assicurati di non graffiare le linee già fatte, ma prova a sollevare delicatamente la punta mentre attraversi, e in questo modo ti assicurerai che nessuna apertura nelle linee di silicio porti a perdite tra le camere o dall'esterno della cella di flusso. Prendi un vetro di copertura e posizionalo delicatamente sopra le linee di silicone sulla cella di flusso.Come si vede qui, il vetro di copertura si attaccherà facilmente alla colla siliconica. Capovolgere la cella di flusso e spingere delicatamente verso il basso la parte posteriore della cella di flusso con le dita. Ciò garantirà che il vetro di copertura si attacchi in modo piatto in base alla superficie piana del tavolo.Ora per fare una tenuta perfetta o per cercare di correggere le aree di apertura, spingere delicatamente verso il basso con uno strumento come un pistone da una siringa. Fallo con molta attenzione. Come un vetro di copertura può rompersi facilmente.In questo modo, sarai in grado di realizzare una tenuta ancora migliore e probabilmente sarai in grado di correggere eventuali zone problematiche per evitare perdite ispezionando le celle di flusso. Per avere un esperimento di successo, è importante ispezionare le celle a flusso dopo che il silicio si è solidificato. Qui mostriamo una cella di flusso con una tenuta non perfetta, che senza dubbio porterà a perdite, montaggio delle trappole a bolle e fissaggio dei tubi.Gli scaricatori di bolle si trovano tra la pompa e le celle di flusso. Qui mostriamo i diversi componenti per l'uso delle trappole a bolle bio DTU. Sono fabbricati in modo da garantire che le bolle siano intrappolate nel sistema e che solo i mezzi senza bolle entrino nelle celle di flusso.Siringhe da cinque millilitri sono posizionate sopra ciascuno degli ugelli speciali. Sulla trappola a bolle, una tenuta ermetica è assicurata dai vecchi anelli. Su ciascun ugello, posizionare un tappo su ciascuna siringa.Ora, poiché questa sarà la connessione per le celle a flusso, assicurati di collegare i tubi lunghi per la cella a flusso per poter raggiungere un microscopio confocale. Questi tubi devono essere fissati alle trappole a bolle d'aria dove la sporgenza inferiore dell'ugello ha la sua uscita. Poiché la sporgenza di ingresso nella trappola a bolle è più alta della sporgenza di uscita, le bolle non sono in grado di lasciare la siringa ed entrare nell'attacco della cella di flusso delle celle di flusso alle trappole a bolle.Le celle di flusso si trovano tra le trappole a bolle d'aria e la bottiglia di scarico. In questo caso è necessario disporre di tubi lunghi affinché la cella a flusso raggiunga il microscopio confocale. Ancora una volta, assicurati di collegare il flusso al lato corretto della trappola per bolle. Qui.Notare i tubi lunghi che portano al flusso dalla trappola a bolle. Questo può ovviamente variare in base alla costruzione di una configurazione. Ora fissare saldamente tutti i tubi alla cella di flusso Assemblaggio delle trappole a bolle del sistema alla pompa e ai connettori a T.Per i tubi di alimentazione dei fluidi. Per la pompa peristaltica, utilizziamo i tubi RIN. Questo specifico tipo di tubi è in grado di resistere alla pressione meccanica della pompa.Imposta un tubo per ciascuna delle camere delle tue celle a flusso. Qui mostreremo ora come vengono assemblati i tubi che vanno dal flacone del supporto alla pompa. Tagliare il tubo di silicone in pezzi di dimensioni adeguate e collegarli con i connettori a T.Assemblare i tubi in modo che ci sia un collegamento per ciascuno dei tubi del cervello nella pompa. Assicurati di creare un tubo per ciascuna delle camere della cella di flusso. Cerca di rendere i tuoi tubi il più corti possibile per avere una panoramica più facile delle tue connessioni.Ora dal tubo di alimentazione centrale attaccato ai connettori a T tubi corti che possono essere collegati ai tubi ING nella pompa. Assicurarsi che i tubi in silicone siano ben fissati ai connettori. Ora con i tubi di alimentazione del fluido sul lato sinistro della pompa, collegheremo il resto del sistema alla pompa.Ecco i tubi che vanno ai vassoi delle bolle sono attaccati ai tubi di risciacazione sulla pompa. Ancora una volta, qui alleggerirai la panoramica del tuo esperimento. Se sai quali tubi vanno a quale connessione nella pompa, la lunghezza di questi tubi non è così cruciale come i tubi sull'altro lato della trappola per bolle.Principali mezzi per le celle di flusso, ora ti abbiamo mostrato come assemblare con successo un sistema con una trappola a bolle e una cella di flusso sul punto di uscita della cella di flusso. Abbiamo collegato tubi che sono abbastanza lunghi da entrare in un contenitore di rifiuti sterilizzazione del sistema per sterilizzare il sistema, fare una soluzione 0,5 di cloridrato di sodio. Posizionare i tubi di alimentazione della pompa nella soluzione di cloridrato.A questo punto, è estremamente importante riempire l'intero sistema con la soluzione di cloridrato. Permette alle siringhe delle trappole a bolle di riempirsi totalmente di cloridrato quando sono riempite, rimettere i tappi, che nel frattempo avrebbero dovuto essere messi in etanolo. Una fase importante nella sterilizzazione del sistema è la rimozione delle bolle dalle celle di flusso.Tali bolle possono essere facilmente viste nelle celle di flusso mostrate qui, ma l'elevato successo della rimozione delle bolle fa girare la pompa ai suoi giri più alti al minuto. Ciò porterà a un flusso di liquido più elevato nelle celle di flusso, che nel tempo aiuterà a sbarazzarsi delle bolle, sollevare la cella di flusso e sollevare i tubi che portano alla cella di flusso e toccare con decisione la cella di flusso sul tavolo per allentare le bolle al fine di eliminarle. Con il flusso del liquido, questa procedura a volte richiederà molto tempo, ma in questo modo sarai in grado di eliminare le bolle.Se sei un paziente, ora, lascia le celle a flusso sterilizzate per tre o quattro ore a un flusso di circa 0,2 millimetri al secondo. Lavare prima il sistema nel sistema consentendo all'aria di spingere il cloridrato fuori dall'intero sistema. Poiché il sistema è stato svuotato dal cloridrato, posizionare il tubo di alimentazione centrale in una bottiglia d'acqua sterile e coprire la parte superiore.Il sistema ora deve essere lavato due o tre volte riempiendo un vuoto nel sistema con acqua sterile, collegando il fluido e la saturazione dei tubi durante la notte. Quando si collega la bolla del fluido al sistema, il sistema deve essere svuotato dall'acqua. Come per l'ipoclorato, riempi la spazzatura delle bolle con del terreno prima di rimettere i tappi.Quando si collegano i supporti, fare molta attenzione a mantenere tutto sterile. Tenere l'etanolo pronto lateralmente nel punto di connessione. Posizionare i due tubi nell'etanolo appena prima di collegare i tubi.Ora con il terreno collegato al sistema, è pronto per la saturazione o l'inoculazione durante la notte. A seconda della scelta del terreno che inocula la cella a flusso. Nelle celle a flusso biologico DTU, sono disponibili tre siti di inoculazione per le tre camere di crescita individuali.La prima cosa da fare è sterilizzare il sito di inoculazione da una coltura notturna. Fai allusione per raggiungere la densità ottica desiderata. Utilizzare una siringa da 500 microlitri con un ago da 27 G per inoculare il campione.Un inoculo di 250 microlitri è sufficiente per le celle a flusso biologico DTU. Ora il sito di inoculazione viene pulito con la strisciata netta di etanolo e il lato di inoculazione viene chiuso con colla siliconica. Ora capovolgere la cella di flusso e lasciarla in questa posizione per un'ora senza alcun flusso di fluido.Dopo che la cella di flusso è rimasta capovolta per un'ora, rimuovere la vongola e avviare il flusso del fluido e posizionare nuovamente una cella di flusso in posizione capovolta. Ora inizia l'incubazione del sistema. Il tempo di incubazione e la scelta della temperatura variano a seconda delle scelte, dei ceppi e delle configurazioni sperimentali, della colorazione di un biofilm di lievito e della visualizzazione mediante microscopia a scansione laser confocale.Per visualizzare il biofilm del lievito con un microscopio confocale, lo coloriamo con la colorazione fluorescente verde dell'acido nucleico CY nine. Qui usiamo una diluizione da uno a mille. In primo luogo, i tubi che riportano alle trappole a bolle dalle celle di flusso vengono rivestiti.Ciò impedirà il riflusso dal flusso durante la procedura di colorazione. Ora arrestare il flusso del fluido verso la trappola a bolle. Utilizzare una siringa da 500 microlitri per l'inoculazione per iniettare la colorazione cytonine nella camera di flusso.Ancora una volta, usa una salvietta all'etanolo per sterilizzare il sito di inoculazione. Iniettare 250 microlitri nella camera qui. Sii molto attento e gentile.Durante l'inoculazione, la velocità di inoculazione deve essere molto bassa per non interrompere il biofilm. Chiudere il foro di inoculazione con colla siliconica. Lasciare depositare la colorazione per 15 minuti senza fluire.Togli la fascetta e riavvia il flusso. Ora sei pronto per analizzare il biofilm colorato. Con la microscopia a scansione laser confocale, le celle di flusso sono dotate di speciali sporgenze che ne consentono il posizionamento nei supporti sul tavolino del microscopio.Quando la cella di flusso viene posizionata nel tavolino del microscopio, una goccia di olio viene posta sul vetro dello strato. Per utilizzare l'obiettivo ad immersione in olio, accendere la luce bianca e abbassare l'obiettivo in modo che entri in contatto con l'olio e localizzi le celle nella camera. Fai attenzione se usi un bicchiere di strato perché può rompersi facilmente.Qui mostriamo un biofilm di lievito visto con la luce bianca al microscopio. Quando la luce fluorescente è accesa, si può facilmente vedere la colorazione cito-nove delle cellule. La colorazione cytonine consentirà ora la scansione del biofilm con un microscopio confocale.Per ulteriori analisi con il software Amer, individuare la posizione di interesse nella camera di flusso con il microscopio. Ricordarsi di tenere conto dei diversi ambienti che si generano nel tempo all'interno della camera di flusso. Quando si sceglie una posizione, ora passare dal microscopio dalla visualizzazione oculare alla visualizzazione laser a scansione.Con il software LM di dimensioni, ora inizia ad applicare le impostazioni di decisione per la scansione dei tuoi campioni. Una rapida scansione dei campioni vi darà un'indicazione della composizione strutturale del biofilm nelle camere di crescita. Prima di iniziare la scansione ad alta risoluzione, che richiede più tempo, qui abbiamo detto Qual è la prima e qual è l'ultima posizione della scansione, e quindi quanto sarà grande la pila.Siamo in grado di scansionare le diverse frequenze grazie ai diversi laser installati nel microscopio. Ciò consentirà lo studio di numerose sottopopolazioni diverse. Qui vediamo il biofilm di lievito a nove macchie di ombra verde presentato nella finestra dalle specifiche lunghezze d'onda utilizzate.Ciascuno degli stack di scansione può ora essere analizzato nei programmi software come errori.

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