Espressione genica tramite elettroporazione di una singola cellula in colture di fette di ippocampo di topo

Inizia con una fetta di ippocampo da un cervello di topo coltivato su un inserto di coltura in un piatto.

Tagliare l'inserto contenente la fetta e fissarlo al microscopio in una camera di elettroporazione.

Perfondere la camera con un tampone contenente un bloccante dei canali del sodio voltaggio-dipendente per inibire la sovraeccitazione e prevenire la tossicità cellulare.

Posizionare una pipetta contenente plasmidi con il gene di interesse vicino alla fetta.

Mantenere una pressione positiva per evitare l'intasamento della pipetta mentre ci si avvicina a un neurone dell'ippocampo bersaglio fino a quando non si forma una fossetta sulla membrana.

Passare alla pressione negativa per creare una tenuta con la membrana.

Alternare pressione positiva e negativa per ridurre al minimo il danno cellulare.

Applicare un impulso di elettroporazione per permeabilizzare transitoriamente la membrana, facilitando l'ingresso del plasmide.

Estrarre la pipetta mantenendo una pressione positiva e ripetere l'elettroporazione per i neuroni bersaglio vicini.

Trasferire la fetta elettroporata in un inserto fresco e incubarla per consentire l'espressione del gene di interesse.

Per preparare le colture a fette per l'elettroporazione, trasferire gli inserti di coltura di interesse in singole piastre di Petri da tre centimetri caricate con 900 microlitri di terreno di coltura e posizionare le colture in un incubatore di anidride carbonica da tavolo. Successivamente, pre-incubare gli inserti di coltura freschi con un millilitro di terreno di coltura a fette per inserto in una capsula di Petri da 3,5 centimetri per almeno 30 minuti e sterilizzare le linee del banco di elettroporazione con candeggina al 10% per cinque minuti.

Al termine della perfusione, sciacquare le linee con l'acqua ionizzata autoclavata per almeno 30 minuti prima di perfondere con filtro sterilizzato aCSF contenente 0,001 millimolari di tetrodotossina. Impostare l'impulso dell'elettroporatore su un'ampiezza di meno cinque volt, un impulso quadrato, un treno di 500 millisecondi, una frequenza di 50 hertz e un'ampiezza dell'impulso di 500 microsecondi. Riempi una pipetta di vetro con cinque microlitri di soluzione interna contenente plasmide e picchietta delicatamente e picchietta più volte la punta per rimuovere eventuali bolle intrappolate.

Utilizzare un microscopio da dissezione per verificare che la punta non sia danneggiata e fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo. Quando il puntale entra in contatto con l'aCSF, registrare la lettura della resistenza della pipetta dell'elettroporizzatore. Per isolare una coltura a fette, tagliare la membrana dell'inserto di coltura con una lama affilata e utilizzare una pinza ad angolo acuto per trasferire con cura la coltura a fette nella camera di elettroporazione.

Fissare quindi la posizione delle impostazioni cultura con un ancoraggio di sezione. Per l'elettroporazione delle cellule di interesse, applicare una pressione positiva alla pipetta per bocca e utilizzare i comandi tridimensionali della manopola per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura a fette. Osservando la coltura con il microscopio, avvicinarsi alla cellula bersaglio con la punta, mantenendo la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare.

Dopo la visualizzazione della fossetta, applicare rapidamente una leggera pressione negativa con la bocca in modo che si formi una tenuta allentata tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica. La membrana entrerà leggermente nella pipetta. Si deve osservare un aumento di circa 2,5 volte della resistenza iniziale della pipetta, come indicato da un aumento del tono dagli altoparlanti.

Riapplicare rapidamente la pressione positiva in modo che la fossetta si riformi. Quindi completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione, come appena dimostrato, senza pause. Dopo l'ultimo impulso di pressione, mantenere la pressione negativa per un secondo.

Quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile dell'intonazione, utilizzare il pedale per pulsare rapidamente l'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 micron dalla cella senza applicare pressione e riapplicare una pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura della linea di base prima di avvicinarsi alla cella successiva. Quando tutte le cellule di interesse sono state elettroporizzate, trasferire la coltura a fette in uno degli inserti di coltura freschi preparati e posizionare l'inserto a 35 gradi Celsius per un massimo di tre giorni.