Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali per la transizione dal sonno alla veglia nei topi

Fissare un topo anestetizzato con un cranio esposto in una cornice stereotassica.

Il nucleo del letto cerebrale della stria terminale (BNST) contiene neuroni trasdotti viralmente che esprimono canali cationici sensibili alla luce.

Praticare dei fori nel cranio, inserire le fibre ottiche e fissarle con viti di supporto e cemento dentale.

Praticare fori aggiuntivi per posizionare un gruppo contenente elettrodi per elettroencefalografia (EEG) ed elettromiografia (EMG) e fissarlo con adesivo.

Esporre i muscoli del collo per inserire i fili degli elettrodi EMG, quindi consentire il recupero.

Collega il mouse a un sistema di registrazione, posizionalo in una camera sperimentale e lascialo dormire.

Erogare la luce attraverso la fibra ottica per attivare i canali cationici sensibili alla luce, innescando l'afflusso di cationi che genera potenziali d'azione.

I segnali si propagano alle regioni regolatrici del sonno e promuovono la veglia.

Registra i segnali EEG per monitorare l'attività cerebrale e i segnali EMG per rilevare l'attività muscolare per osservare la transizione dal sonno alla veglia.

Per l'elettroencefalogramma, o EEG, e l'elettromiogramma, o EMG, impianto di elettrodi, saldare prima due fili di acciaio inossidabile da cui è stato strappato un millimetro di isolamento da entrambe le estremità agli elettrodi EMG e posizionare il centro degli elettrodi sul bregma. Quindi segnare la posizione per ogni elettrodo EEG.

Per determinare la posizione dell'impianto in fibra ottica, collegare una ghiera in fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio del manipolatore a un angolo di più o meno 30 gradi contro una linea orizzontale. Metti la punta della fibra sulla bregma e registra le coordinate. Spostare la punta sulla linea di inserimento mirata e segnare la posizione sul cranio e la posizione della vite di ancoraggio accanto al sito di inserimento.

Usa il trapano dentale per perforare il cranio in ogni sito e usa il manipolatore per inserire delicatamente la fibra ottica fino a quando non raggiunge sopra il BNST. La ghiera dovrebbe poggiare sul cranio rimanente. Fissare la fibra al cranio con una vite di ancoraggio, facendo attenzione a non rompere la dura madre o danneggiare alcun tessuto.

Quindi coprire la fibra e avvitare con cemento dentale fotopolimerizzabile. Quindi, praticare i fori per gli elettrodi EEG/EMG e inserire la punta del primo elettrodo in un foro. Tenendo l'impianto con una mano, applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e l'elettrodo e inserire l'elettrodo fino in fondo, facendo attenzione a non danneggiare alcun tessuto.

Quando tutti gli elettrodi sono stati posizionati, coprire la circonferenza degli elettrodi e le fibre ottiche con ulteriore adesivo cianoacrilato e accelerante di cianoacrilato per evitare di causare interruzioni nelle zone di collegamento tra la boccola e il cavo ottico e le zone di collegamento tra elettrodo e filo conduttore. Ora esponi i muscoli del collo e inserisci i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si adatti appena sotto i muscoli nucali e riempire gli impianti con più cianoacrilato adesivo e accelerante.

Quindi posizionare il mouse su un pad termico con monitoraggio fino alla completa ricompensa. Per il monitoraggio EEG/EMG durante la fotoeccitazione dei neuroni bersaglio, utilizzare prima uno scalare per regolare l'intensità del laser e utilizzare una ghiera per legare la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata. Verificare che non vi sia spazio all'incrocio tra la fibra e il cavo.

Dopo 20 minuti, emettere il laser riscaldato sul correttore di intensità e regolare l'intensità a 10 milliwatt per millimetro quadrato. Impostare la durata dell'impulso luminoso su 10 millisecondi, il periodo di riposo su 40 millisecondi, il ciclo su 20 e la ripetizione su 20. Cambia la modalità laser in logica a transistor e verifica che gli impulsi luminosi vengano emessi dalla fibra controllata dal regolatore di pattern.

Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore del cavo, quindi coprire la giunzione con materiale impermeabile alla luce per evitare perdite laser. E quando il laser è pronto, sposta i topi nella camera sperimentale per la registrazione EEG/EMG. Per valutare la latenza alla veglia da movimenti oculari non rapidi o sonno con movimenti oculari rapidi, limitare il tempo di registrazione e ottimizzare il tempo di guadagno del sito e lasciare che i topi si muovano liberamente nella camera sperimentale per almeno un'ora.

Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nella stessa schermata di registrazione. Valuta lo stato del mouse come veglia, sonno con movimenti oculari non rapidi o sonno con movimenti oculari rapidi utilizzando il controllo del guadagno per ogni onda per facilitare la distinzione di ogni stato. Per misurare la latenza dal sonno al sonno con movimenti oculari non rapidi, osservare un sonno stabile con movimenti oculari non rapidi per 40 secondi, quindi accendere il generatore di pattern per la fotostimolazione e confermare l'emissione laser alle fibre ottiche impiantate.

Quindi registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato di sonno non cambia in veglia.