In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Ciao, sono William Tis del laboratorio di Krete. Oggi, io e gli altri vi mostreremo iniezioni intrauterine di embrioni di topo E 15. Ciao, mi chiamo Laura Elias.

Oggi vi mostrerò come preparare le pipette per microiniezione e come caricarle per le iniezioni intraventricolari ed elettroporazione che eseguiremo. Mi chiamo David Castaneda e oggi assisterò nelle iniezioni in vivo in utero di embrioni di topo. Inietteremo DNA plasmidico nel ventricolo laterale di embrioni di topo in via di sviluppo.

Abbiamo come bersaglio la corteccia CE di questi embrioni in modo da ottenere l'espressione di diverse molecole da parte delle cellule gliali, che in seguito allo sviluppo diventeranno neuroni. Quando si eseguono queste iniezioni intrauterine, ci sono alcuni strumenti importanti che dovrete utilizzare e ve li mostrerò ora. Utilizziamo un freer, un paio di pinzette adin.

Uno, una coppia dentata e un'altra coppia con un piccolo dente all'estremità. Utilizziamo una pinza emostatica. Queste sono un paio di forbici.

E poi usiamo queste due graffiatrici. Questa è quella più grande, che utilizziamo per i ratti. Questa è quella più piccola che usiamo per i topi.

Utilizza un puntino di dimensione sette e questo utilizza un puntino di dimensione nove, entrambi a molla. Alcune delle attrezzature che utilizziamo qui per assistere durante gli interventi chirurgici includono una semplice sorgente luminosa a fibra ottica con una testa doppia. Usiamo anche un tappetino riscaldato che circola acqua calda al suo interno per mantenere il calore.

La superficie di lavoro, utilizziamo questo sistema di elettroporazione prodotto da BTX. Abbiamo diverse misure di elettrodi che usiamo in base alle dimensioni degli embrioni. Il lato blu è il lato positivo.

Ok, per i topi utilizziamo un vaporizzatore a isoflurano. Abbiamo scoperto che aumenta il tasso di sopravvivenza della madre e degli embrioni. Inoltre, permette di indurre e interrompere rapidamente e in modo molto controllato lo stato di incoscienza dell'animale.

Per questo motivo, l'abbiamo trovato molto utile. Ora procederemo ad affilare le nostre pipette per iniezione. Questo passaggio è molto importante perché la pipetta abbia un'apertura sufficientemente ampia da permettere il caricamento del DNA, ma sia anche estremamente affilata in modo da non danneggiare l'embrione durante l'iniezione.

Se si danneggia l'embrione durante l'iniezione, si avrà un tasso di mortalità molto più elevato. E quindi questo non è affatto positivo. Pertanto, questo è effettivamente un processo molto importante in questa procedura chirurgica.

E innanzitutto verseremo un po' d'acqua su questa pietra smussatrice che ruota qui. Poi prenderemo, vediamo un po', semplicemente un bastoncino. E posizioneremo la nostra pipetta, appena tirata, su questo bastoncino utilizzando del nastro adesivo.

Utilizzeremo uno di questi micromanipolatori per tenere la pipetta sul piano obliquo e consentirne l'affilatura. Quindi, posizioneremo semplicemente la pipetta e useremo un microscopio per visualizzarne la punta. La posizioneremo direttamente nell'acqua sopra il piano obliquo in modo da esercitare una leggera pressione.

E puoi vedere la punta premere contro, contro la pietra qui. E lasciala smussare per un certo periodo, almeno, sai, 15 minuti. Mi piace lasciarle anche, sai, un'ora.

A volte diventano semplicemente molto, molto appuntite, ma la lunghezza della smussatura dipende sicuramente da persona a persona. Bene, qui abbiamo, come potete vedere nella parte superiore, una pipetta che è stata tirata ma che non è ancora stata smussata. Quindi, anche se è appuntita, non ha alcuna apertura attraverso cui poter caricare il vostro DNA.

Ora la pipetta inferiore è stata smussata e si può vedere questo bel foro inclinato, che ti permetterà di caricare il tuo DNA, ma mantiene ancora una punta affilata in modo da poter effettuare l'iniezione senza provocare danni. Bene, ora riempiremo le nostre pipette di iniezione con il DNA. È importante che tu prepari il tuo DNA in modo privo di endotossine, in modo da non iniettare lipopolisaccaridi insieme al DNA.

Quindi prenderemo il nostro DNA e, in questo momento, prepareremo il parafilm. Dovrete creare il vostro parafilm qui e raccogliere il DNA, posizionandolo come un piccolo punto su questo foglio di parafilm. Successivamente prenderemo, di solito prendo per ogni 10 microlitri del mio DNA, che uso solitamente in una quantità di circa 1,5-1,7 microgrammi per microlitro.

Utilizzerò circa un microlitro di questo colorante verde brillante. Questo serve semplicemente per aiutarci a localizzare l'iniezione e assicurarci di aver iniettato con successo nel ventricolo. Quindi mescolerò semplicemente questo colorante verde brillante con il mio DNA.

Quindi prendete l'elettrodo di iniezione e riempirete la pipetta tirando indietro lo stantuffo. Come potete vedere, se la pipetta è stata smussata correttamente e presenta un'apertura sufficientemente ampia, il DNI dovrebbe caricarsi abbastanza facilmente. A volte è necessario muovere lo stantuffo avanti e indietro per favorire un corretto caricamento.

E così ora puoi caricare la pipetta in questo modo. Abbiamo caricato completamente il DNA in questa pipetta ed è pronta per l'iniezione. Ok, ora devo pulire l'animale con alcol e iodio, ma prima ovviamente voglio fare una compressione del dito del piede per assicurarmi che l'animale sia completamente sotto anestesia e sembra andare bene.

Quindi posso procedere e iniziare. E comincio, proprio come nei ratti, con una serie di tre di questi, partendo dall'etanolo. Ok, iodio.

Per ridurre al minimo il rischio di infezione, osservare che quando William apre le salviette, pulisce l'animale con la parte che non è stata toccata dalle sue dita, in modo da massimizzare la pulizia della zona. In secondo luogo, effettua un solo passaggio per evitare di distribuire germi sulla superficie addominale.

Bene, ora farò un po' di pulizia e indosserò dei guanti chirurgici. Bene. Bene. Bene. Ora aprirò il topo ed estrarrò le corna uterine, cominciando con una piccola pizzicatura della pelle.

Faccio un altro pizzicotto al dito del piede qui, giusto per assicurarmi che sia completamente sotto anestesia e va bene così. Pizzico la pelle e creo una piccola increspatura che si solleva, rendendo più facile il taglio. Ancora una volta, vogliamo praticare l'incisione esattamente lungo la linea mediana dell'animale per evitare vasi sanguigni.

Di solito taglio la pelle in questo modo, la separo ed espongo il muscolo. Una volta fatto ciò, si può vedere facilmente la linea mediana nel muscolo. È molto ben definita.

Prelevo un po' di muscolo in quella zona e faccio un'incisione di buone dimensioni. Non vorrei andare effettivamente oltre questa grandezza. Poi uso questo strumento per sollevare il muscolo e la pelle, tiro da un lato e quindi inserisco delicatamente una sonda qui dentro, cercando di posizionare lo strumento tra i due embrioni, tra due embrioni, in modo da poterli estrarre con delicatezza senza danneggiarli affatto.

A volte è più facile che in altri casi. Eccoci qua. Quindi basta tirare delicatamente e, una volta che l'ho fatto passare, posso semplicemente spingerli fuori.

È importante non schiacciare mai gli embrioni, ma semplicemente guidarli, spostandoli delicatamente. E una volta estratti, è fondamentale mantenerli sempre molto umidi. Non bisogna permettere che si disidratino.

E vediamo, uso di nuovo il mio freer qui, esploro intorno. Ecco fatto. È perfetto.

E quindi voglio sempre assicurarmi di averle estratte tutte, perché è facile lasciarne una all'interno se non si controlla la presenza delle ovaie. Perciò le estraggo sempre molto delicatamente, controllando attentamente la presenza delle ovaie all'estremità, proprio in questo punto. In questo animale, hanno semplicemente l'aspetto di una piccola massa di tessuto rosso.

E poi capovolgeteli, tornate indietro e controllate l'altro lato e potrò vederli lì. Quindi assicuratevi di mantenerli idratati e saremo pronti per iniziare. Un dettaglio che voglio sottolineare è che non dovete, dovete afferrare gli embrioni molto delicatamente e afferrare soltanto gli embrioni.

Non afferrare dove si trovano i vasi sanguigni perché possono danneggiarsi molto facilmente e l'animale andrebbe incontro a emorragia, con una drastica riduzione della sopravvivenza. Quindi, la prima cosa da determinare è la posizione della testa nell'embrione che si desidera iniettare con il DNA. Per farlo, ruotiamo delicatamente l'animale ed esaminiamo ciascuna parte ventrale.

In questo esempio specifico, la testa si trova alla mia destra e la coda è vicina alla mia sinistra. La linea mediana è in questa posizione e William procederà a posizionare l'embrione in modo appropriato per poterlo iniettare, proprio come nei ratti. Li posiziono sempre con la testa rivolta verso la destra della madre, che è orientata verso di me.

E quindi inizierò ora. Ok, quindi puoi vedere il polo del pavimento sinistro lì, muoviti appena un po' e puoi vedere chiaramente la linea mediana proprio lì. Cercherò di ruotarlo leggermente in modo che sia in una buona posizione per David.

Ok, e ora procederò con l'iniezione nel ventricolo sinistro. Possiamo osservare che il ventricolo sinistro è completamente riempito di DNA. Si nota che un po' di colorante si è diffuso nel ventricolo destro e anche nei ventricoli terzo e quarto qui visibili.

Questo è un buon indicatore di un'ottima iniezione. Ora procederemo a elettroporare il DNA all'interno delle cellule. L'aspetto importante da considerare è identificare quale elettrodo corrisponda al lato positivo.

Sappiamo che quello con il manico blu è l'elettrodo positivo e questo lato deve essere inserito dal lato in cui desideriamo che il DNA venga elettroporato. Poiché abbiamo iniettato il ventricolo sinistro con la maggior parte del DNA, posizionerò l'elettrodo positivo sul lato sinistro in questo modo, quindi applicheremo cinque impulsi e questo è tutto. È importante che gli elettrodi siano completamente bagnati in PBS in modo che il contatto tra gli elettrodi e l'utero sia ottimale e la trasmissione degli impulsi elettrici sia appropriata.

Bene, ora che l'esplorazione è terminata, rimetterò con attenzione le corna all'interno. Per farlo, sposterò delicatamente le corna da un lato, raggiungerò all'interno, afferrerò il muscolo e la pelle e, con molta delicatezza, le ricondurrò dolcemente al loro posto. Va bene, perfetto.

Attenzione alla vescica. Posso fare l'altro lato. Poi quello che facciamo è scuoterla leggermente per farli assestare un po' all'interno.

È possibile usare il frese leggermente per appiattirli delicatamente. E poi procederò a sciacquare con tre ml di antibiotico-antimicotico. Effettuiamo una compressione sul dito del piede per assicurarci che sia completamente anestetizzata prima di iniziare la sutura.

E questo sembra buono. Userò Henry Shine. Numero sei, sutura chirurgica.

Preferisco eseguire punti a blocco. Penso che siano più resistenti. E cominceremo semplicemente infilando l'ago lì, tirandolo attraverso, avvolgendo tre volte, afferrando la punta e tirandola attraverso.

1, 2, 3, tagliare l'eccesso. Proseguire quindi lungo la linea mantenendo una distanza uniforme e tirare bene. Continuare appena oltre il punto in cui termina l'incisione e annodare nuovamente.

E ora mi sto avvicinando a quella zona. Tirare leggermente indietro il tessuto o la pelle. C'è un po' di sanguinamento in quella zona.

Dovrebbe andare bene. Teniamo a disposizione un cauterizzatore nel caso in cui si verifichi un sanguinamento, cosa che accade occasionalmente. Il cauterizzatore funziona bene per arrestare l'emorragia.

Bene, sono oltre l'incisione. Mi fermo qui. Tirare attraverso, formare un cappio, ruotare tre volte, afferrare il cappio e tirarlo verso il basso.

Ruotare su sé stessi per tre volte, afferrare il cappio, tirarlo attraverso, e tagliare l'eccesso. Inserire l'ago nel contenitore per materiali taglienti. Quindi utilizzeremo una pinzatrice.

Utilizzeremo punti metallici di dimensione sette su questo animale. Usiamo il sette per i topi. Il nove per i ratti.

Prendete semplicemente la pelle, sollevatela leggermente e iniziate a tagliare. Afferrate nuovamente la pinza. Dobbiamo procedere con distanze uniformi lungo tutta la linea, appena oltre l'incisione, e va bene così.

Proseguire con una pulizia con alcol dell'intera area. Quindi le somministreremo un'iniezione di buprenorfina solo per assicurarci che non provi alcun dolore. Continueremo a monitorarla nei prossimi giorni per assicurarci che rimanga in buona salute e non provi alcun tipo di dolore.

Bene, ora che le abbiamo somministrato un'iniezione di buprenorfina, la rimetteremo nella sua gabbia originale in modo che si senta al sicuro quando si sveglierà, la collocheremo nell'incubatrice e la lasceremo riposare per circa 20 minuti, fino a quando non sarà completamente sveglia e asciutta. Vi mostreremo come eseguire un'elettroporazione in vivo in utero del DNA plasmidico. Possiamo iniettare qualsiasi molecola.

Potrebbe essere il plaid D oppure potrebbero essere farmaci. I fattori di crescita muoiono. Se è necessario consegnare queste molecole all'interno delle cellule e queste non attraversano la diffusione passiva, sarà necessaria l'elettroporazione e, a tal fine, le molecole dovranno essere cariche.

Ma in sostanza le possibilità sono illimitate. Un esempio di vettore alternativo per il trasferimento di geni nelle cellule sono i virus.

E in passato abbiamo utilizzato retrovirus per etichettare i gls con DNA e mostrare come si dividano e diventino neuroni, migrando infine alla corteccia dopo aver etichettato le cellule con un virus o mediante elettroporazione, oppure dopo aver iniettato farmaci o altre molecole per influenzare lo sviluppo del cervello. È possibile studiare questo fenomeno attraverso diverse tecniche. Una di queste consiste nell'effettuare un TimeLapse, nel quale si realizzeranno colture di fette organotipiche.

E quindi seguirà il destino delle cellule utilizzando un microscopio. Come si può vedere qui, tempo 0,0. Si parte da un aggregato di cellule che si trovano molto vicino al ventricolo laterale.

E con il passare del tempo, possiamo osservare che le cellule iniziano a migrare dalla zona ventricolare verso la lamina corticale. Inoltre, fissiamo gli embrioni ed eseguiamo l'immunohistochimica per studiare, come sapete, la distribuzione di diverse molecole o per determinare il destino di queste diverse cellule. Un'altra possibilità è eseguire l'elettrofisiologia.

Identifichiamo le cellule marcate e poi ne studiamo le proprietà elettriche. Bene, grazie per essere stati con noi oggi. Speriamo che vi piacciano le nostre dimostrazioni e che riusciate nei vostri esperimenti.

Se hai domande, non esitare a contattarci. Buona fortuna.