Name: Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Impara a trasfettare cellule staminali neuronali umane con l'elettroporazione Nucleofector Amaxa. Questo protocollo efficace consente di studiare la funzione genica nel contesto neurale.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l&#39;Ospedale dei Bambini s, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC.

Nota: Fare riferimento all&#39;articolo Passaging neurali Cellule staminali umane ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) e il conteggio umani articolo Neural Stem Cells ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) per imparare a risospendere e contare hNSPCs. Preparazione <ol><li> Assicurarsi che ci sono un sacco di cellule disponibili per la trasfezione (diversi milioni di cellule per ogni DNA da transfettate). </li><li> Cappotto di una cultura di tessuto piatto, in cui le cellule transfettate saranno teste di serie, con 10 mg / ml fibronectina umana la sera prima di trasfezione. A destra prima di avviare il protocollo di trasfezione, rimuovere la fibronectina, lavare il piatto con PBS, luogo della cultura e dei media nel piatto. Lasciare il piatto nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore per riscaldare i media. Inoltre, posto 1 ml di terreni di coltura in incubatrice per pre-riscaldare a 37 ° C. </li><li> Posizionare il DNA (s) di essere trasfettate, e la soluzione di trasfezione (da Amaxa), sul ghiaccio. </li></ol> Trasfezione <ol><li> Lavare un numero definito di cellule con PBS (usiamo di solito ~ 5 x 106 cellule per trasfezione). Agglomerare le cellule per centrifugazione (1000 rpm (~ 200xg) per 5 minuti), togliere il PBS più possibile, e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri della soluzione di trasfezione fornito con il kit di trasfezione. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA (~ 5-10 mg di DNA per trasfezione) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. </li><li> Utilizzando il Amaxa mini-pipetta, trasferire la cellula-DNA mix nella cuvetta trasfezione Amaxa. Assicurarsi di avere 1 ml di pre-riscaldato terreni di coltura per il prossimo passo. Inoltre, rimuovere il piatto cella con terreni di coltura dal termostato e posizionarlo nel cappuccio coltura di tessuti. </li><li> Posizionare la cuvetta nella Nucleofector, ruotare la ruota in senso orario, e selezionare il programma &quot;A-033&quot;. Premere Invio. </li><li> Un trasfezione di successo è indicato dalla presenza di uno strato molto denso di bolle sulla parte superiore della soluzione nella cuvetta. Aggiungere 500 microlitri mezzi caldo nella cuvetta, e utilizzando il Amaxa mini-pipetta, trasferire le cellule transfettate nel piatto con pre-riscaldato media. Sciacquare la cuvetta con i media più calda e aggiungere il risciacquo per lo stesso piatto. Porre la capsula con le cellule nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Questo protocollo descrive una procedura di trasfezione relativamente rapido ed efficiente per hNSPCs. Utilizzando questa procedura, abbiamo ottenuto l&#39;efficienza di transfezione iniziale del ~ 35%. Cellule transfettate con questa procedura può essere utilizzata per studi a breve termine (cellule trasfettate transitoriamente) o per studi a lungo termine se un agente di selezione viene utilizzato per generare una popolazione stabilmente transfettate. Abbiamo generato cellule trasfettate stabilmente in cui circa il 70% delle cellule espri...

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Nucleofector</td><td>Strumento</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector per cellule staminali neurali di topo</td><td>Reagente</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

trasfezione delle cellule staminali neuronali con il nucleofector amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Trasfezione di cellule primarie neurale dei mammiferi, come umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), con reagenti comunemente usati lipidi cationici transfezione ha spesso portato la vitalità delle cellule poveri e bassa efficienza di trasfezione. Altri metodi meccanici di introdurre un gene di interesse, come ad esempio una pistola gene o microiniezione, sono anche limitato dalla scarsa vitalità delle cellule e basso numero di cellule transfettate. La strategia di usare costrutti virali per introdurre un gene esogeno in cellule primarie è stata limitata sia dalla quantità di tempo e lavoro necessari per creare vettori virali e di potenziali problemi di sicurezza. Descriviamo qui un passo-passo protocollo per la trasfezione hNSPCs utilizzando un dispositivo Nucleofector Amaxa e la tecnologia con parametri elettrici corrente e soluzioni tampone specificamente ottimizzato per trasfezione delle cellule staminali neurali. Usando questo protocollo, abbiamo raggiunto l&#39;efficienza di transfezione iniziale del ~ 35% ~ 70% e dopo trasfezione stabile. Il protocollo prevede che combina un elevato numero di hNSPCs con il DNA per essere transfettate nel buffer appropriato seguito da elettroporazione con il dispositivo Nucleofector.

L&#39;introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l&#39;apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

Trasfezione di cellule neurali primarie di mammifero, come le cellule staminali/precursori neurali umani (hNSPC), mediante l'uso di comuni agenti di trasfezione a lipidi cationici...

Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del dottor Flanagan presso il Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò come trasfettare cellule precursori neurali umane utilizzando un fattore nucleare maxis.Per prima cosa, avrai bisogno di molte cellule. Consiglierei almeno un fiasco T25 confluenente, poiché questo protocollo richiede una densità cellulare molto elevata, quindi serviranno almeno un milione di cellule. Per prima cosa, provvederò a staccare le cellule dalla superficie utilizzando un buffer di dissociazione cellulare, per poi contarle.Per tale procedura, fare riferimento al mio protocollo di trasfezione. Il motivo per cui preferisco utilizzare Amaxa per i miei esperimenti di trasfezione è che Amaxa sviluppa protocolli di trasfezione personalizzati per tipi cellulari specifici e, nel mio caso, per cellule staminali neurali. E funziona molto bene.Fornisce un'efficienza di trasfezione molto elevata e un'alta vitalità cellulare. Cominciamo. Ora sono pronto per eseguire una trasfezione.Quindi, in preparazione per questa trasfezione, ho già rivestito la mia piastra per colture cellulari con fibrina durante la notte. Successivam

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Nonostante i recenti progressi nella modificazione genetica, trasfezione di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimane un processo capriccioso. A nostra conoscenza, metodi sistematici ed efficiente per trasfettare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) non sono stati segnalati. Qui, descriviamo i protocolli affidabili per trasfettare in modo efficiente e nucleofect iPSCs umani.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Questo video descrive una precisa tecnica di editing del genoma in cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hiPSC, utilizzando TALEN per creare rotture a doppio filamento in un locus mirato, inducendo la riparazione diretta dall'omologia per l'integrazione genica della proteina di fluorescenza.

Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Questo video dimostra la riprogrammazione diretta di cellule progenitrici ematopoietiche geneticamente modificate in cellule staminali neuronali. I fattori di trascrizione espressi dalle cellule progenitrici ematopoietiche innescano una cascata di eventi molecolari che facilitano la loro trasformazione. Ulteriori terreni specifici vengono utilizzati per selezionare e far crescere le cellule staminali neuronali indotte.

Riprogrammazione diretta delle cellule progenitrici ematopoietiche in cellule staminali neurali

Questo video dimostra il processo di induzione delle cellule staminali pluripotenti umane a differenziarsi in neuroni trasfettandoli con lentivirus ingegnerizzati che trasportano un gene del fattore di trascrizione neurogenico sotto il controllo dell'elemento responsivo alla tetraciclina, seguito da un trattamento con un derivato della tetraciclina e un mezzo di maturazione.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

L'editing genetico mediato da TALEN presso il locus AAVS1 consente l'aggiunta di transgeni ad alta efficienza nelle iPSC umane. Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione delle iPSC per la somministrazione di TALEN e del vettore donatore, la trasfezione delle iPSC e la selezione e l'isolamento di cloni di iPSC per ottenere un'integrazione mirata di un gene GFP per generare linee reporter.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Qui, descriviamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di cellule staminali riprogrammate chimicamente per ottenere una modulazione neuronale precisa differenziando queste cellule in cellule precursori dopaminergiche, trapiantandole in modelli murini della malattia di Parkinson e valutando i risultati comportamentali ed elettrofisiologici per confermare il successo dell'integrazione e l'efficacia funzionale delle cellule trapiantate.

Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

Impara a trasfettare cellule staminali neuronali umane con l'elettroporazione Nucleofector Amaxa. Questo protocollo efficace consente di studiare la funzione genica nel contesto neurale.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

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