Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa
19 luglio 2007
L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.
Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del dottor Flanagan presso il Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò come trasfettare cellule precursori neurali umane utilizzando un fattore nucleare maxis.
Per prima cosa, avrai bisogno di molte cellule. Consiglierei almeno un fiasco T25 confluenente, poiché questo protocollo richiede una densità cellulare molto elevata, quindi serviranno almeno un milione di cellule. Per prima cosa, provvederò a staccare le cellule dalla superficie utilizzando un buffer di dissociazione cellulare, per poi contarle.
Per tale procedura, fare riferimento al mio protocollo di trasfezione. Il motivo per cui preferisco utilizzare Amaxa per i miei esperimenti di trasfezione è che Amaxa sviluppa protocolli di trasfezione personalizzati per tipi cellulari specifici e, nel mio caso, per cellule staminali neurali. E funziona molto bene.
Fornisce un'efficienza di trasfezione molto elevata e un'alta vitalità cellulare. Cominciamo. Ora sono pronto per eseguire una trasfezione.
Quindi, in preparazione per questa trasfezione, ho già rivestito la mia piastra per colture cellulari con fibrina durante la notte. Successivamente, ho aggiunto del mezzo di crescita. Al momento, la piastra si trova nell'incubatore in attesa di ricevere le cellule.
Inoltre, ho preparato tutti i reagenti, il vettore di DNA e la soluzione di transfezione. Quindi ora sono tutti in attesa qui sul ghiaccio. E sono pronto per iniziare la transfezione.
Questo è il fattore nucleare M max e, prima di posizionarlo nell'incubatore, lo disinfetterò con etanolo al 70% e poi lo asciugherò con un tovagliolo di carta. Ho appena contato le cellule ottenendo un totale di 4 milioni e le ho seminate. Ora sono pronto per iniziare la transfezione.
Quindi, per prima cosa rimuoverò il mezzo in cui si trovano. Ho qui il mio pellet cellulare e procederò ad aspirare il mezzo in cui erano. Cercherò di rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo, perché non voglio che vi siano proteine o sostanze simili nel mezzo di trasfezione, poiché potrebbero influenzare il protocollo di trasfezione.
Quindi ho rimosso quasi tutto il mezzo, e ora risospendo il pellet cellulare in cento microlitri di questa soluzione specificamente formulata di fattore nucleare per cellule staminali neurali di topo. Mxa produce una soluzione per trasfezione destinata alle cellule staminali neurali di topo, ma non ne dispone una per cellule staminali neurali umane; tuttavia, abbiamo scoperto che quella per cellule di topo funziona molto bene anche in questo caso. Dunque, aggiungerò cento microlitri di questa soluzione di effettore nucleare per cellule staminali neurali di topo.
E ora risospendo bene il mio pellet cellulare, in modo che non rimangano grumi di cellule. In pratica, otterrò una sospensione cellulare omogenea. Pertanto, aspirerò e rilascerò il liquido su e giù per circa 10 volte.
Quindi penso che ora abbia una miscela piuttosto omogenea, e ora la trasferirò in una provetta da 1,5 ml open dorf. Sto usando una pipetta P1000 e mi assicurerò di prelevare tutta questa soluzione. Ora ho i miei 4 milioni di cellule ri-sospesi in soluzione di trasfezione per topo, nuova soluzione per topo, e ora aggiungerò cinque microlitri del mio vettore.
Quindi l'ho tenuto sul ghiaccio per tutto questo tempo fino ad ora. E ora procederò, prima prelevo cinque microlitri. Ora li aggiungerò alla sospensione cellulare.
Ora userò una pipetta P200 regolata a circa 50 microlitri, e mescolerò bene, molto bene, le cellule con il vettore. Quindi aspirerò e rilascerò il campione su e giù per 10 volte. Ok, ora è pronto.
E io, sono pronto per la trasfezione. Quindi aprirò una nuova provetta. E inoltre prenderò una pipetta speciale fornita da amaxa.
Quindi rimuoverò il tappo e solleverò delicatamente questo mix. Inserirò la pipetta fino in fondo al vial e rilascerò dolcemente la soluzione. Accenderò il fattore nucleare max e imposterò su 33 0 3 3, quindi premerò invio.
Quindi inserirò il vete nel portavete, ruoterò la ruota, e a quel punto sarò pronto per la trasfezione. Ma prima, verificherò di avere del mezzo caldo pronto da aggiungere subito alle cellule trasfettate. Questo aiuta ad aumentare la vitalità cellulare se aggiungo il mezzo caldo nel vete immediatamente dopo la trasfezione.
Quindi preparerò una P1000. Inoltre, preleverò il mezzo già utilizzato che si trova attualmente nell'incubatrice, in modo da poter trasferire subito le cellule nel mezzo. Ora premerò nuovamente invio ed è fatto.
E il transfezionamento riuscito, come potete vedere, presenta qui uno strato molto spesso di bolle che indica un transfezionamento di successo. Aggiungerò quindi 500 microlitri di mezzo preriscaldato nel vete. Sto aggiungendo altro mezzo che le cellule desiderano ardentemente, e utilizzerò la stessa pipetta MX per prelevare le cellule dal vete.
Quindi al momento sono molto stressate. Le metterò direttamente in un mezzo caldo, più mezzo caldo. Infine, nell'ultimo passaggio, risciacquerò la Q vete con altro mezzo preriscaldato per assicurarmi di recuperare tutte queste cellule, e la posizionerò nella stessa pozzetta L, quindi metterò subito la piastra nell'incubatore.
In questa immagine, osserviamo cellule precursori neurali umane che sono state trasfettate con un fattore nucleare di accesso e seminate su coprivetri a griglia. Già due giorni dopo la trasfezione, otteniamo un'efficienza di trasfezione di circa il 50%, osservabile mediante l'espressione di GFP. Oggi vi ho mostrato come trasfettare cellule precursori neurali umane utilizzando il fattore nucleare Xis.
In bocca al lupo per la tua trasfezione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per la trasfezione di cellule staminali/precursori neurali umane (hNSPCs) mediante l'apparecchiatura per elettroporazione Nucleofector. Il processo è fondamentale per lo studio della funzione genica in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Analisi della funzione genica
Sfondo
- La trasfezione è una tecnica fondamentale per lo studio dei geni.
- Le cellule precursori neurali umane sono essenziali per la ricerca in neuroscienze.
- La tecnologia Nucleofector migliora l'efficienza della trasfezione.
- Comprendere la funzione genica può portare a nuove conoscenze in neurobiologia.
Scopo dello studio
- Introdurre un gene di interesse in hNSPC.
- Chiarire la funzione dei geni in un contesto neurale.
- Fornire un protocollo affidabile ai ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Dissociazione cellulare utilizzando un buffer.
- Conteggio delle cellule per garantire un'alta densità.
- Utilizzo dell'apparecchio Nucleofector per l'elettroporazione.
- Trasfezione di cellule precursori neurali umane.
Risultati principali
- Trasfezione riuscita di hNSPC.
- Un'elevata densità cellulare è fondamentale per una trasfezione efficace.
- Il protocollo dimostra riproducibilità nei risultati.
- Permette ulteriori studi sulla funzione genica.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per la trasfezione genica nelle cellule progenitrici neurali umane (hNSPCs).
- Fornisce le basi per future ricerche in neuroscienze.
- Migliora la comprensione del ruolo dei geni nello sviluppo neurale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La trasfezione di cellule staminali/neurali precursori umane (hNSPCs) rimane un collo di bottiglia nella validazione degli obiettivi in neuroscienze a causa dell'efficienza ridotta e della scarsa vitalità ottenute con i metodi convenzionali. Il protocollo di elettroporazione con Nucleofector descritto consente un trasferimento genico affidabile con un'efficienza di trasfezione iniziale del ~35% e stabile del ~70%, favorendo la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio migliora l'affidabilità predittiva nell'analisi dei percorsi e nella validazione funzionale degli obiettivi nei modelli di malattie neurodegenerative.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale di bersagli terapeutici in un sistema neurale umano fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Raggiunge un'elevata efficienza di trasfezione senza i tempi di produzione dei vettori virali né problemi di sicurezza biologica.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio sui bersagli collegando la modulazione genica a fenotipi neurali in un formato scalabile.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativamente misurabili (ad esempio, espressione di GFP) per schermature dose-risposta e fenotipiche.
- Valore operativo: Utilizza parametri di elettroporazione standardizzati e un buffer ottimizzato per ottenere risultati riproducibili tra esperimenti diversi.
- Prontezza del saggio: Produce cellule stabilmente trasfettate adatte allo sviluppo di saggi a lungo termine e a studi sull'interazione con il bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza cellule neurali primarie umane, aumentando la rilevanza per i meccanismi delle malattie umane rispetto alle linee immortalizzate.
- Modellizzazione preclinica: Permette la creazione di modelli neurali isogenici per la validazione di bersagli e studi sul meccanismo d'azione.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Facilita la valutazione precoce degli effetti della modulazione del bersaglio prima di ricorrere a modelli in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di trasfezione Nucleofector si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, grazie alla modulazione genica affidabile in cellule neurali umane rilevanti per la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante un'efficiente sovraespressione o silenziamento genico in hNSPC.
- Screening: Fornisce cellule pronte per il saggio con parametri di trasfezione quantificabili per lo screening di composti e la validazione di bersagli.
- Analisi: Permette letture basate sulla fluorescenza (ad esempio, GFP) per quantificare l'efficienza di trasfezione e correlarla con esiti fenotipici.
- Ricerca traslazionale: Utilizza cellule umane primarie per migliorare la fedeltà traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di trasfezione standardizzata e riutilizzabile per multipli bersagli e programmi nella scoperta nel campo delle neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi grazie a una consegna genica efficiente e riproducibile in cellule neurali primarie umane.
- Valore operativo: Elimina la necessità di produrre vettori virali, riducendo i tempi e gli oneri di sicurezza biologica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo una valutazione funzionale precoce degli obiettivi in un sistema rilevante per l'uomo.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sul rischio riducendo l'ambiguità biologica riguardo al meccanismo dell'obiettivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule primarie e nell'ottimizzazione dell'elettroporazione.
- È subordinato all'accesso al dispositivo Nucleofector e a soluzioni di trasfezione specifiche per il tipo cellulare.
- Necessita della standardizzazione della densità cellulare e della concentrazione del DNA tra diversi utilizzatori e laboratori.
- Comporta la necessità di adattamenti qualora si voglia estendere ad altri tipi cellulari primari, neurali o non neurali.
- È limitato dalla necessità di un'elevata quantità iniziale di cellule e da un trattamento immediato post-trasfezione per mantenere la vitalità cellulare.
