Name: Saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Impara a rilevare l'espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule HEK293T mediante colorazione su cellule vive e microscopia a immunofluorescenza. Questo protocollo permette di studiare GPCR con elevata specificità.

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Ringraziamo i membri della Matsunami laboratorio per la lettura critica di questo manoscritto.

1. Procedimento: La procedura si compone di tre parti completato in un tempo totale di 3 giorni: il trasferimento di cellule, trasfezione e immunocitochimica, un passo effettuato al giorno. Trasferimento e trasfezione delle cellule nei primi due giorni deve essere effettuato in condizioni sterili in una camera a flusso laminare. 1 ° giorno: Trasferimento di cellule HEK293T per test espressione sulla superficie. <ol><li> Trasferimento medio (M10): Mix minimo mezzo fondamentale integrato con il 10% (in volume) siero fetale bovino in confezione sterile. </li><li> Crescere le cellule ad una confluenza desiderata in una piastra di coltura 100mm, a seconda del numero di piatti necessari per impostare. E 'importante per determinare la frazione di cellule da trasferire per evitare cellule sparse o invasi: per esempio, da un 100% confluenti piatto 100 mm, si può trasferire circa il 3% a un piatto da 35 mm di ottenere circa il 30% confluenza nel quest'ultimo. </li><li> Prima di trasferire le cellule, nella camera sterile a flusso laminare, cappotto 22 x 22 mm coperchio scivola in vetro con sterili poli D lisina (1 mg / ml) e inserire una in ogni piatto 35 colture cellulari mm, lato patinato per le cellule placcatura (Figura 1 ). Lasciare che la soluzione a secco per 5 - 10 minuti. Durante questo intervallo, la sorgente UV nella camera di laminare può essere attivata per sterilizzare il copri-oggetto, se lo si desidera. Poli D lisina aiuta le cellule eterologhe aderire al coprioggetto. </li><li> Per trasferire le cellule, aspirare la media esistenti nel piatto 100 mm, lavare con cura aggiungendo 8 ml PBS sterile, aspirare PBS e trypsinize le cellule in 3 mL 0,05% tripsina-EDTA, quando le cellule si staccano dal piatto, blocco di reazione enzimatica ulteriormente da M10 aggiungendo 5 ml. Triturare le cellule e il trasferimento di volume necessari in una provetta sterile conica; centrifugare a 200g per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Aspirare fuori supernatante contenente tripsina-EDTA, lasciando il pellet di cellule intatte. Per trasferire le cellule a 35 piatti mm, aggiungere 1 mL M10 per ogni piatto e triturare dissociare le cellule. Aggiungere 1 ml di cellule risospese ad ogni piatto. Cellule incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Coat 22 x 22 millimetri coprioggetto di vetro con poli D lisina e luogo da un lato rivestito in ogni piatto 35 mm. </li></ol> Giorno 2: Transfection delle cellule HEK293T. <ol><li> 18-24 ore dopo il trasferimento, le cellule sono pronte per la trasfezione del recettore da dosare. Usa recettore e RTP1S clonato nel vettore di espressione mammifero PCI, preparati da colture batteriche con Qiagen Miniprep seguente protocollo Kit descritto prima 4. Utilizzare i recettori che sono N terminali taggati con 20 aminoacidi lungo acido rodopsina epitopo per facilitare immunocolorazione. </li><li> L'uso 1000ng di costruire recettore, 250 ng di RTP1S costruire e 50 ng di proteina verde fluorescente ogni trasfezione. Eseguire la trasfezione con Lipofectamine 2000, come da manuale produttori. </li></ol> 3 ° giorno: Immunocitochimica per visualizzare i recettori delle cellule macchiato di superficie. <ol><li> Prima di iniziare, preparare colorazione e soluzioni di lavaggio e raffreddare a 4 ° C. Colorazione medio: Medium minimo, 45 mL; siero fetale bovino, 5 ml; HEPES (1M), 500 microlitri (concentrazione finale 10 mM); azide di sodio (1,5 M), 500 microlitri (concentrazione finale 15 mm). Soluzione di lavaggio: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 mL (concentrazione finale 10 mM); azide di sodio (1,5 M), 5 mL (concentrazione finale 15 mm). Entrambe le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per il riutilizzo. Preparare le soluzioni di anticorpi diluendo gli anticorpi necessari alla colorazione media 100 volte. </li><li> Inizio immunochimica per la colorazione della superficie per circa 24 recettori olfattivi dopo trasfezione ore. Per eseguire la colorazione delle cellule vive, il set up sperimentale deve essere raffreddato a 4 ° C: riempire un grande contenuto di ghiaccio e tamponare la superficie di ghiaccio per renderlo il più uniforme possibile, posto un vassoio sul ghiaccio e spruzzare con il 70% etanolo. Tagliare un pezzo di parafilm (inferiore alla lunghezza del vassoio) e apporre sul vassoio etanolo spruzzato, per ottenere una superficie liscia. Trasferire il coperchio in vetro contenenti cellule transfettate scivola sul parafilm, uno alla volta, lato cella in alto, utilizzando una pinzetta. Ogni strato di copertura antiscivolo con 100 ul soluzione fredda colorazione primaria, estrusione con cura da un angolo della ricevuta (Figura 2). Dopo stratificazione tutte le polizze di copertura con soluzione di anticorpi, coprire il vassoio per evitare prosciugamento della soluzione in aria. Effettuare incubazione primaria per 45-60 minuti. </li><li> Dopo l'incubazione primaria, trasferire rapidamente scivola coprire la cultura piatti originali 35mm, contenente il supporto. Aspirare i media e aggiungere 2 mL di soluzione di lavaggio refrigerato delicatamente dal bordo del piatto per evitare di perdere le cellule dal vetrino. Aspirare la soluzione di lavaggio e ripetere due volte per completare tre lavaggi. Alla fine del terzo lavaggio, non aspirare la soluzione di wash out. </li><li> Preparare secondaria anticorpi SOLUZIOsui media colorazione e trasferire il coprioggetto dalla soluzione di lavaggio in un livello di parafilm nuova apposta nello stesso cassetto. Anche in questo caso delicatamente estrudere 100 l di soluzione di anticorpi a ogni strato antiscivolo copertina, da un angolo, come l'incubazione primario. Effettuare incubazione secondaria per 30 - 45 minuti e trasferimento al soluzione di lavaggio in originale 35 piatti mm. Ancora una volta, lavare il coperchio scivola tre volte come descritto. </li><li> Aspirare soluzione di lavaggio da ultimo lavaggio e aggiungere 2 mL di paraformaldeide 1% refrigerata. Fissare le cellule in refrigerata soluzione paraformaldeide 1%, in ghiaccio per 15 minuti. </li><li> Montare il coperchio scivola sul vetro microscopio pulito diapositive usando Mowiol reagente di montaggio, con il lato cellula verso il basso e cautela escludere tutte le bolle d'aria (Figura 3). Una volta che si asciuga all'aria Mowiol, lavare scivola coprire delicatamente con l'aggiunta di acqua distillata sulla superficie ed aspirando immediatamente. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Layer ogni coprioggetto con 100 ul soluzione fredda colorazione primaria. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Montare il copri con la parte delle cellule verso il basso microscopio vetro pulito diapositive usando Mowiol reagente di montaggio. </li></ol> 2. Rappresentante dei risultati: Colorazione delle cellule vive permette di visualizzare le proteine ​​sulla superficie delle cellule, sulla trasfezione di recettori con accompagnatori (in questo caso Olfr62 recettore olfattivo, con RTP1S proteina recettore trasporto) (Figura 4). Colorazione della superficie delle cellule dei recettori è caratterizzata da modello puntata della colorazione (Figura 4B, nel riquadro). Colorazione effettuata inappropriato può determinare un aumento del rumore, rendendo difficile per l'osservatore di distinguere la colorazione reale superficie da rumore. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Transfection Figura 4. Dei recettori con accompagnatori consente la visualizzazione delle proteine ​​sulla superficie delle cellule mediante colorazione delle cellule vive. Trasfezione del recettore odorizzante Olfr62 solo (A) e la transfezione di Olfr62 con chaperone RTP1S (B). Livelli di espressione GFP Come controllo della trasfezione (A 'e B').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ogni passo deve essere effettuata con cura per garantire la colorazione della superficie prominente e distintivo. L&#39;intero processo di colorazione deve essere eseguita a freddo (su ghiaccio), e il vassoio su cui sono previsti slittamenti di copertura deve essere raffreddato prima dell&#39;uso per assicurare cellule rimanere in vita. Inoltre la fissazione avviene al termine del processo di colorazione della superficie. Ciò è in netto contrasto con la colorazione interna in cui la fissazione precede colorazione a perm...

<table><tbody><tr><td>Coprioggetto 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo essenziale minimo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>Con L glutammato, sale di Earle&amp;rsquo;s e bicarbonato</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) 1X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>Con cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>Poli D Lisina Idrobromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Il mondo vivido degli odori è riconosciuto dal senso dell&#39;olfatto. Olfatto nei topi è mediata da un repertorio di circa 1200 recettori delle proteine ​​G accoppiate (GPCR) 1 che sono postulate di legare molecole odoranti volatili e convertendo il segnale extracellulare in un segnale intracellulare mediante accoppiamento con proteine ​​G Gαolf. Legame del odoranti ai recettori si pensa di seguire una regola combinatoria, cioè, un odorizzante può legare i recettori diversi e un recettore può legare odori diversi a vari livelli 2. Biochimiche, di segnalazione e studi di binding ligando sono stati opportunamente eseguiti per la maggior parte GPCR utilizzando cellule eterologhe. Tuttavia l&#39;uso di cellule eterologhe per lo studio dei recettori olfattivi, è stato precluso per molto tempo da quando il transfezione non sono riusciti ad esportare verso la superficie. Saito et al hanno dimostrato singolo passaggio del recettore di membrana Il trasporto delle proteine ​​(RTP) accompagnatori famiglia mostrano maggiore espressione nei neuroni olfattivi e sensoriali agiscono come accompagnatori di recettori olfattivi traffico in superficie in cellule eterologhe, quando co transfettate insieme 3. Per effettuare test biochimici per i recettori utilizzando cellule eterologhe, si deve prima determinare se il recettore mostra espressione robusta superficie nella linea cellulare. Questo può essere dosati con iperespressione del recettore con i RTP1S chaperone seguita da cellule vive colorazione fluorescente di etichettare il dominio extracellulare o di un tag nel dominio extracellulare in esclusiva. Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l&#39;espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.

Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l&#39;espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.

Saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe

Il vivace mondo degli odori è riconosciuto dal senso dell'olfatto. L'olfatto nei topi è mediato da un repertorio di circa 1200 recettori accoppiati a proteine G...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come possa essere rilevata l'espressione superficiale di recettori chemosensoriali mediante colorazione di cellule vive in cellule HEK 293T; ciò viene ottenuto innanzitutto seminando le cellule su coprivetri rivestiti con poli-D-lisina in piatti di coltura. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trasfettare il DNA nelle cellule HEK 293T. Il terzo passaggio della procedura prevede l'esecuzione della colorazione di cellule vive utilizzando anticorpi primari e secondari coniugati con fluorocromo 4.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel fissare le cellule colorate e montare i coprioggetti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione dei recettori sulla superficie delle cellule mediante microscopia a fluorescenza immunologica. Questo metodo ci permette di rilevare recettori chemosensoriali esportati sulla superficie cellulare di cellule eterologhe come le HK 2 93 T. Una dimostrazione visiva di questo metodo indicherà i passaggi chiave che devono essere seguiti con attenzione per mantenere vive le cellule durante l'autocolorazione cellulare.Coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero trovare difficoltosi passaggi come il trasferimento, la manipolazione e il montaggio del vetrino coprioggetto. Tuttavia, dopo alcune prove, la tecnica diventa semplice. Con un protocollo modificato che utilizza una colonna cgen, purificare il DNA plasmatico del ricevitore e del ricevitore. Il trasporto della proteina RT TP uno s clonata in un vettore di espressione PCI assicura che, per la colorazione immunoistochimica, il ricevitore rivestito sia marcato in posizione terminale con un epitopo lungo 20 amminoacidi per facilitare l'adesione delle cellule.Contrassegnare le lamelle di vetro con un milligrammo per millilitro. Successivamente, posizionare le lamelle in piastre per colture cellulari da 35 millimetri, con il lato rivestito rivolto verso l'alto, e farle asciugare all'aria all'interno della camera a flusso laminare sterile. Piastrare le cellule HT K 2 9 3 T a una densità di circa il 30% in un millilitro di mezzo M 10, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria intrappolate tra la lamella e la piastra per colture cellulari. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 18-24 ore. Per ogni trasfezione, preparare un mix di DNA composto da 1000 nanogrammi di costrutto del recettore, 250 nanogrammi di costrutto RTP one s e 50 nanogrammi di costrutto GFP.Secondo le istruzioni del produttore, trasfettare le cellule con Lipofectamine 2000. Preparare il mezzo di colorazione aggiungendo azide di sodio e Hippeas a M10. Questo può essere conservato a quattro gradi Celsius per diversi mesi.Successivamente, preparare un buffer di lavaggio contenente azide di sodio 15 millimolare ed heis 10 millimolare. In HBSS freddo, il buffer di lavaggio può essere conservato a quattro gradi Celsius per diversi mesi. Per eseguire la colorazione in condizioni fredde, utilizzare un vassoio con parfum e porlo sul ghiaccio per cinque minuti.Con il lato delle cellule rivolto verso l'alto, trasferire le lamelle di vetro contenenti le cellule transfezionate al paraform dal bordo della lamella. Aggiungere con attenzione 100 microlitri di anticorpo primario freddo diluito nel mezzo di marcatura. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare ora le cellule nelle piastre di coltura originali da 35 millimetri aggiungendo e aspirando alternativamente soluzione di lavaggio fredda.Ripetere due volte. Allo stesso modo, incubare il SI con l'anticorpo secondario coniugato per 30 minuti. Eseguire i lavaggi tre volte nelle piastre da 35 millimetri.Infine, fissare le cellule con una soluzione fredda di paraformaldeide al 1%, avendo cura di escludere tutte le bolle d'aria. Montare le coprioggetti con il lato delle cellule rivolto verso il basso su vetrini per microscopia, utilizzando mole; risciacquare la superficie delle coprioggetti con acqua distillata per rimuovere i depositi salini.Tipicamente, come nel caso dell'OL FFR 62 e delle RTP, la colorazione di un recettore sulla superficie cellulare è caratterizzata da un aspetto puntiforme del segnale fluorescente proveniente dall'anticorpo coniugato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per colorare da 32 a 40 coprioggetti in appena due ore e mezza o tre ore. Durante l'esecuzione di questa procedura con più coprioggetti, è importante trasferire e iniziare l'incubazione con l'anticorpo un coprioggetto alla volta per evitare che le cellule si secchino.

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Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoraggio in vitro in tempo reale dell'attivazione del recettore odorizzante da parte di un odorizzante in fase vapore. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra il metodo per monitorare l'attivazione in tempo reale dei recettori degli odori nelle cellule di mammifero ricombinanti utilizzando la misurazione della luminescenza. Il legame con gli odori innesca l'attivazione delle proteine G e la produzione di cAMP, attivando le proteine glosensori che emettono...

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