Superfici Micropatterned per studiare le interazioni acido ialuronico con le cellule tumorali

L'invasione e la progressione del cancro coinvolgono un fenotipo cellulare modale, soggetto a una regolazione complessa da parte di fattori di crescita, citochine e componenti della matrice extracellulare presenti nel microambiente tumorale. L'acido ialuronico, o HA, è un componente stromale della matrice extracellulare noto per facilitare la progressione tumorale potenziando l'invasione, la crescita e l'angiogenesi attraverso l'interazione con il suo recettore di superficie cellulare. L'interazione dell'HA con il recettore CD44 induce eventi di segnalazione che promuovono la crescita, la sopravvivenza e la migrazione delle cellule tumorali, aumentando così la diffusione metastatica. Questo sistema consente di studiare l'adesione, la migrazione e la crescita delle cellule tumorali su HA esogeno.

Viene utilizzata la fotolitografia standard per fabbricare uno stampo elastomerico con microstruttura, che viene successivamente impiegato per creare un reticolo ordinato di molecole di aminosilano su substrati di vetro. Successivamente, viene eseguita una chimica a base di carbodiimide per fissare covalentemente l'acido ialuronico (HA) all'amino silano strutturato in microstruttura. In questo modo si generano microstrutture di acido ialuronico, su cui possono essere seminate cellule tumorali in coltura; le interazioni tra le cellule tumorali e l'acido ialuronico esogeno possono quindi essere visualizzate mediante microscopia ottica, tecniche di imaging ad alta risoluzione come la microscopia elettronica a scansione o la microscopia a immunofluorescenza.

Il metodo per la creazione di superfici microstrutturate in acido ialuronico presentato in questo articolo video può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro, ad esempio chiarire ulteriormente il ruolo dell'acido ialuronico esogeno nella progressione tumorale. Per realizzare uno stampo in polimetil silazano o PDMS, che verrà utilizzato per imprimere vetrini con ha, iniziare prelevando un wafer di silicio nuovo con una pinzetta.

Poi sopra un lavandino del laboratorio. Utilizzare una bottiglia per lavaggi per risciacquare la wafer con etanolo e asciugarla con un getto d'aria. Spegnere le luci della stanza.

Quindi, utilizzando pinzette, trasferire la piastrina a un spin coater usando una pipetta di trasferimento e coprire almeno l'80% della superficie della piastrina con resist negativo SU 2025, applicato mediante spin coating per 10 secondi a 600 giri al minuto. Successivamente, proseguire per 30 secondi a 3000 giri al minuto. Trasferire quindi la piastrina rivestita con il resist fotosensibile su una piastra riscaldata e sottoporla a pre-cottura a 95 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, rimuoverla dalla piastra riscaldata e lasciarla raffreddare per un minuto.

Posizionare una maschera prefabbricata con il modello desiderato sulla fitta ricoperta di fotoresist e irraggiare con raggi UV per 20 secondi. Successivamente, trasferire la fitta su una piastra riscaldata e procedere con una cottura a 110 gradi Celsius per sei minuti.

Accendere le luci e rimuovere la piastrina dalla piastra riscaldata. A questo punto dovrebbero essere visibili dei motivi distinti con una pipetta di trasferimento. Risciacquare attentamente la piastrina con il rivelostrante SU eight dopo tre risciacqui con la soluzione rivelostrante, quindi risciacquare con etanolo.

Se è presente un residuo bianco, ripetere il risciacquo con la soluzione sviluppatrice del photoresist oppure immergere semplicemente la wafer nella soluzione sviluppatrice per due minuti, quindi risciacquare nuovamente con etanolo, lavare con acqua e asciugare con un flusso d'aria in una grande barca di siero. Mescolare la soluzione elastomerica di PDMS e l'agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1; per la wafer mostrata qui, sono sufficienti 22 grammi. Versare in un tubo da centrifuga e centrifugare a 900 giri al minuto per cinque minuti.

Per rimuovere eventuali bolle d'aria, posizionare il wafer strutturato in una piastra di Petri delle dimensioni adeguate. Versare una quantità sufficiente di soluzione di PDMS per coprire completamente il wafer con uno spessore di circa un quarto di pollice. Se sono presenti bolle sulla superficie del wafer, collocarlo in un essiccatore sotto vuoto fino alla loro scomparsa.

Lasciare polimerizzare tutta la notte a temperatura ambiente per formare un timbro elastomerico complementare. Se il PDMS non è completamente polimerizzato dopo 12 ore, collocare la wafer in un forno a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere con attenzione il PDMS dalla wafer.

Quindi, utilizzando un rasoio, tagliare il timbro alla dimensione desiderata. Posizionare il timbro in un becher di vetro contenente etanolo, preferibilmente all'interno di un supporto di plastica, e sottoporre a sonificazione per 15 minuti. Le wafer possono essere utilizzate più volte per creare nuovi timbri elastomerici al fine di immobilizzare covalentemente ha su superfici di vetro in aree definite.

Iniziare pulendo tutte le lamelle da utilizzare in un pulitore al plasma seguendo le istruzioni riportate nel testo allegato. Dopo aver pulito le lamelle di vetro, utilizzare pinzette per rimuoverle dal pulitore al plasma. Posizionare le lamelle in una piastra di Petri di plastica e metterle da parte per un uso successivo.

Successivamente, preparare la soluzione di amino clina da stampare sulla lametta di vetro per legare l'acido ialuronico in un tubo da centrifuga in polistirene da 15 millilitri. Preparare una soluzione fresca al 3% volume su volume di tre amino propil trimetossi clina o A-P-T-M-S in etanolo al 95% volume su volume, per un volume totale di cinque millilitri; lasciare reagire la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente.

Durante questo periodo, l'A-P-T-M-S viene convertito per idrolisi in un ciol. Successivamente, toccando esclusivamente i lati, posizionare il motivo del tampone in PDMS su un portamorsetto per spin coater. Utilizzare una pipetta di trasferimento per ricoprire la superficie del motivo con A-P-T-M-S.

Quindi, eseguire un rivestimento a centrifuga della superficie dello stampo con A-P-T-M-S a 3.500 giri/min per 30 secondi. Dopo aver rimosso lo stampo in PDMS dalla centrifuga, capovolgerlo in modo che la faccia con il motivo sia rivolta verso il basso, appoggiare un'estremità dello stampo in PDMS al centro del vetrino e premere delicatamente affinché l'intero stampo entri in contatto con il vetrino per un minuto. Successivamente, rimuovere con cautela lo stampo in PDMS e lasciare riposare il vetrino con il motivo di A-P-T-M-S a temperatura ambiente.

Dopo 30 minuti, risciacquare la superficie del modello con etanolo ed asciugare con un getto d'aria sonica. Sonicare il tampone in PDMS per 15 minuti per rimuovere qualsiasi eccesso di A-P-T-M-S. Quindi posizionare i vetrini su una piastra riscaldante per un'ora a 115 gradi Celsius per riscaldare le superfici ed eliminare l'acqua in eccesso.

Risciacquare con etanolo e asciugare con aria utilizzando pinzette. Trasferire il vetrino con il modello in una capsula di Petri di vetro. Utilizzare una pipetta Pasteur per ricoprire completamente il vetrino di vetro con una soluzione di polietilenglicole o soluzione di peg cline appena preparata, che fungerà da regione non adesiva intorno ai modelli.

Dopo un'incubazione di 45 minuti a 75 gradi Celsius, versare via la soluzione salina in eccesso contenente PEG. Successivamente, tenendo il vetrino con pinzette, risciacquare la superficie dei vetrini stampati con toluene e quindi nuovamente con acqua, asciugando con un flusso d'aria. Posizionare i vetrini in una scatola per vetrini umidificata.

Quindi posizionare la scatola all'interno di una cappa biologica e accendere la lampada UV per un'ora per eseguire l'irradiazione germicida. Procedere all'interno della cappa biologica da questo momento in avanti. Per mantenere la sterilità all'esterno della cappa, preparare una soluzione acquosa sterile di HA da un millilitro costituita da 10 millimolari.

Un etile tre tre dimetilammino propil carbimide o EDC cinque millimolari e idrossi CIN aide e 50 microgrammi per millilitro. L'EDC marcato con fluorescenza sterile è un agente di cross-linking di lunghezza zero che reagisce con i gruppi carbossilici dell'acido ialuronico (HA) formando intermedi reattivi verso le ammine. Poiché questo intermedio è sensibile all'idrolisi, si aggiunge NHS per aumentare l'efficienza della reazione del carbodiimide.

Successivamente, applicare aliquote di 200 microlitri di soluzione sterile di HA sul vetrino stampato fino a coprire l'area stampata. Chiudere quindi la scatola dei vetrini per proteggerli dalla luce. I substrati stampati devono essere lasciati in tranquillità sotto cappa per 16-24 ore, durante le quali la soluzione di HA interagisce con lo stampo microscopico di A-P-T-M-S-A, formando un legame MI stabile tra l'intermedio di HA e l'ammina primaria dell'A-P-T-M-S.

Il giorno successivo utilizzare una pipetta Pasteur APA per aspirare la soluzione di acido ialuronico. Lavare i vetrini con PBS, quindi coprire la superficie con BSA al 1% in PBS per un'ora. La superficie è ora pronta per la coltura cellulare.

Posizionare le superfici con micropattern di HA in una piastra di Petri sterile per la coltura su superfici con micropattern di HA. Seminare sospensioni cellulari singole di cellule tumorali con densità comprese tra 0,4 e 1 × 10⁶ cellule tumorali per 18,75 cm² di superficie di vetro in un millilitro di mezzo cellulare, coprendo attentamente la superficie del vetrino; posizionare quindi le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di anidride carbonica. Prestare attenzione a non far fuoriuscire il mezzo; l'adesione cellulare dovrebbe verificarsi entro 24 ore e può essere osservata mediante microscopio ottico invertito.

Le superfici di coltura cellulare possono essere mantenute fino a cinque giorni. In condizioni standard di incubatore, sostituire il mezzo ogni due giorni. La morfologia e la crescita cellulare possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico invertito.

Possono quindi essere applicati ulteriori saggi cellulari per analizzare le risposte alla superficie di HA nell'esempio mostrato qui. Superficie del pattern di HA visualizzata mediante microscopio a fluorescenza e immagine. L'analisi dell'intensità di fluorescenza dimostra il demobilizzo del pattern di ha.

Le superfici con micropattern di HA permettono lo studio delle interazioni delle cellule tumorali con l'HA esogena. Qui viene mostrata l'adesione delle cellule tumorali su superfici con micropattern di HA. Sia le cellule di carcinoma del colon che quelle del carcinoma mammario hanno aderito preferenzialmente alle aree con HA dopo 24 ore di coltura. L'analisi delle interazioni tra cellule coltivate e superfici con HA immobilizzato può essere effettuata mediante imaging ad alta risoluzione utilizzando la microscopia elettronica a scansione.

In questo micrografo al microscopio elettronico a scansione è possibile osservare l'interazione tra cellule tumorali del colon e HA; un ingrandimento maggiore è mostrato a destra. Qui vengono mostrate cellule tumorali del seno coltivate su superfici di HA; nuovamente, un ingrandimento maggiore è riportato a destra. Quest'analisi dimostra chiaramente la presenza di protrusioni adesive che favoriscono la diffusione delle cellule tumorali sui microdisegni di HA.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare superfici microstrutturate con acido ialuronico e applicarle per lo studio della risposta delle cellule tumorali.