La stimolazione meccanica delle cellule staminali Utilizzando ciclica deformazione uniassiale

Ciao, sono Song Li. Sono professore associato del Dipartimento di Bioingegneria all'Università della California, Berkeley. E io sono Kyle Kapinsky. Sono un dottorando nel campo della bioingegneria presso l'Università della California, Berkeley.

Oggi presenteremo un protocollo per la stimolazione meccanica di cellule staminali mediante deformazione ciclica UNI assiale. La ricerca nel nostro laboratorio si concentra sull'ingegneria cellulare e tissutale, in particolare nel sistema cardiovascolare. Siamo interessati alla biologia meccanica delle cellule staminali poiché esistono alcune potenziali applicazioni.

Uno riguarda il desiderio di comprendere l'effetto dei fattori meccanici sullo sviluppo, ad esempio sullo sviluppo embrionale. Due, siamo interessati al controllo della differenziazione delle cellule staminali in vitro o in un reattore intestinale. E terzo, siamo interessati al modo in cui le cellule staminali rispondono ai fattori meccanici cardiovascolari in vivo, ad esempio dopo il trapianto.

Pertanto, per studiare tutti questi aspetti, disponiamo di un bioreattore appositamente progettato in cui possiamo seminare cellule su membrane elastiche e successivamente stirare tali membrane per un periodo di tempo definito, con una deformazione e una velocità di deformazione specifiche. Ora vi illustreremo tutte le fasi necessarie per impostare questo protocollo. Utilizzando un sapone da laboratorio, qualsiasi detergente va bene, applicate il sapone su entrambi i lati della membrana e strofinate bene, in modo da rimuovere eventuali residui o detriti presenti sulla superficie. Qualsiasi cosa che potrebbe interferire con le cellule.

E lo faccio semplicemente a mano. Poi, una volta che ritengo di aver pulito abbastanza bene entrambi i lati, lo risciacquo ancora una volta con acqua. Da quel momento voglio assicurarmi che sia davvero sterile e che vengano rimossi tutti i micro-particellati.

Prenderò questa membrana e la metterò in un becher con alcol al 70%. Lasciatela immergere completamente. A questo punto, potete prendere l'intero becher e metterlo in un bagno ultrasuoni, lasciando ultrasuonare per 10 minuti.

Ora che abbiamo posizionato la membrana micropatterning in una piastra quadrata, dobbiamo verificare che il lato con il motivo sia effettivamente rivolto verso di noi. Prenderò quindi un flacone spray con alcol e spruzzerò leggermente il lato superiore della membrana. Ora potete vedere che il liquido scorre verso il basso, mettendo in evidenza le scanalature.

Questo conferma che il lato del motivo è rivolto verso l'alto e che è in orientamento corretto. Abbiamo ora completato il passaggio di UV notturno e si possono vedere tutte le camere e tutti i telai per le camere; le membrane stesse sono nel capo aspirante e sono rimaste esposte alla luce UV nel capo per tutta la notte. Questo è il nostro passaggio finale di sterilizzazione.

Ora, quello che voglio fare è sottoporre al trattamento al plasma tutte le membrane; preleverò una o due membrane alla volta, mantenendole nei loro piatti sterili, e le trasporterò alla macchina per il plasma. Ora che la pressione del vuoto si è rilasciata, posso rimuovere la camera. Ancora una volta, questa operazione non è completamente sterile, ma la utilizzerò nuovamente in seguito.

Pertanto, lavorando relativamente in fretta in modo che il plasma rimanga al suo posto, si consiglia di utilizzare una pinzetta. E ancora una volta, questo è molto importante: assicurarsi di non far cadere la membrana né di modificarne l'orientamento.

Quindi al momento solo la superficie superiore è stata trattata al plasma e la rimetterò nella mia piastra relativamente sterile con il lato al plasma rivolto verso l'alto, rimetterò il coperchio e poi la trasporterò nell'incubatore. Ora che la membrana è stata trattata al plasma, la rimetterò nell'incubatore e la tratterò con gelatina al 2%, peso per volume.

Si può notare che la soluzione continua a diffondersi in linea con il modello. È inoltre molto idrofila poiché è stata trattata al plasma. Di conseguenza, la soluzione si espande invece di formare gocce; se accidentalmente si capovolgesse la membrana, la soluzione si raccoglierebbe immediatamente in superficie e si capirebbe di stare lavorando sul lato sbagliato.

Pertanto, assicurarsi che la soluzione si distribuisca uniformemente. Dopo aver eseguito questa operazione per tutte le membrane, chiudere semplicemente il capo aspirante e accendere la luce UV per 30 minuti. A questo punto, la membrana è stata esposta alla luce UV con gelatina sulla superficie per mezz'ora, tempo sufficiente affinché la gelatina venga assorbita dalla superficie.

A questo punto voglio lavare la membrana due volte con PBS sterile e di solito aggiungo circa 10 ml in una piastra quadrata, muovendoli delicatamente con la mano in questo modo, cercando di evitare di toccare la superficie della membrana, quindi aspiro il PBS. Ripeterò questa operazione un'altra volta e, dopo il secondo lavaggio, lascerò la membrana immersa nel PBS, il che aiuta a lubrificarla, rendendo più facile il suo assemblaggio nella camera. Se si lascia la membrana asciutta, aumenta la probabilità che si strappi o si rompa in qualche modo.

Questa è quindi la seconda fase di lavaggio. Aspirare nuovamente una volta per assicurarsi che tutta la gelatina sia stata rimossa dalla membrana. Quindi lasciare la membrana in circa 10 millilitri di PBS sterile.

E se si lavora con più di una membrana, ripetere questo processo per ciascuna. Successivamente si sarà pronti per il montaggio. Prendere una delle cornici, che in realtà è composta da due pezzi, ma di solito sono già preassemblati.

Quindi un pezzo è il pezzo a T qui, e l'altro pezzo fa parte della struttura, che dovrà sostenere la membrana stessa. Esiste quindi un secondo pezzo della struttura che ha questo aspetto. Come si può notare, presenta una scanalatura.

È qui che la guarnizione verrà inserita per mantenere la membrana in posizione. Il secondo pezzo presenta una seconda scanalatura per un'altra guarnizione, in modo da fissare entrambi i lati della membrana. Prendendo questo pezzo, posizionarlo sul telaio in questo modo, capovolgere il telaio e prendere una delle viti per autoclave.

Inserire la vite nella parte superiore; è possibile avvitarla leggermente a mano prima, quindi utilizzare una delle chiavi esagonali per serrare completamente. A questo punto ho un telaio assemblato e la membrana verrà posizionata sul lato inferiore in questo modo, come se la mia mano fosse la membrana. Ciò significa che desidero il lato che è o stampato oppure trattato al plasma e con gelatina.

Voglio che sia rivolto verso l'alto in questo modo. Quindi, se per errore lo capovolgo e il lato con la gelatina è ora rivolto verso il basso, ciò rappresenterà un grosso problema per l'esperimento. Perciò, quando lo assemblo, voglio che il lato con il motivo sia rivolto verso l'alto in questo modo, ma lo assemblerò capovolto.

Quindi, quando rimuovo la membrana, assicurarsi che il lato con il motivo sia rivolto verso il basso. Prendendo una membrana, ricordare che al momento il lato con il motivo è rivolto verso l'alto. La estraggo dal PBS e la posiziono sulla griglia in questo modo.

Attualmente entrambi i lati sono pressappoco equivalenti. È possibile toccare i bordi della membrana con le dita, ma si consiglia di non toccare il lato opposto. Ora che l'ho capovolta in questo modo, il lato con il motivo è rivolto verso il basso, come desidero, per facilitare il montaggio; prendere due guarnizioni e posizionarle nel PBS.

Di solito la faccio scorrere avanti e indietro. Bagnando così l'intera guarnizione, la lubrifico esattamente come ho fatto con la membrana in PBS. Se si utilizzano guarnizioni asciutte su una membrana asciutta, è molto più probabile che qualcosa si arrotoli.

Quindi, il modo in cui inizio consiste nel tirare leggermente un lato un po' più lontano rispetto all'altro perché, quando si inserisce la guarnizione, se inserisco la guarnizione da questo lato, tirerà la membrana in questa direzione, e poi questo lato diventerà un po' più corto. Quindi, iniziare con un'estremità leggermente accorciata qui. Prendere una guarnizione e posizionarla in modo che risulti abbastanza uniforme su entrambi i lati.

E premendo con una pressione uniforme, spingere verso il basso utilizzando i pollici o le punte dei pollici, ma non le unghie in questa fase, poiché si rischierebbe di tagliare accidentalmente la membrana e strapparla. Quindi, una volta inserito, prendo effettivamente il retro della pinzetta e lo uso per premere verso il basso. Ancora una volta, fare attenzione a non spingere troppo forte o a scivolare e toccare la membrana, perché si potrebbe tagliarla o strapparla accidentalmente, rendendo necessario sostituire la membrana e ricominciare da capo.

Ora un lato è inserito, ma l'altro lato è ancora sciolto. Quindi ruotatelo, prendete la seconda guarnizione, assicuratevi che sia bagnata e posizionatela sopra esattamente come prima. Poi di solito uso la pinzetta per afferrare effettivamente la membrana e tirarla leggermente, perché se è troppo lenta, ci sarà molta mollezza nella membrana e sarà impossibile vedere le cellule.

Quindi si desidera che sia teso, ma non eccessivamente, in modo da non allungarlo. Se fosse già pre-allungato, influirebbe sull'esperimento perché la membrana sarebbe già sotto tensione e si potrebbe strappare; si aggiungerà una leggera tensione premendo la guarnizione verso il basso. A questo punto, appare abbastanza teso.

È forse un po' lento da un lato, ma lo sistemerò tra un momento. E ancora, applicando una pressione abbastanza uniforme, premi semplicemente con le punte dei pollici o delle dita. A questo punto puoi notare che un lato è piuttosto teso.

È dritto per tutta la larghezza fino al lato opposto. C'è un po' di mollezza nella membrana proprio in quel punto, e tende ad arricciarsi leggermente. Quindi quello che farò è premere completamente questo lato, proprio come prima, facendolo lentamente e in modo uniforme lungo tutta la guarnizione.

E si può vedere che ciò ha eliminato la maggior parte del gioco. Abbiamo appena terminato l'esposizione UV di 30 minuti dei lati posteriori dei telai e delle membrane, e ora vogliamo capovolgere tutte le membrane in modo che possano essere sottoposte a UV sul lato anteriore, in modo che tutto risulti completamente sterile. A questo punto, inoltre, assegneremo determinate camere come soggette a trazione o come controlli.

Quindi potete vedere che ho già etichettato le mie camere con controllo stiramento, controllo stiramento. E le camere di stiramento richiedono una vite aggiuntiva. Ho quindi posizionato la vite aggiuntiva per la camera di stiramento sopra la parte inferiore del coperchio qui.

Quindi prendete il telaio e capovolgetelo. E se si tratta di una camera di trazione, significa che devo sostituire alcune viti. Se invece si tratta di una camera di controllo, tutto rimane invariato.

E quando questa barra si muove avanti e indietro, la membrana in sé non si allunga, ma si sposta semplicemente insieme alla barra. Se voglio che la membrana si allunghi, devo fissare la seconda parte del telaio a questo estremo sul fondo della camera in modo che rimanga ferma. E poi, quando la barra si muove solo in questa parte del telaio, essa si sposterà avanti e indietro.

Per fare ciò, prendere la vite aggiuntiva e inserirla nel foro della vite in questo pezzo del telaio. Utilizzare la chiave esagonale e serrare la vite. Non stringere eccessivamente, poiché queste camere in polisulfone sono leggermente fragili; occorre serrare appena abbastanza da impedire che questo pezzo del telaio si sposti.

Una volta inserita la prima vite, è possibile svitare questa vite, che teneva unite le due parti del telaio, facendo attenzione a non far cadere la vite sulla membrana poiché potrebbe danneggiare parte della gelatina che è stata seminata. Pertanto, una volta che risulta sufficientemente allentata, rimuovere la chiave esagonale, afferrare la vite con le pinzette e posizionarla nel secondo foro per la vite. Quindi utilizzare nuovamente la chiave esagonale e serrare la seconda vite.

Quindi, una volta che questo pezzo di telaio è fissato con le due viti, ho una camera predisposta per la trazione. Quando questa barra si muove avanti e indietro attraverso la macchina per la trazione, si può vedere che la membrana stessa si allungherà effettivamente. Mi piace fare questa operazione alcune volte per assicurarmi che non ci siano problemi con la mia membrana.

Se per qualche motivo c'è una crepa e successivamente la membrana si strappa, ora lo saprò prima che l'esperimento inizi e potrò inserire una membrana diversa. Quindi sposto questa da parte, prendo la successiva e, in questo caso, è etichettata come camera di controllo. Pertanto, per la camera di controllo, tutto ciò che devo fare è capovolgerla.

Ora, quando viene inserito nella macchina, si muoverà avanti e indietro senza allungarsi. Ripetere quindi il processo per il numero di camere e membrane disponibili. Ognuna funge da controllo dello stiramento; quindi chiudere il coperchio ed esporre le superfici superiori delle membrane alla luce UV per 30 minuti.

Abbiamo appena terminato di esporre a raggi UV tutte le camere e le superfici superiori dei telai nelle membrane per 30 minuti. Ora tutto è sterilizzato e assemblato, e siamo pronti per seminare le cellule. In questo caso, sto seminando cellule staminali mesenchimali, prelevandole da piastre da 10 centimetri.

Quindi, per ogni membrana, specialmente se sto utilizzando una membrana con un modello, come in questo caso, è possibile seminare approssimativamente la zona quadrata in cui è presente il modello. Voglio seminare soltanto su quest'area strutturata. Se si utilizza una membrana senza modello, si desidera comunque seminare in un'area pressappoco corrispondente, in modo da non avvicinare troppo il liquido ai bordi.

Se il liquido è troppo vicino ai bordi, può fuoriuscire e le cellule moriranno prima che tu possa effettivamente seminarle. E nell'area in cui le stai seminando, devi mettere la quantità appropriata di cellule. Quindi, quando eseguo l'esperimento, voglio che quell'area sia abbastanza confluenziale.

Quindi, se uso una piastra da 10 centimetri, desidero circa un terzo di una piastra confluenza in quella superficie. E in questo caso, per le cellule staminali mesenchimali, si tratta di circa 250.000 cellule. Il numero varierà a seconda del tipo cellulare utilizzato.

Quindi ho già staccato le mie cellule dalla piastra e le ho risospese nel volume appropriato. E voglio aggiungere un millilitro di soluzione cellulare su ciascuna membrana. In questo caso, ho circa 250.000 cellule staminali mesenchimali per millilitro di soluzione.

Quindi uso un P1000, assicurandomi che la soluzione sia. Allora aspira e rilascia alcune volte, prelevando un millilitro nella pipetta, e voglio assicurarmi di seminare solo in quella zona. Perciò semino molto lentamente, utilizzando piccole gocce sulla zona strutturata.

E in effetti si può notare che, poiché si tratta di un modello, si formano piccole ellissi in questa direzione perché in realtà vengono rilevati quei solchi. Quindi non sono cerchi completi. In questo caso, hanno una forma più ellittica.

E poi osservo tutta questa zona, senza avvicinarmi troppo ai bordi per il momento. Non voglio allontanarmi troppo e finire di espellere tutta la soluzione dalla mia pipetta. Successivamente uso la pipetta per distribuire effettivamente la soluzione verso i bordi, cercando di non superarli.

Non voglio alcuna cellula nell'area non passata, ed è un po' difficile raggiungere il bordo più vicino a voi. Di solito ruoto con attenzione questo intorno e raggiungo l'ultimo bordo. In questo modo le cellule dovrebbero distribuirsi in modo abbastanza uniforme.

Ora sono tutti seduti. Ma bisogna fare attenzione a non far cadere alcuna cellula. Quindi si raccomanda di non passare la mano sopra e di non muoverla troppo velocemente.

E poi lo sposto nuovamente fuori dalla zona di lavoro. E voglio coprirlo e semplicemente sollevare i semi cellulari sulla superficie. Per coprirlo, si utilizza questo coperchio che presenta effettivamente due fori diversi.

C'è un foro più profondo da questo lato e uno più superficiale da quest'altro lato che permette l'ingresso dei gas. È necessario assicurarsi che quello più profondo sia allineato con questa parte a T qui. In caso contrario, risulterà troppo stretto se si utilizza quello più superficiale.

Posizionandolo in questo modo, verrà coperta l'intera camera. Quindi è necessario ripetere il procedimento con tutte le camere rimanenti e lasciare il tutto nell'incubatrice per 30 minuti, in modo che le cellule possano depositarsi sul fondo e iniziare ad aderire alle membrane. Successivamente, si devono sigillare tutte le camere con del nastro e trasferirle nell'incubatrice in modo che possano rimanere in posa per un'ulteriore ora e aderire completamente alle membrane.

Ok, abbiamo appena terminato di lasciare le cellule sulle membrane per mezz'ora. Ora voglio esporre le cellule a 37 gradi e al 5% di CO2, condizioni presenti all'interno dell'incubatore. Pertanto, devo trasferire il campione dalla cappa all'incubatore.

E per fare ciò, è sufficiente prestare molta, molta attenzione a non inclinare le camere in alcuna direzione, altrimenti la soluzione cellulare potrebbe scivolare via. In tal caso, fondamentalmente, sarebbe necessario ricominciare da capo. Ora che le cellule sono state nella camera nell'incubatrice per un'ora, si sono fissate saldamente alla superficie.

A questo punto, ho rimosso la camera dall'incubatore e l'ho riposizionata con attenzione nella cappa, trasportandola molto accuratamente, proprio come prima, per evitare di versare mezzo dalla membrana. È necessario aggiungere 20 mL di mezzo nella camera di stiramento.

E in questo caso, utilizzo una combinazione speciale di terreno perché è leggermente suscettibile a contaminazioni; è stato progettato appositamente per evitarle. Sto usando DM più il 10% di FBS più l'1% di penicillina e streptomicina, e in aggiunta l'1% di fungizone per prevenire la crescita di funghi. Prelevando 20 ml di terreno, li aggiungerò con attenzione alla camera di trazione.

Si può osservare che il mezzo non è caduto dalla membrana stessa, ma è stato aggiunto alla fine della camera qui, in modo che il mezzo passi prima sotto la membrana e poi sopra la sua superficie. Eseguire l'operazione lentamente per non disturbare eccessivamente le cellule. Quindi richiudere e posizionare saldamente il coperchio.

A questo punto non devi più preoccuparti di disturbare le cellule o farle staccare dalla membrana. Quindi puoi manipolarla con un po' meno cautela. Devi scegliere la quantità appropriata di tensione.

Il funzionamento di questa macchina prevede una ruota rotante alla quale è collegato un braccio, il cui lunghezza può variare in base all'inserimento del pezzo prefabbricato che si posiziona al centro della ruota. Quando ruota, questo braccio si muove avanti e indietro, causando un movimento oscillatorio di questa piattaforma. Alle camere è collegata proprio questa piattaforma.

Pertanto, anche loro si muovono avanti e indietro. Quindi, se voglio applicare una deformazione del 5%, utilizzo un pezzo prefabbricato con inciso un cinque, che ha una lunghezza precalcolata specifica per far sì che il braccio raggiunga la posizione corretta. Inserisco questo pezzo al centro della ruota, poi fisso il braccio, verifico che sia ben saldo e stringo il tutto usando la chiave esagonale per il fissaggio finale.

Quindi, una volta che tutto è stato posizionato correttamente, ci si trova nella posizione zero e tutto è bloccato. Ora siamo pronti per inserire le camere. Queste sono le camere che ho appena trasportato.

Hanno le cellule nella parte superiore, posizionarle con attenzione in una singola posizione e assicurarsi che la barra si blocchi correttamente. È necessario spingerla in questa direzione in modo che si blocchi nella sua posizione zero. Non spingerla completamente all'indietro, altrimenti si potrebbe pre-allungare la membrana.

Quindi bloccatelo in posizione con questo fissaggio qui in modo che non si muova. E poi azionate l'interruttore per avviarlo. Si può notare un piccolo balzo all'inizio.

A volte succede, si inceppa, ma di solito dopo riprende a muoversi in modo piuttosto regolare. E ora tutte le barre si stanno muovendo avanti e indietro a 60 cicli al secondo. Quindi qui sotto indica 600.

In realtà dovrebbe essere 60,0. E puoi modificare la frequenza se lo desideri. Una volta che le cellule sono state effettivamente sottoposte a stress meccanico nel tuo sistema, di solito si procede per circa due-cinque giorni, ma puoi scegliere un periodo più breve o più lungo, se vuoi.

Una volta terminato il procedimento e raggiunta una sorta di fine definita, è possibile rimuovere le camere e utilizzare le cellule presenti su quelle membrane per indagare diversi aspetti. Di norma, impieghiamo diverse tecniche, tra cui elettroforesi su gel 2D e microarray. Inoltre, analizziamo l'espressione genica mediante PCR o l'espressione proteica mediante western blotting.

Oltre a semplicemente lisare le cellule, è anche possibile colorarle direttamente sulla membrana cercando magari l'immunofluorescenza di proteine specifiche, oppure si possono persino rilasciare le cellule dalla membrana, colorarle ed esaminarle mediante un fax. Pertanto, esistono molte cose diverse che si possono fare, molti aspetti diversi che si possono analizzare. E ovviamente, esistono anche diverse varianti dello strumento, qualora si volessero utilizzare tipi diversi di membrane con microconfigurazioni o semplicemente materiali diversi, rivestimenti differenti, e ogni sorta di modifiche possibili.