Name: Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Scopri come fabbricare un dispositivo microfluidico per ricreare microambienti tumorali eterogenei in vitro. Questo metodo consente di testare farmaci chemioterapici con risultati accurati e riproducibili.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione # 1R01CA120825-01A1, il Collaborative Research Biomedica (CBR) Program presso la University of Massachusetts Amherst, e la borsa di studio per Isenberg Bhushan J. Toley. Noi riconosciamo con gratitudine il prezioso contributo di James Schafer, l&#39;operatore video, narratore, ed editore di questo video.

1. Dispositivo Fabrication Replica di caratteristiche microfluidica in materiali elastomerici si basa sul metodo descritto da Duffy et al. 1 <ol><li> Mix elastomero (polidimetilsilossano, PDMS) e catalizzatore dal Kit elastomero di silicone (Dow Corning, Midland, MI), in un rapporto in peso 9:1 e versare sopra il master in modo da formare uno strato di 4 mm di spessore. Degas per rimuovere le bolle d'aria e polimerizzare la miscela a 60 ° C per 5 ore. Peel curata PDMS dallo stampo per ottenere un timbro di caratteristiche del flusso sul elastomero. </li><li> Fori Punch per ingressi e le uscite con un 1,5 mm biopsia (Miltex, York, PA), montato su un trapano a colonna. Estrarre tutti i detriti. </li><li> Oggetto Il lato le caratteristiche del timbro e un vetrino pulito per plasma di ossigeno per 8 minuti in un incisore plasma di ossigeno. Portare le superfici trattate immediatamente a contatto per formare un legame tra loro. Mantenere il gruppo a 60 ° C su un vetrino più caldo per almeno 5 ores per rafforzare il legame. </li><li> Collegare 0.032 "ID tubi in PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) per le entrate e le uscite utilizzando un'interfaccia di luer lock maschio connettori collegati ai connettori spinato femmina luer lock (Qosina, Edgewood, New York). </li><li> Impostare il gruppo di flusso con valvole di intercettazione e di un connettore a Y (Upchurch scientifico, Oak Harbor, WA; la figura 1). Montare il dispositivo al microscopio. Collegare siringhe di tubi tramite 20G 1.5 "aghi (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formazione di Spheroids uniformi Sferoidi sono formate attraverso il metodo della goccia pendente 2,3. <ol><li> Tripsinizzare le cellule sotto cappa sterile coltura cellulare. </li><li> Centrifugare cellule tripsinizzate a 2000 rpm per 5 minuti e risospendere in 6 ml di mezzo fresco. Diluire la soluzione madre alla concentrazione finale desiderata (Tabella 1). </li><li> Togliere il coperchio di una piastra da 48 pozzetti e metterlo a testa in giù nella sterilized cappuccio. Zone circolari corrispondenti a ciascun pozzetto sono evidenti sul coperchio. Riempire ogni pozzetto della piastra con 1 ml di acqua sterilizzata per mantenere l'umidità. Mettere a goccia 20 ml di soluzione diluita di cellule in ciascuna regione circolare con una micropipetta. Agitare delicatamente il coperchio e posizionarlo sopra la piastra pozzo, assicurando che le gocce non toccare i bordi dei pozzetti. </li><li> Incubare la piastra a pozzetti a 37 ° C per un determinato numero di giorni (Tabella 1). Uno sferoide si formerà in ogni goccia. </li></ol> 3. Introduzione di Spheroids in Dispositivo Fare riferimento alla Figura 1 e Tabella 2 per questa sezione. <ol><li> Sterilizzare il dispositivo da lavaggio con etanolo 70% introdotto attraverso l'ingresso del flusso. Successivamente, lavare con PBS seguita da HEPES tamponati terreno di coltura cellulare. F lasciare la siringa medio S attaccato al tubo. </li><li> Pareggio 2-3 sferoidi in P siringa S, toccare la siringa per rimuovere le bolle d'aria, ecollegare alla presa di imballaggio del dispositivo. </li><li> Apertura valvola di ingresso V Pin e vicino Fin V. Aprire la valvola di uscita Pout V e vicino Fout V. Tenere la siringa confezionatrice verticale con l'ago rivolto verso il basso; guardare come sferoidi depositano sul fondo della siringa nel connettore luer lock dell'ago. Spingere lo stantuffo sulla siringa di imballaggio e sferoidi orologi inserire il tubo e il flusso nel dispositivo. Poiché solo la valvola di uscita imballaggio è aperta, uno sferoide entrerà nella camera del dispositivo e conservate dal posti sul retro (Fig. 2). </li><li> Chiudere la valvola di ingresso e di uscita V Pin valvola Pout V. Montare la siringa F S su una pompa a siringa. Aprire la valvola V Fin e la valvola V Fout. Flusso medio nel dispositivo al 3 ml / min. </li></ol> 4. Introduzione di Agente Rilevamento Apoptosi (CaspGLOW) Dopo l'imballaggio camere con sferoidi, raggiungere l'equilibrio per up a 24 ore per stabilire gradienti nutrizionali e microambienti, prima di introdurre l'apoptosi o la rilevazione di agenti terapeutici. Perché i tessuti in camere sono in contatto con le pareti impenetrabili dall'alto e dal basso, non vi sono gradienti nutrienti lungo lo spessore (0,15 mm) del tessuto. Dopo 24 ore di incubazione, tutti strati di cellule lungo lo spessore del tessuto sono quindi equivalenti e l'eterogeneità solo in una direzione lontano dal canale di flusso. <ol><li> Spegnere V Fin, fermare la pompa a siringa, rimuovere F S siringa dalla pompa e sostituirlo con una siringa con terreno contenente 0,25 microlitri / ml di CaspGLOW Red attiva caspasi-3 marcatore (Red-DEVD-FMK, Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manualmente irrigare 0,7 ml di questa soluzione attraverso il dispositivo per garantire lo spostamento di vecchi media. Montare la siringa sulla pompa, riavviare il flusso, e aperto Fin V. In un periodo di 5-8 ore, l'apoptosi rilevamento diffonde agente in tegli reagisce in tessuto e brillanti nelle regioni apoptotici. Agente apoptosi rilevamento a questa concentrazione viene mantenuta in tutte le successive soluzioni di flusso nel dispositivo. </li></ol> Nota: <ol class="lroman"><li> Eterogeneità del tessuto può essere confermata mediante l'ottenimento di profili di intensità di fluorescenza lineare come descritto nella Sezione 6. I profili dovrebbero mostrare gradienti spaziali in apoptosi, a conferma che il tessuto è eterogenea rispetto alla vitalità cellulare. </li><li> CaspGLOW verde attivo caspasi-3 marcatore (fluoresceina-DEVD-FMK; Biovision) può anche essere utilizzato per rilevare l'apoptosi. Questo indicatore contiene il fluoroforo verde fluoresceina invece della rodamina fluorocromo rosso. </li></ol> 5. Introduzione di agente terapeutico <ol><li> Seguire la procedura dei passi 4,1-4,2 per introdurre doxorubicina cloridrato 10 mM (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contenente l'apoptosi rilevazione agente. </li><li> Continua il flusso del therapeagente soluzione UTIC per un determinato periodo di tempo. Valvola di intercettazione Fin V e spegnere la pompa a siringa. Sostituire la siringa trattamento con una siringa contenente mezzo fresco apoptosi rilevamento agente. Permettono il flusso di mezzo fresco per 24 -36 ore mentre monitorando continuamente il tessuto al microscopio. </li></ol> 6. Time-lapse microscopia e la stima dei coefficienti diffusività droga Per ottenere puliti dati di fluorescenza, acquisire tutte le immagini al microscopio, concentrandosi sugli strati inferiori dei tessuti. Perché non ci sono gradienti di nutrienti in direzione verticale (vedi sezione 4), gli strati inferiori di cellule sono buoni rappresentanti di tutti gli altri livelli di cui sopra. <ol><li> Il processo di acquisizione è stato automatizzato tramite uno script personalizzato in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Acquisire le immagini trasmesse luce e fluorescenza della sferoide imballato con ingrandimento 10x ogni 30 minuti (Fig. 3A). All'acquisie l'immagine di fluorescenza di fondo prima dell'introduzione Dox. Per ospitare per le grandi dimensioni della camera (1000 micron x 300 micron), acquisisce due immagini adiacenti e piastrelle insieme 4. </li><li> Per la stima dei coefficienti di diffusività matematica droga, il primo passo è di generare profili di intensità medi lineari di Dox fluorescenza usando ImageJ. Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) comprendente il tessuto nella camera. Utilizzare il comando Plot profilo per generare un profilo di intensità media in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripetere l'operazione per un massimo di 3 punti temporali diversi. </li><li> Ottenere un'immagine di fluorescenza di fondo prima di introdurre Dox misurare autofluorescenza dal tessuto. Sottrarre la media intensità di fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ogni profilo corrispondente per l'intensità massima per ottenere <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> Il passo successivo è quello di valutare l'efficacia del coefficiente di diffusione D Dox nel tessuto tumorale. Dox diffusione può essere rappresentata dalla seguente equazione 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> dove FUNZ.ERRORE.COMP è la funzione errore complementare, x è la distanza nel tessuto dal canale, et è il tempo dopo l'introduzione di Dox (vedi fig. 3). Utilizzare il seguente schema iterativo in ogni tempo considerato: <ul><li> Indovinate un valore per D </li><li> Calcolare lato destro dell'equazione in ogni posizione x </li><li> Calcolare la somma dei quadrati degli errori (residuo) tra i due lati </li><li> Modificare D per minimizzare il residuo </li></ul></li><li> Media dei valori ottimali di D ottenuta ad ogni tempo per stimare il coefficiente medio di diffusione efficace Dox nel tessuto. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: &lt;class = p "jove_content"&gt; I dispositivi microfluidici disponibile 1mm x 0,3 millimetri x 0,15 millimetri otticamente accessibili camere di coltura per la crescita di tridimensionale tessuto tumorale. Sferoidi tumorali multicellulari sono stati portati in queste camere e sono stati accolti da due posti di filtro sul retro. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi di dimensioni consistenti e forma da linee cellulari diverse. Sferoidi sono stati coltivati ​​con successo sul dispositivo per un massimo di 3 giorni. Crescita nelle camere era associata con una modifica riproducibile di microambienti all'interno sferoidi. Apoptosi in cellule verificato meno in prossimità del canale di flusso superiore e più in profondità nel tessuto. Il dispositivo è stato usato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina nel tessuto tumorale. Il valore ottenuto di 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 concorda con il valore di 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 riportato precedentemente 6 nel carcinoma mammario umano. <table border="1"><tbody><tr><td> Linea cellulare </td><td> Cella concentrazione richiesta </td><td> Tempo di incubazione </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 cellule / mL </td><td> 2-3 giorni </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 cellule / mcl </td><td> 3-4 giorni </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 cellule / mL </td><td> 5-6 giorni </td></tr></tbody></table> Parametri Tabella 1. Spheroids per goccia <table border="1"><tbody><tr><td> Parte </td><td> Descrizione </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flusso Siringa </td></tr><tr><td> S P </td><td> Imballaggio Siringa </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flusso in entrata della valvola </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Imballaggio valvola di aspirazione </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Portata in uscita della valvola </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Imballaggio valvola di scarico </td></tr></tbody></table> Siringhe Tabella 2. E valvole in configurazione di flusso <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Schema della configurazione del flusso V e V Fin Fout:. Aspirazione di flusso e valvole di scarico, V Pin e Pout V: ingresso Imballaggio e valvole di scarico, S F e S P: flusso e siringhe di imballaggio. La siringa imballaggio e confezionamento valvole di aspirazione e scarico sono utilizzati quando uno sferoide è volato nella camera. La siringa flusso e flusso di aspirazione e valvole di scarico vengono utilizzati per scorrere medio successivamente. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schematica di uno sferoide intrappolato in una camera sul dispositivo. Uno sferoide è fluito nella camera del dispositivo ed è bloccato da due pos filtrots sul retro della camera. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Doxorubicina diffusione nel tessuto tumorale sul dispositivo. A. Fusione trasmessa immagine luce e rosso fluorescente del tessuto, mostra la località e la concentrazione di doxorubicina (in rosso). Barra della scala rappresenta 250 micron. B. profilo normalizzato intensità di fluorescenza lineare da doxorubicina.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema vascolare nei tumori è scarsa e mal sviluppati 7,8. Ci sono regioni lontane (&gt; 100 micron) dai vasi sanguigni che sono inaccessibili ai nutrienti e farmaci forniti anche se il sistema vascolare 9. Il microambiente eterogenea risultante contribuisce alla limitata efficacia di molti chemioterapici 10. Il dispositivo microfluidico qui sviluppato ricrea un microambiente tumorale eterogenea caratterizzata da proliferazione, le cellule quiescenti e apoptotiche o necrotiche, in vi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Silicone elastomero kit </td><td> Adesivi Ellsworth </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsia </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 millimetri </td></tr><tr><td> Tubi in PTFE </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Maschio luer lock </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Spinato raccordo luer lock femmina </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola di intercettazione </td><td> Idex Health and Science </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Connettore a Y </td><td> Idex Health and Science </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;aghi </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluoresceina </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicina cloridrato </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Carcinoma del colon umano linea di cellule </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Umano carcinoma duttale linea cellulare </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Adenocarcinoma mammario umano linea di cellule </td></tr></tbody></table>

dispositivo microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Abbiamo sviluppato un dispositivo a microfluidi che imita la consegna e la clearance sistemica di farmaci per eterogenei tessuti tumorali tridimensionali in vitro. I nutrienti forniti da vascolarizzazione non riescono a raggiungere tutte le parti di tumori, dando luogo a microambienti eterogenei costituiti da tipi di cellule vitali, quiescenti e necrotico. Farmaci contro il cancro Molti non riescono a penetrare in modo efficace e trattare tutti i tipi di cellule a causa di questa eterogeneità. Monostrati di cellule tumorali non imitare questa eterogeneità, rendendo difficile per testare farmaci antitumorali di un idoneo modello in vitro. I nostri dispositivi microfluidici sono stati realizzati su PDMS utilizzando la litografia soffice. Sferoidi multicellulari tumorali, formate con il metodo della goccia pendente, sono stati inseriti e vincolati in camere rettangolari sul dispositivo e mantenuto con perfusione mezzo continuo su un lato. La forma rettangolare delle camere sul dispositivo creato gradienti lineari all&#39;interno del tessuto. Macchie fluorescenti sono stati utilizzati per quantificare °variabilità e in apoptosi all&#39;interno del tessuto. Tumori sul dispositivo sono stati trattati con la doxorubicina farmaco chemioterapico fluorescente, time-lapse microscopia è stata utilizzata per monitorare la diffusione nel tessuto, e il coefficiente di diffusione efficace è stato stimato. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi uniformi dalle diverse linee cellulari tumorali. Il dispositivo è attivata crescita di sferoidi fino a 3 giorni. Cellule in prossimità del flusso mezzo erano minimamente apoptotica e lontani dal canale erano più apoptotico, così accuratamente mimando regioni tumori adiacenti ai vasi sanguigni. Il valore stimato del coefficiente di diffusione doxorubicina concordato con un valore precedentemente riportato nel carcinoma mammario umano. Poiché la penetrazione e ritenzione dei farmaci nei tumori solidi influenza la loro efficacia, noi crediamo che questo dispositivo è uno strumento importante per comprendere il comportamento dei farmaci, e lo sviluppo di nuove terapie contro il cancro.

Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti tumorali<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilità in apoptosi nel tessuto tumorale è stata quantificata mediante macchie fluorescenti e il coefficiente di diffusione efficace del farmaco chemioterapico doxorubicina nel tessuto tumorale è stata valutata.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico che mima la somministrazione e la clearance sistemica di farmaci in tessuti tumorali tridimensionali eterogenei in...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico in grado di ricreare in vitro microambienti tumorali e utilizzabile per testare farmaci chemioterapici. Questo è il dispositivo microfluidico. Questo dispositivo può essere utile nei seguenti ambiti: test semplici di farmaci chemioterapici in vitro.Fornisce risultati coerenti e precisi per la valutazione di tessuti tumorali tridimensionali e questo dispositivo offre una rappresentazione molto accurata del tumore in vivo. I tumori esistono in microambienti tridimensionali e la possibilità di effettuare test in un microambiente di questo tipo è di grande rilevanza. Il primo passaggio della procedura consiste nell'assemblare il dispositivo, operazione che comprende la fabbricazione di un chip microfluidico mediante litografia su materiale morbido, la perforazione di fori in corrispondenza degli ingressi e delle uscite, il legame a un vetrino e il collegamento di tubi per l'ingresso e l'uscita del flusso.Successivamente, gli steroidi tumorali multiceellulari uniformi vengono generati per l'utilizzo nel dispositivo mediante il metodo della goccia sospesa. Gli sferoidi sono quindi introdotti nel dispositivo, seguiti da agenti rivelatori di apoptosi e farmaci chemioterapici. Infine, si esegue la microscopia a intervalli di tempo, seguita da una stima matematica dei coefficienti di diffusività del farmaco per quantificare l'abilità di penetrazione dell'agente chemioterapico.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la crescita del tessuto nella formazione del dispositivo di microambienti eterogenei all'interno del tessuto e la diffusione del farmaco nel tessuto attraverso l'uso della microscopia a fluorescenza in time-lapse. La penetrazione limitata dei farmaci antitumorali nei tumori solidi è una causa importante del loro insuccesso. La maggior parte degli attuali modelli di test dei farmaci antitumorali non riproduce la natura tridimensionale dei tumori solidi.Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico costituito da tessuti tumorali tridimensionali sottoposti a perfusione continua. Questo modello rappresenta in modo più accurato la somministrazione di farmaci ai tumori solidi e la loro eliminazione sistemica. Gli steroidi tumorali multiceellulari sono un modello ben consolidato di tessuti tumorali tridimensionali.In questa procedura, il metodo della goccia sospesa viene utilizzato per creare sfere cellulari da impiegare nel dispositivo microfluidico. Questo metodo consente la formazione di sfere cellulari omogenee in un breve lasso di tempo. La sperimentazione di farmaci chemioterapici in vitro su tessuti tridimensionali può aiutare a selezionare i farmaci in modo più efficiente rispetto ai monocap strati cellulari.Mescolare il PDMS e l'agente indurente dell'elastomero di silicio in un rapporto ponderale di nove a uno. Versare quindi questa miscela sul master per formare uno strato spesso quattro millimetri. Per rimuovere le bolle d'aria, indurire a 60 gradi Celsius per cinque ore.Sfilare il PDMS polimerizzato dallo stampo per ottenere uno stampo con le caratteristiche dei canali di flusso sull'elastomero. Quindi, utilizzando un punch per biopsie di un millimetro e mezzo montato su un trapano, praticare fori per gli ingressi e le uscite. Rimuovere eventuali detriti.Sottoporre il lato con la struttura dello stampo e un vetrino pulito a plasma di ossigeno per otto minuti. In un attacco al plasma di ossigeno, mettere immediatamente a contatto le superfici trattate per formare un legame tra di esse. Mantenere l'assemblaggio a 60 gradi Celsius su un riscaldatore per vetrini per almeno cinque ore.Per rafforzare il collegamento, collegare un tubo in PTFE con diametro interno di 0,032 pollici agli ingressi e alle uscite del dispositivo microfluidico. Utilizzando un'interfaccia di connettori maschio a baionetta collegati a connettori femmina a baionetta con attacco a barbetta, questi connettori specifici permettono un passaggio agevole senza rotture. Infine, assemblare il sistema di flusso utilizzando valvole di intercettazione e un connettore a Y, quindi montare il dispositivo sul microscopio. Dopo aver montato il dispositivo, collegare i tubi agli ingressi e alle uscite appropriati per completare l'allestimento del flusso.Come mostrato in questa figura, questa configurazione consente la semplicità e la versatilità nell'inserimento di uno sferoide nel dispositivo o nella creazione di un flusso di mezzo attraverso il dispositivo per l'inserimento. Aprire la valvola di ingresso per il caricamento VPN e la valvola di uscita per il caricamento VP per il tumore. L'OID può quindi passare attraverso l'ingresso e fluire nella camera di coltura, dove il perno presente in questa camera tratterrà il tumore in posizione per consentire il flusso del mezzo.Chiudere le valvole di chiusura e aprire la valvola di ingresso del flusso VF in e la valvola di uscita del flusso VF out per avviare la formazione di PHE uniforme. Utilizzando il metodo della goccia sospesa, trattare con tripsina le cellule sotto un capo a cappa. Prelevare le cellule trattate con tripsina dal centrifugo.Diluire la soluzione madre a una concentrazione desiderata facendo riferimento alla tabella uno. Successivamente, rimuovere il coperchio di una piastra a 48 pozzetti e posizionarlo capovolto. In una cappa sterilizzata, riempire ogni pozzetto della piastra con un millilitro di acqua sterilizzata.Per mantenere l'umidità, posizionare una goccia di 20 microlitri di soluzione cellulare diluita in ciascuna regione circolare del coperchio. Utilizzando una micropipetta, capovolgere con attenzione il coperchio e posizionarlo sopra la piastra, assicurandosi che le gocce non tocchino i bordi dei pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.Fare riferimento alla tabella uno per la durata dell'incubazione in base al particolare tipo di cellula utilizzato; un corticosteroide si formerà in ogni goccia sospesa. Iniziare sterilizzando il dispositivo mediante lavaggio con etanolo al 70% attraverso l'ingresso del flusso. Procedere quindi con un lavaggio con PBS e successivamente con mezzo di coltura cellulare tampone H-E-P-E-S.Lasciare la siringa media, collegarla al tubo. Successivamente, aspirare due o tre steroidi nel rubinetto della siringa. Per rimuovere le bolle d'aria, collegare la siringa all'ingresso del riempimento del dispositivo.Aprire la valvola di ingresso VPN e chiudere VFN, aprire la valvola di uscita VP out e chiudere VF out. Tenere la siringa di caricamento in posizione verticale con l'ago rivolto verso il basso. Osservare mentre lo steroide si deposita sul fondo della siringa, entrando nel connettore a baionetta dell'ago.Premere lo stantuffo della siringa di caricamento e osservare l'ingresso della PHE nel tubo e il flusso nel dispositivo, poiché solo la valvola di uscita del caricamento è aperta. Un corticosteroide entrerà nella camera del dispositivo e verrà trattenuto dai perni posteriori. Una volta all'interno della camera, lo sferoide S si adatta alla forma della camera e assume una geometria rettangolare.Chiudere la valvola di ingresso VPN e la valvola di uscita VP, quindi montare la siringa per il flusso SF sulla pompa per siringa. Questa pompa è controllata da un computer mediante il software Syringe Pump Pro; aprire la valvola di ingresso VFN e la valvola di uscita VF. Avviare il flusso del mezzo nel dispositivo a tre microlitri al minuto.L'incubazione degli sferoidi per 24 ore è seguita dall'introduzione di agenti rivelatori dell'apoptosi. Prima di aggiungere agenti rivelatori dell'apoptosi o agenti terapeutici, lasciare raggiungere l'equilibrio agli sferoidi per un massimo di 24 ore al fine di stabilire gradienti di nutrienti e microambienti. Successivamente chiudere la valvola VFN.Fermare la pompa per siringa. Rimuovere la siringa dalla pompa e sostituirla con la siringa contenente mezzo con 0,25 microlitri per millilitro di marcatore attivo per Caspasi tre CASP glow red. Lavare il dispositivo con la soluzione, spingendo manualmente 0,7 millilitri di essa attraverso il dispositivo.Quindi montare la siringa sulla pompa. Riavviare il flusso e aprire la valvola VFN. Nel giro di cinque a otto ore, la fase attiva CPH del guanto rosso diffonderà nei tessuti e fluoroscerà più intensamente nelle regioni apoptotiche. L'agente rivelatore dell'apoptosi a questa concentrazione viene mantenuto in tutte le soluzioni di flusso successive.Doxorubicina viene introdotta da cinque a otto ore dopo l'introduzione degli agenti rivelatori di apoptosi. Questo trattamento viene rimosso dal sistema mediante lavaggio. Per aggiungere agenti chemioterapici, seguire la procedura per il rilevamento dell'apoptosi per introdurre doxorubicina cloridrato 10 micromolare.Sostituire quindi la siringa del trattamento con quella contenente 0,7 millilitri di mezzo. Continuare il flusso dell'agente terapeutico per un periodo di tempo fisso. Quindi chiudere la valvola VFN e spegnere la pompa per siringa.Rimuovere la siringa del trattamento dalla pompa per siringhe e sostituirla con la siringa contenente 0,7 millilitri di mezzo. Far scorrere il mezzo fresco per 24-36 ore monitorando continuamente il tessuto al microscopio. L'intero processo di acquisizione per la microscopia a intervalli è stato automatizzato utilizzando uno script personalizzato in IP Lab, acquisendo ogni 30 minuti immagini in luce trasmessa e in fluorescenza del PAX Foid a un ingrandimento di 10x. Per la stima matematica dei coefficienti di diffusività del farmaco, il primo passo consiste nel generare profili medi di intensità lineare della fluorescenza di Docs utilizzando ImageJ. Selezionare una regione di interesse rettangolare, o ROI, che comprenda il tessuto nella camera.Utilizzare il comando profilo del tracciato per generare un profilo delle intensità medie in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripetere il procedimento per un massimo di tre diversi punti temporali. Successivamente, sottrarre l'intensità media della fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ciascun profilo utilizzando l'intensità massima corrispondente per ottenere C in funzione di X e T. Dove C è la concentrazione normalizzata di doxorubicina, il valore di C varia tra zero e uno.Il passo successivo consiste nel valutare il coefficiente di diffusione efficace dei docs all'interno del tessuto tumorale docs. La diffusione può essere rappresentata mediante l'equazione seguente, in cui ERFC è la funzione di errore complementare. X è la distanza all'interno del tessuto a partire dal canale, e T è il tempo trascorso dopo l'introduzione della doxorubicina.Utilizzare il seguente schema iterativo in ogni punto temporale considerato. Indovinare un valore per D. Calcolare il lato destro dell'equazione in ogni posizione. X. Calcolare la somma degli errori quadratici tra i due lati, modificare D per minimizzare la media del residuo.I valori ottimali di D ottenuti in ogni punto temporale sono stati utilizzati per stimare il coefficiente di diffusione efficace medio della doxorubicina nel tessuto. I dispositivi microfluidici fornivano camere di coltura otticamente accessibili di dimensioni pari a un millimetro per 0,3 millimetri per 0,15 millimetri, per la crescita di tessuti tumorali tridimensionali. Il metodo della goccia sospesa ha permesso una rapida formazione di aggregati tumorali di dimensioni e forma costanti a partire da diverse linee cellulari.PHE sono stati coltivati con successo sul dispositivo per un periodo fino a tre giorni. La crescita all'interno delle camere è stata associata a modifiche riproducibili dei microambienti. All'interno dei PHE, l'apoptosi si è verificata in misura minore nelle cellule in prossimità del canale di flusso e in misura maggiore più in profondità all'interno del tessuto.Il dispositivo è stato utilizzato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina nel tessuto tumorale. Il valore ottenuto sperimentalmente è in accordo con quello riportato in precedenza nel cancro al seno umano. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità quando si introduce il PHE nel dispositivo, poiché l'operazione deve essere eseguita all'esterno della coltura cellulare.Nebulizzare abbondantemente con etanolo le siringhe e le estremità dei tubi per garantire la sterilità. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione del ruolo della penetrazione limitata dei farmaci nei tumori. Abbiamo dimostrato una tecnica per simulare il rilascio e l'eliminazione sistemica dei farmaci in tessuti tumorali tridimensionali e quantificarne la penetrazione.L'eliminazione dei farmaci con scarsa penetrazione semplificherà notevolmente il processo di sviluppo di farmaci antitumorali.

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