Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico in grado di ricreare in vitro microambienti tumorali e che può essere utilizzato per testare farmaci chemioterapici. Questo è il dispositivo microfluidico. Questo dispositivo può risultare utile nelle seguenti aree: test agevoli di farmaci chemioterapici in vitro.

Fornisce risultati coerenti e precisi per la valutazione di tessuti tumorali tridimensionali e questo dispositivo offre una rappresentazione molto accurata del tumore in vivo. I tumori esistono in microambienti tridimensionali e la possibilità di effettuare test in un microambiente di questo tipo è di grande rilevanza. Il primo passaggio della procedura consiste nell'assemblare il dispositivo, operazione che comprende la fabbricazione di un chip microfluidico mediante litografia su materiale morbido, la perforazione di fori in corrispondenza degli ingressi e delle uscite, il collegamento a un vetrino e il collegamento di tubi per l'ingresso e l'uscita del flusso.

Successivamente, i sferoidi tumorali multicellulari uniformi vengono generati per l'utilizzo nel dispositivo mediante il metodo della goccia sospesa. I sferoidi sono quindi introdotti nel dispositivo, seguiti da agenti rivelatori di apoptosi e farmaci chemioterapici. Infine, si esegue la microscopia a intervalli di tempo, seguita da una stima matematica dei coefficienti di diffusività del farmaco per quantificare l'abilità di penetrazione dell'agente chemioterapico.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la crescita del tessuto nella formazione di microambienti eterogenei all'interno del tessuto e la diffusione del farmaco nel tessuto mediante microscopia a fluorescenza a intervalli di tempo. La penetrazione limitata dei farmaci antitumorali nei tumori solidi è una causa importante del loro insuccesso. La maggior parte dei modelli attuali per il test dei farmaci antitumorali non riproduce la natura tridimensionale dei tumori solidi.

Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico costituito da tessuti tumorali tridimensionali sottoposti a perfusione continua. Questo modello rappresenta in modo più accurato la somministrazione di farmaci ai tumori solidi e la loro eliminazione sistemica. Gli steroidi tumorali multiceellulari sono un modello ben consolidato di tessuti tumorali tridimensionali.

In questa procedura, il metodo della goccia sospesa viene utilizzato per creare sfere cellulari da impiegare nel dispositivo microfluidico. Questo metodo consente la formazione di sfere cellulari omogenee in un breve periodo di tempo. La sperimentazione di farmaci chemioterapici in vitro su tessuti tridimensionali può aiutare a selezionare i farmaci in modo più efficiente rispetto ai monocap strato cellulare.

Mescolare il PDMS e l'agente indurente del silicone elastomero in un rapporto ponderale di nove a uno. Versare quindi questa miscela sul master per formare uno strato spesso quattro millimetri. Per rimuovere le bolle d'aria, indurire a 60 gradi Celsius per cinque ore.

Sfilare il PDMS polimerizzato dallo stampo per ottenere uno stampo con le caratteristiche del canale di flusso sull'elastomero. Quindi, utilizzando un punch per biopsie di un millimetro e mezzo montato su un trapano, praticare fori per gli ingressi e le uscite. Rimuovere eventuali detriti.

Sottoporre il lato con la struttura dello stampo e un vetrino pulito a plasma di ossigeno per otto minuti. In un incisore a plasma di ossigeno, mettere immediatamente a contatto le superfici trattate per formare un legame tra di esse. Mantenere l'assemblaggio a 60 gradi Celsius su un riscaldatore per vetrini per almeno cinque ore.

Per rafforzare il collegamento, collegare un tubo in PTFE con diametro interno di 0,032 pollici agli ingressi e alle uscite del dispositivo microfluidico. Utilizzando un'interfaccia composta da connettori maschio a baionetta collegati a connettori femmina a baionetta con attacco a spina, questi connettori specifici permettono il passaggio facile senza rotture. Infine, assemblare il sistema di flusso utilizzando valvole di intercettazione e un connettore a Y, quindi montare il dispositivo sul microscopio. Dopo aver montato il dispositivo, collegare i tubi agli ingressi e alle uscite appropriati per completare l'allestimento del flusso.

Come mostrato in questa figura, questa configurazione consente la semplicità e la versatilità nell'inserimento di uno sferoide nel dispositivo o nella creazione di un flusso di mezzo attraverso il dispositivo per l'inserimento. Aprire la valvola di ingresso per il caricamento VPN e la valvola di uscita per il caricamento VP per il tumore. L'OID può quindi passare attraverso l'ingresso e fluire nella camera di coltura, dove il perno presente in questa camera tratterrà il tumore in posizione per consentire il flusso del mezzo.

Chiudere le valvole di chiusura e aprire la valvola di ingresso del flusso VF in e la valvola di uscita del flusso VF out per avviare la formazione di PHE uniforme. Utilizzando il metodo della goccia sospesa, trattare con tripsina le cellule sotto un cappe a flusso laminare. Prelevare le cellule trattate con tripsina dal centrifuga.

Diluire la soluzione madre a una concentrazione desiderata facendo riferimento alla tabella uno. Successivamente, rimuovere il coperchio di una piastra a 48 pozzetti e posizionarlo capovolto. In una cappa sterilizzata, riempire ogni pozzetto della piastra con un millilitro di acqua sterilizzata.

Per mantenere l'umidità, posizionare una goccia di 20 microlitri di soluzione cellulare diluita in ciascuna regione circolare sul coperchio. Utilizzando una micropipetta, capovolgere con attenzione il coperchio e posizionarlo sopra la piastra, assicurandosi che le gocce non tocchino i bordi dei pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Fare riferimento alla tabella uno per la durata dell'incubazione in base al particolare tipo di cellula utilizzato; in ogni goccia sospesa si formerà uno steroide. Iniziare sterilizzando il dispositivo, lavandolo con etanolo al 70% attraverso l'ingresso del flusso. Procedere quindi con un risciacquo con PBS e successivamente con mezzo di coltura cellulare tampone H-E-P-E-S.

Lasciare la siringa media, collegarla al tubo. Successivamente, aspirare due o tre steroidi nel rubinetto della siringa. Per rimuovere le bolle d'aria, collegare la siringa all'ingresso del condotto del dispositivo.

Aprire la valvola di ingresso VPN e chiudere VFN, aprire la valvola di uscita VP out e chiudere VF out. Tenere la siringa di caricamento in posizione verticale con l'ago rivolto verso il basso. Osservare mentre lo steroide si deposita sul fondo della siringa, nel connettore a baionetta dell'ago.

Premere lo stantuffo della siringa di imballaggio e osservare l'ingresso della PHE nel tubo e il flusso nel dispositivo, poiché solo la valvola di uscita per l'imballaggio è aperta. Un corticosteroide entrerà nella camera del dispositivo e verrà trattenuto dai perni posteriori. Una volta all'interno della camera, lo sferoide S assume la forma della camera e acquista una geometria rettangolare.

Chiudere la valvola di ingresso VPN e la valvola di uscita VP, quindi montare la siringa per il flusso SF sulla pompa per siringa. Questa pompa è gestita da un computer mediante il software Syringe Pump Pro; aprire la valvola di ingresso VFN e la valvola di uscita VF. Avviare il flusso del mezzo nel dispositivo a tre microlitri al minuto.

L'incubazione degli sferoidi per 24 ore è seguita dall'introduzione di agenti rivelatori dell'apoptosi. Prima di aggiungere agenti rivelatori dell'apoptosi o agenti terapeutici, lasciare raggiungere l'equilibrio agli sferoidi per un massimo di 24 ore al fine di stabilire gradienti di nutrienti e microambienti. Successivamente chiudere la valvola VFN.

Fermare la pompa per siringa. Rimuovere la siringa dalla pompa e sostituirla con la siringa contenente mezzo con 0,25 microlitri per millilitro di marcatore attivo per Caspasi tre CASP glow red. Lavare il dispositivo con la soluzione, spingendo manualmente 0,7 millilitri attraverso il dispositivo.

Quindi montare la siringa sulla pompa. Riavviare il flusso e aprire la valvola VFN. Nel giro di cinque a otto ore, il tracciante fluorescente attivo nella fase tre del CPH diffonderà nei tessuti e fluoroscerà più intensamente nelle regioni apoptotiche; l'agente rivelatore di apoptosi a questa concentrazione viene mantenuto in tutte le soluzioni di flusso successive.

La doxorubicina viene introdotta da cinque a otto ore dopo l'introduzione degli agenti di rilevamento dell'apoptosi. Questo trattamento viene rimosso dal sistema mediante lavaggio. Per aggiungere gli agenti chemioterapici, seguire la procedura per il rilevamento dell'apoptosi per introdurre 10 micromolar di cloridrato di doxorubicina.

Sostituire quindi la siringa del trattamento con la siringa contenente 0,7 millilitri di mezzo. Continuare il flusso dell'agente terapeutico per un periodo di tempo stabilito. Chiudere quindi la valvola VFN e spegnere la pompa per siringa.

Rimuovere la siringa del trattamento dalla pompa per siringhe e sostituirla con la siringa contenente 0,7 millilitri di mezzo. Far scorrere mezzo fresco per 24-36 ore monitorando continuamente il tessuto al microscopio. L'intero processo di acquisizione per la microscopia a intervalli è stato automatizzato utilizzando uno script personalizzato in IP Lab, acquisendo ogni 30 minuti immagini in luce trasmessa e in fluorescenza del PAX Foid a un ingrandimento di 10x. Per la stima matematica dei coefficienti di diffusività del farmaco, il primo passo consiste nel generare profili medi di intensità lineare della fluorescenza di Docs utilizzando ImageJ. Selezionare una regione di interesse rettangolare, o ROI, che comprenda il tessuto nella camera.

Utilizzare il comando profilo del grafico per generare un profilo delle intensità medie in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripetere il procedimento per un massimo di tre diversi punti temporali. Successivamente, sottrarre l'intensità media della fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ciascun profilo utilizzando l'intensità massima corrispondente per ottenere C in funzione di X e T. Dove C è la concentrazione normalizzata di doxorubicina, il valore di C varia tra zero e uno.

Il passo successivo consiste nel valutare il coefficiente di diffusione efficace dei docs all'interno del tessuto tumorale docs. La diffusione può essere rappresentata mediante l'equazione seguente, in cui ERFC è la funzione di errore complementare. X è la distanza all'interno del tessuto a partire dal canale, e T è il tempo trascorso dopo l'introduzione della doxorubicina.

Utilizzare il seguente schema iterativo in ogni punto temporale considerato. Indovinare un valore per D. Calcolare il lato destro dell'equazione in ogni posizione. X. Calcolare la somma degli errori quadratici tra i due lati, modificare D per minimizzare la media dei residui.

I valori ottimali di D ottenuti in ciascun punto temporale sono stati utilizzati per stimare il coefficiente di diffusione efficace medio della doxorubicina nel tessuto. I dispositivi microfluidici fornivano camere di coltura otticamente accessibili di dimensioni pari a un millimetro per 0,3 millimetri per 0,15 millimetri, per la crescita di tessuti tumorali tridimensionali. Il metodo della goccia sospesa ha permesso una rapida formazione di aggregati tumorali di dimensioni e forma costanti a partire da diverse linee cellulari.

Le PHE sono state coltivate con successo sul dispositivo fino a tre giorni. La crescita nelle camere è stata associata a modifiche riproducibili dei microambienti. All'interno delle PHE, l'apoptosi si è verificata meno nelle cellule in prossimità del canale di flusso e in misura maggiore e più in profondità nel tessuto.

Il dispositivo è stato utilizzato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina nel tessuto tumorale. Il valore ottenuto sperimentalmente è in accordo con quello riportato in precedenza nel cancro al seno umano. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità quando si introduce PHE nel dispositivo, poiché l'operazione deve essere eseguita al di fuori della coltura cellulare.

Nebulizzare abbondantemente con etanolo le siringhe e le estremità dei tubi per garantire la sterilità. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione del ruolo della penetrazione limitata dei farmaci nei tumori. Abbiamo dimostrato una tecnica per simulare il rilascio e l'eliminazione sistemica dei farmaci in tessuti tumorali tridimensionali e quantificarne la penetrazione.

L'eliminazione dei farmaci con scarsa capacità di penetrazione semplificherà notevolmente il processo di sviluppo di farmaci antitumorali.