Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico che ricrea i microambienti tumorali in vitro e può essere utilizzato per testare farmaci chemioterapici. Questo è il dispositivo microfluidico. Questo dispositivo può essere utile nelle seguenti aree, test facili per farmaci chemioterapici in vitro.

Fornisce risultati coerenti e accurati per l'analisi del tessuto tumorale tridimensionale e questo dispositivo fornisce una rappresentazione molto accurata del tumore in vivo. Microambienti: i tumori esistono nei microambienti 3D e la capacità di eseguire test in uno di essi è significativa. Il primo passo della procedura consiste nell'assemblare il dispositivo, che prevede la fabbricazione di un chip microfluidico utilizzando la litografia morbida, la perforazione di fori agli ingressi e alle uscite, l'incollaggio a uno scivolo di vetro e il collegamento dei tubi per l'ingresso e l'uscita del flusso.

Successivamente, gli steroidi tumorali multicellulari uniformi vengono generati per l'uso nel dispositivo utilizzando il metodo della goccia sospesa. Gli sferoidi vengono quindi introdotti nel dispositivo, seguiti da apoptosi, agenti di rilevamento e farmaci chemioterapici. Infine, viene eseguita la microscopia time lapse, seguita da una stima matematica dei coefficienti di diffusività del farmaco per quantificare la capacità di penetrazione dell'agente chemioterapico.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la crescita dei tessuti nel dispositivo, la formazione di microambienti eterogenei all'interno del tessuto e la diffusione del farmaco nel tessuto attraverso l'uso della microscopia a fluorescenza time lapse. La penetrazione limitata dei farmaci antitumorali nei tumori solidi è una causa importante del loro fallimento. La maggior parte degli attuali modelli di test sui farmaci antitumorali non imita la natura tridimensionale dei tumori solidi.

Abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico costituito da tessuti tumorali tridimensionali continuamente perfusi. Questo modello rappresenta in modo più accurato la somministrazione di farmaci ai tumori solidi e la loro clearance sistemica. Gli steroidi tumorali multicellulari sono un modello consolidato di tessuti tumorali tridimensionali.

In questa procedura, il metodo della goccia sospesa viene utilizzato per creare steroidi da utilizzare nel dispositivo microfluidico. Questo metodo consente la formazione di steroidi coerenti in un breve periodo di tempo. Testare i farmaci chemioterapici in vitro in tessuti tridimensionali può aiutare a selezionare i farmaci in modo più efficiente rispetto ai monostrati di cellule.

Miscelare il PDMS e l'agente indurente dell'elastomero siliconico in un rapporto di peso di nove a uno. Quindi versare questa miscela sul master per formare un bagliore di quattro millimetri di spessore Degas. Per rimuovere le bolle d'aria, polimerizzare a 60 gradi Celsius per cinque ore.

Staccare il PDMS polimerizzato dallo stampo per ottenere un timbro delle caratteristiche di flusso sull'elastomero. Quindi, utilizzando un punzone per biopsia da un millimetro e mezzo montato su un trapano, premere i fori per gli ingressi e le uscite. Estrarre eventuali detriti.

Sottoporre il lato caratteristico del timbro e un vetrino pulito al plasma di ossigeno per otto minuti. In un mordenzatore al plasma di ossigeno, portare immediatamente a contatto le superfici trattate per formare un legame tra di loro. Mantenere l'assemblaggio a 60 gradi Celsius su uno scaldavetrini per almeno cinque ore.

Per rafforzare il legame, collegare un tubo in PTFE con diametro interno di 0,032 pollici agli ingressi e alle uscite del dispositivo microfluidico. Utilizzando un'interfaccia di connettori maschio per il blocco dell'esca collegati a connettori femmina spinati per il blocco dell'esca, questi connettori specifici vengono utilizzati per consentire un facile passaggio attraverso di essi senza rompersi. Infine, impostare il gruppo di flusso utilizzando valvole di intercettazione e un connettore a Y, montare il dispositivo sul microscopio Dopo aver montato il dispositivo, collegare i tubi agli ingressi e alle uscite appropriati per completare la configurazione del flusso.

Come mostrato in questa figura, questa configurazione consente la facilità e la versatilità di inserire uno sferoide nel dispositivo o di creare un flusso di fluido attraverso il dispositivo da imballare. Aprire la valvola di ingresso della baderna VPN e la valvola di uscita della baderna VP per eliminare un tumore. L'OID può quindi passare attraverso l'ingresso e fluire nella camera di coltura dove il perno in questa camera manterrà il tumore in posizione per far fluire il terreno.

Chiudere le valvole di tenuta e aprire la valvola di ingresso del flusso VF verso l'interno e la valvola di uscita del flusso VF verso l'esterno per avviare la formazione di PHE uniforme. Utilizzando il metodo della goccia sospesa, le celle di ghiaccio alla tripsina sotto una cappa di coltura. Prelevare le cellule di tripsina risultanti dalla centrifuga.

Diluire la soluzione madre alla concentrazione desiderata facendo riferimento alla tabella uno. Quindi, rimuovere il coperchio di una piastra a 48 pozzetti e posizionarla capovolta. In una cappa sterilizzata, riempire ogni pozzetto della piastra con un millilitro di acqua sterilizzata.

Per mantenere l'umidità, mettere una goccia da 20 microlitri di soluzione cellulare diluita in ciascuna regione circolare del coperchio. Utilizzando una micropipetta, capovolgere con cautela il coperchio e posizionarlo sopra la piastra, assicurandosi che le gocce non tocchino i bordi dei pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Fare riferimento alla tabella uno per la durata dell'incubazione in base alla particolare cellula utilizzata, uno steroide si formerà in ogni goccia sospesa. Inizia sterilizzando il dispositivo lavandolo con etanolo al 70% attraverso l'ingresso del flusso. Seguire con un lavaggio di PBS, quindi con un terreno di coltura cellulare tamponato H-E-P-E-S.

Lasciare la siringa del mezzo, collegarla al tubo. Quindi, aspirare due o tre steroidi nella siringa del rubinetto della siringa. Per rimuovere le bolle d'aria, collegare la siringa all'ingresso della guarnizione del dispositivo.

Aprire la valvola di ingresso VPN e chiudere VFN, aprire la valvola di uscita VP e chiudere VF. Tenere la siringa di imballaggio in posizione verticale con l'ago rivolto verso il basso. Guarda come lo steroide si deposita sul fondo della siringa nel connettore di blocco dell'esca dell'ago.

Spingere lo stantuffo sulla siringa di imballaggio e osservare PHE entrare nel tubo e fluire nel dispositivo perché solo la valvola di uscita della baderna è aperta. Uno steroide entrerà nella camera del dispositivo e sarà trattenuto da pali sul retro. Una volta all'interno della camera, lo sferoide S si conforma alla forma della camera e acquisisce una geometria rettangolare.

Chiudere la valvola di ingresso VPN e la valvola di uscita di uscita VP out montare la siringa di flusso SF sulla pompa a siringa. Questa pompa è azionata da un computer che utilizza la pompa a siringa pro con valvola di ingresso aperta VFN e valvola di uscita VF out. Iniziare il flusso di fluido nel dispositivo a tre microlitri al minuto.

L'incubazione dello sferoide per 24 ore è seguita dall'introduzione di agenti che rilevano l'apoptosi. Prima di introdurre agenti di apoptosi, rilevatori o terapeutici, lasciare l'equilibrio dello sferoide per un massimo di 24 ore per stabilire gradienti di nutrienti e microambienti. Quindi chiudere la valvola VFN.

Arrestare la pompa a siringa. Rimuovere la siringa dalla pompa e sostituirla con la siringa contenente il terreno con 0,25 microlitri per mil di CASP glow red attivo Caspasi tre marcatore. Lavare il dispositivo con la soluzione sciacquando manualmente 0,7 millilitri attraverso il dispositivo.

Quindi montare la siringa sulla pompa. Riavviare il flusso e aprire la valvola VFN. Per un periodo da cinque a otto ore, la terza fase attiva del cph rosso guanto si diffonderà nel tessuto e emetterà una fluorescenza più brillante nelle regioni apoptotiche, l'agente di rilevamento dell'apoptosi a questa concentrazione viene mantenuto in tutte le successive soluzioni di flusso.

La doxorubicina viene introdotta da cinque a otto ore dopo l'introduzione degli agenti che rilevano l'apoptosi. Questo trattamento viene eliminato dal sistema mediante lavaggio. Per aggiungere agenti chemioterapici, seguire la procedura per il rilevamento dell'apoptosi per introdurre 10 micromolari di doxorubicina cloridrato.

Quindi sostituire la siringa di trattamento con la siringa con 0,7 millilitri di terreno. Continuare il flusso dell'agente terapeutico per un periodo di tempo determinato. Quindi chiudere la valvola VFN e spegnere la pompa a siringa.

Rimuovere la siringa di trattamento dalla pompa a siringa e sostituirla con la siringa con 0,7 millilitri di terreno. Lasciare fluire il terreno fresco per 24-36 ore, monitorando continuamente il tessuto al microscopio. L'intero processo di acquisizione per la microscopia time lapse è stato automatizzato utilizzando uno script personalizzato nel laboratorio IP, acquisisce immagini a luce trasmessa e fluorescenza del PAX Foid con un ingrandimento di 10 x ogni 30 minuti Per la stima matematica dei coefficienti di diffusività dei farmaci, il primo passo è generare profili di intensità lineare media della fluorescenza dei documenti utilizzando l'immagine J.Selezionare una regione rettangolare di interesse, o ROI che comprende il tessuto nella camera.

Utilizzare il comando grafico profilo per generare un profilo delle intensità medie in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripeti per un massimo di tre punti temporali diversi. Successivamente, sottrarre l'intensità media della fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ciascun profilo utilizzando l'intensità massima corrispondente per ottenere C in funzione di X e T.Dove C è la concentrazione normalizzata di doxorubicina, il valore di C varia da zero a uno.

Il passo successivo è valutare l'effettivo coefficiente di diffusione dei documenti all'interno dei documenti del tessuto tumorale. La diffusione può essere rappresentata dalla seguente equazione dove ERFC è la funzione di errore complementare. X è la distanza nel tessuto dal canale e T è il tempo dopo l'introduzione della doxorubicina.

Utilizzare lo schema iterativo seguente in ogni punto temporale considerato. Indovina un valore per D.Calcola il lato destro dell'equazione in ogni posizione. X.Calcolare la somma degli errori al quadrato tra i due lati, modificare D per minimizzare la media residua.

I valori ottimali di D ottenuti in ogni momento servono a stimare il coefficiente di diffusione medio efficace della doxorubicina nel tessuto. I dispositivi microfluidici hanno fornito camere di coltura otticamente accessibili di un millimetro per 0,3 millimetri per 0,15 millimetri per la crescita di tessuto tumorale tridimensionale. Il metodo della goccia sospesa ha permesso la rapida formazione di PHE tumorale di dimensioni e forma coerenti da diverse linee cellulari.

I PHE sono stati coltivati con successo sul dispositivo per un massimo di tre giorni. La crescita nelle camere è stata associata alla modifica riproducibile dei microambienti. All'interno della phe, l'apoptosi si è verificata meno nelle cellule in prossimità del canale di flusso e più in alto e più in profondità nel tessuto.

Il dispositivo è stato utilizzato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina e del tessuto tumorale. Il valore sperimentalmente contenuto concordava con il valore riportato in precedenza nel carcinoma mammario umano durante il tentativo di questa procedura. È importante prestare la massima attenzione al mantenimento della sterilità durante il flusso di PHE nel dispositivo, perché deve essere eseguito al di fuori della coltura cellulare.

Spruzzare generosamente le siringhe e le estremità dei tubi con etanolo per garantire la sterilità. Dopo aver visto questo video, dovresti aver compreso il ruolo della penetrazione limitata dei farmaci nei tumori. Abbiamo dimostrato una tecnica per imitare la somministrazione e la clearance sistemica di farmaci su tessuti tumorali tridimensionali e quantificarne la penetrazione.

L'eliminazione dei farmaci scarsamente penetranti semplificherà significativamente il processo di sviluppo di farmaci antitumorali.