Name: Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Impara a preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale tramite respirometria ad alta risoluzione. Questo metodo consente di valutare la funzione mitocondriale in situ con precisione.

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Questo studio è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research e Genome Canada. JS detiene premi stipendio sostegno della Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada e la Canadian Diabetes Association. Il laboratorio vuole riconoscere l&#39;assistenza tecnica di strumenti Oroboros durante l&#39;acquisizione di saponina permeabilizzate tecnica di fibra.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
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<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
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<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
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<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La saponina permeabilizzate tecnica fibra cardiaca offre un compromesso tra le uniche in vitro e in vivo, la valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale OXPHOS. I vantaggi di questa tecnica includono una maggiore rilevanza fisiologica rispetto ai mitocondri isolati come architettura cellulare è conservata. Mentre la membrana plasmatica è degradata, strutture a membrana intracellulari tra cui i mitocondri 12, 14, reticolo sarcoplasmatico 14, miofilamenti e il citoscheletro <s...

<table><tbody><tr><td>Etilene al 100%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>Etilene al 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;-difosfato monopotassica diidrata (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino praticamente priva di acidi grassi&amp;#8211;libera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;-trifosfato disodica idrata (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractiloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile p-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilenglicole-bis-(2-ammino&amp;#8211;etil)etere)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Acido glutammico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Chetamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Acido lattobionico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Acido malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetrametil-p-fenilendiammina diidrocloruro (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Iodrato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di potassio</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Acido succinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Provette centrifughe in polipropilene da 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Provette centrifughe in polipropilene da 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette dritte da orafo</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette curve da orafo</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche dritte</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica sterile</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringa da 0,45-&amp;mu;m</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>Phmetro</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari in polistirene da 12 pozzetti</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Microbarre Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia pesatrice</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>Siringa micro Hamilton da 10&amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>Siringa micro Hamilton da 25&amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>Siringa micro Hamilton da 50&amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi dosatori Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dischi di pesatura in polistirene</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Indagine della funzione mitocondriale rappresenta un importante parametro di fisiologia cardiaca come i mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico, stress ossidativo, apoptosi, invecchiamento, encefalomiopatie mitocondriali e la tossicità dei farmaci. Detto questo, le tecnologie per misurare la funzione mitocondriale cardiaco sono molto richiesti. Una tecnica che si avvale di un approccio integrato per misurare la funzione mitocondriale è respirometrico fosforilazione ossidativa (OXPHOS) analisi. Il principio di valutazione respirometrico OXPHOS è incentrata la misurazione della concentrazione di ossigeno utilizzando un elettrodo di Clark. Mentre il fascio di fibre permeabilizzate consuma ossigeno, concentrazione di ossigeno nel declina camera chiusa. Utilizzando selezionati substrato-inibitore-disaccoppiatore protocolli di titolazione, gli elettroni sono forniti a siti specifici della catena di trasporto degli elettroni, che consentono la valutazione della funzione mitocondriale. Tecniche di preparazione prima dell&#39;analisi respirometrico della funzione mitocondriale, meccanici e chimici sono utilizzati per permeabilize il sarcolemma delle fibre muscolari. Permeabilizzazione chimica impiega saponina per perforare modo selettivo la membrana cellulare, pur mantenendo l&#39;architettura cellulare. Questo documento descrive accuratamente le fasi del processo di preparazione di fibre cardiache saponina di pelle per le misure di consumo di ossigeno per valutare OXPHOS mitocondriale. Inoltre, la risoluzione dei problemi indicazioni, nonché a specifici substrati, inibitori e uncouplers che possono essere utilizzati per determinare la funzione dei mitocondri in siti specifici della catena di trasporto degli elettroni sono forniti. È importante sottolineare che il protocollo descritto può essere facilmente applicata al tessuto cardiaco e scheletrico di vari modelli animali e campioni umani.

Saponina permeabilizzate preparazione fibra in collaborazione con respirometrico analisi fosforilazione ossidativa fornisce una valutazione integrativa della funzione mitocondriale. Respirazione mitocondriale in stati fisiologici e patologici possono riflettere varie influenze normative ivi comprese le interazioni mitocondriale, morfologia e biochimica.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

L'indagine della funzione mitocondriale rappresenta un parametro importante della fisiologia cardiaca, poiché i mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina per misurazioni polarografiche. Questo viene ottenuto innanzitutto asportando il cuore dal topo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare meccanicamente fasci di fibre cardiache contenenti al massimo da sei a otto fibre debolmente connesse.Successivamente, i fasci cardiaci vengono permeabilizzati chimicamente con saponina. I fasci cardiaci vengono quindi lavati per eliminare completamente la saponina e qualsiasi metabolita residuo. Infine, si possono ottenere risultati che forniscono informazioni sulla fosforilazione ossidativa mitocondriale mediante misurazioni polarografiche.Ciao, sono Curtis Huey del laboratorio della dottoressa Jane Sheer del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università di Calgary. Oggi vi mostreremo un procedimento per preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in situ.Iniziamo. Per iniziare questa procedura, rimuovere il cuore marino e posizionarlo in una piastra di Petri contenente la soluzione RP su g

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Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Il seguente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore di ratto funzionante isolato. Vengono inoltre discussi i metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

L'analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull'integrità mitocondriale degli spermatozoi.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Impara a preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale tramite respirometria ad alta risoluzione. Questo metodo consente di valutare la funzione mitocondriale in situ con precisione.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

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