Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina per misurazioni polarografiche. Questo viene ottenuto innanzitutto asportando il cuore dal topo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare meccanicamente fasci di fibre cardiache contenenti al massimo da sei a otto fibre debolmente connesse.

Successivamente, i fasci cardiaci vengono permeabilizzati chimicamente con saponina. I fasci cardiaci vengono quindi lavati per eliminare completamente la saponina e qualsiasi metabolita residuo. Infine, si possono ottenere risultati che forniscono informazioni sulla fosforilazione ossidativa mitocondriale mediante misurazioni polarografiche.

Ciao, sono Curtis Huey del laboratorio della dottoressa Jane Sheer del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell'Università di Calgary. Oggi vi mostreremo un procedimento per preparare fibre cardiache permeabilizzate con saponina. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in situ.

Iniziamo. Per iniziare questa procedura, rimuovere il cuore marino e posizionarlo in una piastra di Petri contenente la soluzione RP su ghiaccio. Utilizzando un microscopio stereoscopico, rimuovere con attenzione qualsiasi tessuto connettivo e grasso.

Tagliare il cuore a metà lungo il setto ed escindere da 10 a 25 milligrammi, peso fresco, di tessuto praticando un taglio dalla superficie endocardica del ventricolo sinistro. Assicurarsi che l'incisione segua l'orientamento delle fibre per minimizzare i danni meccanici al miocardio. Porre il campione di tessuto dissezionato in una piastra di Petri separata contenente la soluzione RP posta sul ghiaccio.

Tagliare il cuore in strisce longitudinali lungo l'orientamento delle fibre con un diametro compreso tra uno e 1,5 millimetri. Accorciare le strisce con un bisturi a una lunghezza compresa tra due e quattro millimetri, utilizzando la massima cautela e pinze affilate. Separare meccanicamente i fasci di fibre.

I fasci di fibre finali dovrebbero contenere al massimo da sei a otto fibre unite da piccole aree di contatto e con un peso compreso tra uno e tre milligrammi di peso umido. Visivamente, il tessuto cardiaco dovrebbe passare dal colore rosso originale a una tonalità rosa pallido. Iniziare la preparazione dei fasci di fibre cardiache posizionando una piastra a 12 pozzetti sul ghiaccio.

Risciacquare le pozzette con soluzione RP per minimizzare la contaminazione da calcio. Aggiungere tre millilitri di soluzione RP fredda con 50 microgrammi per millilitro di saponina in una delle pozzette. Successivamente, trasferire i fasci di fibre preparati meccanicamente nella pozzetta.

Incubare i fasci di fibre per 20 minuti con agitazione delicata sul ghiaccio. Risciacquare una nuova pozzetta con la soluzione mirror five, pipettando 10 millilitri di mirror five freddo in ghiaccio nella nuova pozzetta. Trasferire i fasci cardiaci nella pozzetta e incubarli per 10 minuti con agitazione delicata sul ghiaccio.

Dopo l'incubazione, ripetere l'operazione con il mirror five. Lavare due o tre volte con mirror five fresco. Trasferire i fasci cardiaci in 10 millilitri di mirror five ghiacciato ogni volta.

I ripetuti passaggi di lavaggio hanno lo scopo di garantire la rimozione della saponina A-T-P-A-D-P e di eventuali substrati residui dai fasci di fibre immediatamente prima dell'analisi respiratoria. Determinare il peso fresco dei singoli fasci di fibre tamponandoli su una superficie assorbente con pinzette, mantenendo la fibra a contatto con la superficie per cinque secondi o fino a quando tutta l'umidità viene assorbita. Utilizzando un'altra superficie assorbente, rimuovere il liquido in eccesso dalle pinzette.

Strappare la bilancia e posizionare il fascio di fibre su un piatto di plastica per la misurazione della massa. Trasferire il fascio di fibre cardiache in una nuova pozzetta con soluzione fredda a temperatura prossima a cinque gradi. Il fascio di fibre è ora pronto per la valutazione del consumo di ossigeno.

Le seguenti titolazioni di validazione vengono eseguite con un grafico di iniezione per titolazione a due camere XI. Questi esperimenti possono essere effettuati come protocollo indipendente oppure inclusi in un protocollo di titolazione, a seconda dell'obiettivo sperimentale e diagnostico degli studi di respirometria. L'ERO GRA 2K utilizzato in questo caso può misurare la concentrazione di ossigeno.

Il dispositivo è collegato a un computer dotato del software DAT lab, che consente di riportare le variazioni nella concentrazione di ossigeno come misurazioni in tempo reale del consumo di ossigeno per tutta la durata dell'esperimento. Prima di posizionare le fibre cardiache speculari nelle camere del dispositivo XI graft, aggiungere 2,1 millilitri di mirror five alla sede delle camere contenente i sensori polari grafici di ossigeno o POS. Quando le camere sono chiuse, saranno presenti due millilitri di mirror five nella camera del dispositivo XI graft.

Consentire un tempo adeguato per la saturazione con aria e l'equilibrazione dello specchio cinque a 37 gradi Celsius. Una volta raggiunto l'equilibrio, posizionare i campioni di fibra cardiaca nello specchio cinque contenuto nelle camere del trapianto XI mescolate mediante poliodina. Barre agitatrici rivestite in fluoruro.

Aumentare la concentrazione di ossigeno nelle camere GRAT a un valore compreso tra 250 e 550 micromolari utilizzando una siringa riempita di ossigeno. Attendere da cinque a dieci minuti per consentire la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno, utilizzando una siringa Hamilton da 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di glutammato 2 M alla camera per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolare.

Quindi utilizzare una siringa Hamilton separata per aggiungere cinque microlitri di malato 800 millimolari per una concentrazione finale di due millimolari nella camera. Questa titolazione serve a determinare la respirazione basale sostenuta dal complesso uno. Il flusso di ossigeno dovrebbe stabilizzarsi entro circa cinque minuti dalla titolazione, consentendo la determinazione del consumo di ossigeno nello stato due, ovvero il consumo di ossigeno.

In assenza di ADP dopo due-cinque minuti di consumo stabile di ossigeno, utilizzare una siringa micro Hamilton da 25 microlitri per aggiungere 20 microlitri di ADP 500 millimolare per una concentrazione finale saturante di cinque millimolari. Questa concentrazione viene utilizzata per raggiungere una saturazione superiore al 90%, consentendo la determinazione dello stato massimale. Tre. La respirazione mitocondriale attraverso il complesso I consente un ulteriore periodo di due-cinque minuti di consumo stabile di ossigeno.

Quindi utilizzare una siringa micro Hamilton da 10 microlitri per aggiungere cinque microlitri di citocromo C 4 millimolare, ottenendo una concentrazione finale di 10 micromolare. La concentrazione di ossigeno in questo momento viene utilizzata per eseguire un'analisi di controllo qualità dell'integrità della membrana mitocondriale esterna. Dopo altri due-cinque minuti di consumo stabile di ossigeno, aggiungere un microlitro di ACIN 4 milligrammi per millilitro per inibire la sintasi dell'ATP.

Questo passaggio di titolazione viene utilizzato per verificare l'integrità della membrana mitocondriale interna. Dopo la valutazione ripetuta del metabolismo ossidativo mitocondriale, prelevare il campione per la determinazione del peso secco o di un marcatore mitocondriale. Successivamente, rimuovere lo specchio numero cinque dalle camere di vetro del XI Grat.

Lavare le camere almeno tre volte con acqua distillata. Successivamente, lavare le camere almeno altre tre volte con etanolo al 100%. Per rimuovere gli inibitori solubili in etanolo, come l'oligomicina.

Proseguire con altri due lavaggi con etanolo al 70%. Quindi aggiungere etanolo al 70% e lasciarlo agire sulle camere di innesto XI per 30 minuti al fine di sterilizzarle. Infine, lavare le camere contenenti il POS almeno cinque volte con acqua bidistillata; il consumo di ossigeno in fibre cardiache opportunamente preparate viene valutato dal protocollo di controllo qualità, come mostrato; il rapporto di controllo respiratorio, o RCR, rappresenta l'accoppiamento tra consumo di ossigeno e fosforilazione ossidativa nelle preparazioni di fibre permeabilizzate.

L'RCR è il rapporto tra la velocità di respirazione nello stato tre e quella nello stato due, oppure alternativamente lo stato tre diviso lo stato quattro; preparazioni ben accoppiate e permeabili, simili a quelle cardiache, presentano un RCR compreso tra tre e sei. La titolazione del citocromo C viene utilizzata come validazione della corretta preparazione del tessuto. Il citocromo C è una proteina localizzata nello spazio intermembrana della membrana interna mitocondriale.

Quando la membrana esterna dei mitocondri è integra, il citocromo C endogeno rimane nello spazio intermembrana e la titolazione con citocromo C esogeno ha un effetto trascurabile sulla respirazione. Al contrario, se la membrana esterna dei mitocondri è danneggiata, il citocromo C endogeno può essere rilasciato dallo spazio intermembrana e inibirà la respirazione fino all'aggiunta di citocromo C esogeno, permettendo così di valutare l'influenza di stress patologici o sperimentali sull'integrità della membrana mitocondriale esterna. L'aggiunta di CIN viene utilizzata per valutare le alterazioni nella respirazione da perdita, ovvero il consumo di ossigeno che non contribuisce a un DP. Fibre di controllo o di tipo selvaggio dovrebbero essere sensibili all'aggiunta di CIN e mostrare una riduzione significativa del flusso di ossigeno.

Un basso RCR e una ridotta sensibilità all'oligomycin, che si traduce in un flusso di ossigeno relativamente elevato, indicano un danno alla membrana mitocondriale interna durante la preparazione. L'assenza di risposta alle titolazioni di inibizione da substrato e disaccoppiamento, come osservato in questo caso, potrebbe indicare periodi prolungati di incubazione di sasin e fasci di fibre scuoiate nelle soluzioni RP e mirror five. Gli sforzi successivi dovrebbero ridurre al minimo i tempi tra la soppressione dell'animale e le misurazioni del consumo di ossigeno.

Abbiamo appena mostrato come preparare fasci di fibre cardiache per misurazioni polargrafiche. È importante ricordare che durante questa procedura occorre prestare la massima attenzione durante la separazione meccanica delle fibre cardiache. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.