Iperinsulinemico-euglicemico pinza nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità all'insulina nel ratto cosciente non immobilizzato. Questo viene ottenuto cateterizzando innanzitutto l'arteria carotidea sinistra. Successivamente, si procede alla cateterizzazione della vena giugulare destra per garantire risultati ottimali.

I cateteri vengono lavati quotidianamente per mantenere la pervietà durante un periodo di recupero postoperatorio di cinque giorni. Alla fine, i risultati ottenuti dal clamp euglicemico iperinsulinemico con U possono mostrare le velocità di infusione del glucosio a livello dell'intero organismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere misurazioni dirette delle velocità di eliminazione del glucosio a livello dell'intero organismo a livelli fisiologici elevati di insulina.

È necessario preparare in anticipo i cateteri arteriosi e venosi prima dell'intervento chirurgico. I cateteri devono avere estremità smussate, essere riempiti con soluzione salina eparinizzata e sterilizzati con etanolo, con un filo di ritegno fissato saldamente rispettivamente a 2,7 o 3,2 centimetri da un'estremità per i cateteri arteriosi e venosi. In questo procedimento si utilizzano ratti maschi adulti della varietà spray dolly di circa 300 grammi.

Registrare il peso iniziale dell'animale e utilizzare questo valore per monitorare l'aumento di peso dopo l'intervento chirurgico. Lavorare in un'area chirurgica asettica. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 3% posizionandolo all'interno di una camera anestetica.

Trasferire l'animale lontano dall'area chirurgica e preparare il sito dell'incisione rimuovendo il pelo intorno al collo e alle spalle. Una volta rimosso il pelo, posizionare l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia con circa il 2% di isoflurano. Fissare l'animale al tavolo operatorio.

Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato verificando la presenza di riflessi plantari e/o oculari. Pulire il sito dell'incisione con etanolo al 70%, seguito da una detersione con Betadine e nuovamente con etanolo al 70%. Il primo passo della procedura consiste nell'eseguire una piccola incisione mediana verticale a 10 millimetri in senso superiore allo sterno.

Utilizzare pinze da dissezione microcurve per dissezionare in modo ottuso il tessuto e esporre il muscolo sternoioideo sinistro. Riflettere questo muscolo per evidenziare circa un centimetro dell'arteria carotidea sinistra. Posizionare le pinze da dissezione microscopiche sotto l'arteria carotidea per mantenerla ferma mentre si allontanano delicatamente i tessuti connettivi.

È importante isolare il nervo vago dall'arteria senza danneggiare né l'arteria né il nervo. Utilizzare un filo di seta sterile 4-0 per legare l'estremità cefalica. Clampare il vaso con pinze da dissezione microchirurgiche seghettate.

Perforare il legamento. Terminare con un adattatore per campionamento multiplo ven eject da 21 gauge. Rimuovere il tappo in acciaio inossidabile dal catetere e utilizzare un introduttore per catetere sterile per guidarlo nell'arteria.

Utilizzare pinze per assicurarsi che il catetere sia ben fissato. Parzialmente. Rilasciare le pinze da dissezione microchirurgiche, stringendo l'arteria e continuare a inserire il catetere fino alla perlina. A questo punto, la punta del catetere dovrebbe trovarsi nell'arco aortico.

Fissare due suture sotto la perlina e una sopra, quindi lavare il catetere con soluzione salina eparinizzata da 10 unità per millilitro. Per verificare che il catetere sia funzionante, richiudere l'estremità esterna del catetere con un tappo in acciaio inossidabile. Successivamente, praticare una dissezione ottusa del tessuto per esporre la giugulare esterna destra, isolare con cura la vena e legare la cefalica.

Terminare con sutura di seta. Pungere la vena con un ago da 21 gauge. Espellere l'adattatore per campionamento multiplo.

Rimuovere il tappo in acciaio inossidabile dal catetere e utilizzare un introduttore sterile per inserirlo fino alla sfera. Fissare due punti di sutura sotto la sfera e uno sopra. Quindi lavare la linea con soluzione salina ghiacciata eparinata a 10 unità per millilitro.

Per verificare che il catetere campionerà correttamente, richiudere l'estremità esterna del catetere con un tappo in acciaio inox utilizzando un ago smussato da 14 gauge passato sotto la pelle ed effettuare un'incisione sulla schiena tra le scapole. Successivamente, far passare i cateteri attraverso l'ago in modo che escano dalla parte posteriore del ratto. Dovrebbero risultare visibili circa quattro centimetri di ciascun catetere.

Tagliare 0,5 centimetri di tubo medico Tigon S 50 HL e posizionarlo intorno a entrambi i cateteri esterni. Fissare con nastro blu per le vene e rosso per le arterie. Verificare nuovamente i cateteri per assicurare la pervietà, quindi sciacquare e riempire con soluzione salina eparinizzata da 150 unità per millilitro per prevenire la formazione di coaguli.

Chiudere tutte le incisioni con punto di sutura in seta 3-0. Posizionare il ratto in posizione prona in una gabbia pulita preriscaldata con cibo facilmente accessibile. Una volta che il ratto ha riacquistato piena capacità di deambulazione e stato di allerta, riporlo nella gabbia di provenienza.

Lasciare il ratto riprendersi per tre-cinque giorni, monitorando quotidianamente segni di infezione, dolore e variazioni di peso. È fondamentale mantenere la pervietà del catetere per tutta la durata dello studio. Ogni giorno successivo all'intervento chirurgico, riempire siringhe da un millilitro con estremità liscia con soluzione salina eparinizzata da 150 unità per millilitro e chiuderle con un ago ottuso da 22 gauge.

L'ago ottuso viene inserito in 20 centimetri di tubo PE 50 con un raccordo in acciaio inossidabile da 23 gauge all'altra estremità. Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria dalla linea. Chiudere con una pinza la linea arteriosa esternalizzata dal ratto utilizzando pinze emostatiche, appena al di sotto del tappo.

Rimuovere il tappo del catetere in acciaio utilizzando un'altra paio di emostati. Inserire il raccordo del tubo collegato alla siringa nella linea arteriosa e rilasciare gli emostati che occludono il catetere arterioso esternalizzato. Successivamente, aspirare il sangue arterioso dal catetere nella siringa.

Se il catetere non aspira facilmente, potrebbe essere necessario spingere molto delicatamente una piccola quantità di soluzione attraverso il catetere per staccare la punta. Il catetere è considerato libero. Quando il sangue raggiunge la siringa, chiudere il tubo P 50 vicino alla siringa da un millilitro e smaltire la siringa.

Sostituire con una nuova siringa riempita di soluzione salina ghiacciata eparinizzata. Sbloccare il tubo e, tenendo la nuova siringa in posizione verticale, battere leggermente sulla siringa per far risalire le bolle d'aria verso l'alto e lontano dalla linea. Iniettare la soluzione salina eparinizzata finché la linea del catetere non risulti limpida e priva di sangue.

Chiudere con una molletta la linea arteriosa appena sotto il raccordo del tubo. Rimuovere il connettore della siringa dalla linea del catetere arterioso e sostituirlo con il tappo in acciaio inossidabile. Rilasciare le pinze emostatiche che occludono il catetere arterioso esternalizzato.

Ripetere questa procedura per la linea venosa. A causa della bassa pressione venosa, il campionamento potrebbe non essere possibile. In generale, se la soluzione salina eparinizzata può essere infusa con resistenza minima, è probabile che il catetere sia correttamente posizionato nella vena.

Prima di iniziare la procedura, gli animali devono essere pesati, devono essere preparate le soluzioni e deve essere assemblato l'apparato di fissaggio. Dopo aver pesato l'animale e aver confermato la pervietà del catetere, posizionarlo in un piccolo contenitore con lettiera che limiti, senza impedirlo, il movimento. I ratti utilizzati in questo studio sono sottoposti a digiuno per almeno cinque ore e soddisfano i requisiti di aumento ponderale postoperatorio. Il peso del ratto determina la quantità di insulina necessaria in questo caso.

Quattro milliunità per chilogrammo al minuto vengono somministrate a una velocità di due microlitri al minuto. Preparare una soluzione di destrosio al 50% e assicurarsi che ci sia una quantità sufficiente di entrambe le soluzioni per circa due ore; in questo caso vengono utilizzate siringhe da tre millilitri. Ora si è pronti per assemblare l'apparato di fissaggio.

Configurare i tubi e le pompe di infusione come mostrato qui. Applicare le siringhe di glucosio e insulina sulla pompa per siringhe. Chiudere i tubi con una pinza e lasciare rilassare il ratto per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento.

Per iniziare la procedura, prelevare un campione di insulina e un campione di ematocrito di base; il prelievo dell'ematocrito garantisce che il volume ematico sia mantenuto costante per tutta la durata dell'esperimento. In generale, i livelli di ematocrito non dovrebbero diminuire di oltre il 10% rispetto al valore iniziale. Ottenere un campione di glucosio di base e determinare il livello di glucosio da mantenere costante.

Qui si effettua il clamp alla glicemia a 5 millimolari. Dopo ogni prelievo ematico, lavare la linea arteriosa con un piccolo volume di soluzione salina eparinizzata a 10 unità per millilitro per prevenire la formazione di coaguli. Dopo aver determinato il livello di glucosio da mantenere costante, iniziare l'infusione della soluzione di insulina.

Registrare la glicemia a intervalli di cinque-dieci minuti e regolare la velocità di infusione di glucosio secondo necessità fino al raggiungimento di uno stato stazionario. Questo processo è generalmente empirico e può richiedere da 30 minuti a oltre due ore. Il livello di glucosio necessario per mantenere la glicemia dipende dal protocollo sperimentale.

Specie e condizioni presenti per essere considerate stabilizzate: tre letture consecutive devono rientrare in un intervallo definito. Tre letture entro circa un millimolare l'una dall'altra implicano che i livelli di glucosio hanno raggiunto uno stato stazionario. La velocità di infusione di glucosio necessaria per mantenere la glicemia per un periodo di 30 minuti, durante il quale possono essere ottenuti ulteriori campioni di sangue al minimo.

Un secondo campione di ematocrito di insulina plasmatica deve essere raccolto al termine della procedura di clampaggio. Gli animali possono essere utilizzati per ulteriori test oppure essere sottoposti a eutanasia e i tessuti raccolti per ulteriori analisi. A seconda dell'animale, le linee catetere possono rimanere pervie per cinque a sette giorni se la procedura viene eseguita correttamente.

La procedura di clampaggio può misurare la sensibilità all'insulina allo stato stazionario. È essenziale registrare i livelli di insulina e glucosio, nonché le velocità di infusione di glucosio e i valori di ematocrito. Lo stato stazionario si raggiunge quando i livelli di glucosio rimangono entro un millimolare l'uno dall'altro per un periodo di tempo di 30 minuti.

Il tasso di infusione del glucosio rivela il livello di glucosio esogeno necessario per mantenere una glicemia stabile, e il tasso possibile dovrebbe essere riportato nel tempo piuttosto che come singolo valore medio in un punto temporale. Devono essere riportati sia i livelli di insulina a digiuno sia quelli durante il clamp. Queste misurazioni confermano che l'insulina è stata somministrata con successo e permettono di rilevare eventuali differenze nella risposta insulinica tra i gruppi trattati. La misurazione dei livelli di ematocrito alla baseline e nuovamente dopo la procedura assicura che i livelli non siano diminuiti di oltre il 5% rispetto alla baseline nel corso dell'esperimento. Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la somministrazione di traccianti isotopici, possono essere utilizzati per valutare l'utilizzo del glucosio a livello dell'intero organismo e specifico per tessuto.