Name: Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-30T18:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Impara a misurare la formazione precoce di biofilm batterici e fungini con una piastra a 96 pozzetti e la colorazione al violetto di cristallo. Questo metodo rapido consente analisi qualitative e quantitative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

I miei ringraziamenti a Sherry Kuchma, Pete Newell e Robert Shanks per aver fornito le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01AI083256 al GAO

1. Crescita di un biofilm <ol><li> Crescere una cultura della wild-type Pseudomonas aeruginosa o ceppo mutante durante la notte in un terreno ricco (LB cioè) </li><li> Diluire gli oltre 1:100 cultura notte in mezzo fresco per saggi biofilm. Uno standard dosaggio medio biofilm per P. aeruginosa è M63 terreno minimo integrato con solfato di magnesio, glucosio e acidi casamino (vedi tabella). In alternativa biofilm promuovere mezzo che stimola la crescita planctonici meno e un biofilm più robusto, il glucosio e acidi casamino può essere sostituito con arginina come il carbonio e unica fonte di energia. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della diluizione per bene in un piatto da 96 pozzetti. Per le analisi quantitative, di solito uso pozzi 4-8 repliche per ogni trattamento. </li><li> Incubare la micropiastra per 4-24 ore a 37 ° C. </li></ol> 2. La colorazione del biofilm <ol><li> Dopo l'incubazione, le cellule discarica ruotando la piastra su e scuotendo il liquido. </li><li> Immergere delicatamente la piastra in una vasca d'acqua (ad esempio, utilizzare il fondo delle scatole pipetta punta per P1000 pipetmen come la vasca). Vuotare l'acqua. Ripetere la procedura una seconda volta. Questo passaggio consente di rimuovere le cellule distaccato e componenti multimediali che possono essere colorati nel passaggio successivo, e riduce in modo significativo la colorazione di fondo. </li><li> Aggiungere 125 ml di una soluzione 0,1% del cristalvioletto in acqua per ciascun pozzetto della micropiastra. Indossare guanti ed un camice da laboratorio rendendo la soluzione. Prestare attenzione nel valutare i CV come la polvere igroscopici e facilmente le macchie abbigliamento, pelle, ecc </li><li> Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min. </li><li> Risciacquare più volte il piatto 3-4 con l'acqua immergendo in una vasca di acqua come sopra, scuotere vigorosamente e asciugare su una pila di carta assorbente per eliminare la placca di tutte le cellule in eccesso e tintura. </li><li> Girare la micropiastra capovolta e secco per alcune ore o durante la notte. </li><li> Per le analisi qualitative, i pozzetti possono essere fotografati a secco. </li></ol> 3. Quantificare il biofilm <ol><li> Aggiungere 125 ml di 30% di acido acetico in acqua in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione per solubilizzare il CV. </li><li> Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min. </li><li> Trasferire 125 microlitri della CV solubilizzato a un nuovo fondo piatto piatto microtitolazione. </li><li> Quantificare assorbanza in un lettore di piastre a 550 nm con 30% di acido acetico in acqua come il vuoto. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2437/2437fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Evidenzia un risultato rappresentativo per i test eseguiti per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus. (A) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. aeruginosa (8 ore, 37 ° C). (B) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. fluorescens (6 ore, 30 ° C). (C) Un top-down vista del biofilm formato da S. aureus in un piatto fondo micropiastra (due pozzi, 24 ore, 37 ° C). P. aeruginosa e P. fluorescens sono entrambi organismi mobili e formano un biofilm all'interfaccia aria-liquido. S. aureus è non-mobili e forma un biofilm sul fondo del pozzo.

<ol><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signalling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Toole%2C+GA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).</li>
<li>Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadB+is+required+for+the+transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).</li>
<li>Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+lock+solutions+influence+staphylococcal+biofilm+formation+on+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces.</a> Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).</li>
<li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).</li>
<li>Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+requires+an+ABC+transporter+and+a+large+secreted+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein.</a> Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).</li>
<li>Mack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transposon+mutants+of+biofilm-producing+Staphylococcus+epidermidis+impaired+in+the+accumulative+phase+of+biofilm+production%3A+genetic+identification+of+a+hexosamine-containing+polysaccharide+intracellular+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin.</a> Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato con una grande varietà di specie microbiche. Microbi mobili tipicamente aderire alle pareti e / o fondo dei pozzi, mentre non mobili microbi tipicamente aderire al fondo dei pozzetti. Le condizioni ottimali per la formazione di biofilm (cioè, terreno di coltura, temperatura, tempo di incubazione) devono essere determinati empiricamente per ogni microbo. Vi consiglio l&#39;esecuzione di più repliche per ogni ceppo o condizione (4-8), e tra un controllo positivo e,...

<table><tbody><tr><td>1 X M63</td><td></td><td></td><td>Preparare una soluzione madre 5X di M63 sciogliendo 15 g di KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 35 g di K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; e 10 g di (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 1 L di acqua. Questa soluzione madre d&amp;#8211;non necessita di autoclave e può essere conservato a temperatura ambiente. Diluire il stock 5X in rapporto 1:5, autoclavare, raffreddare, quindi aggiungere i componenti desiderati.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>Aggiungere fino a una concentrazione finale di 1 mM. Preparare una soluzione madre al 1 M in acqua e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,2%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Casaminoacidi</td><td>BD Biosciences</td><td>223050</td><td>Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,5%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131</td><td>Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,4%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare per filtrazione. Questa fonte alternativa di carbonio/energia può sostituire glucosio e acidi casaminoici</td></tr><tr><td>Piastre a microtitolazione</td><td>BD Biosciences</td><td>353911</td><td>Piastra per saggi Falcon 3911, Microtest III, flessibile, 96 pozzetti, fondo rotondo, non sterile, non trattata per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Coperchi per piastre a microtitolazione</td><td>BD Biosciences</td><td>353913</td><td>I coperchi possono essere riutilizzati pulendoli con etanolo al 95% in acqua.</td></tr><tr><td>Violetto cristallo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229641000</td><td>Preparare una soluzione allo 0,1% in acqua.</td></tr></tbody></table>

microtitolazione dish biofilm saggio formazione

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

I biofilm sono comunità di microbi attaccati alle superfici, che si trova in campo medico, industriale e naturale. In realtà, la vita in un biofilm rappresenta probabilmente la modalità predominante di crescita per i microbi nella maggior parte degli ambienti. Biofilm mature hanno alcune caratteristiche distinte. Microbi biofilm sono in genere circondate da una matrice extracellulare che fornisce la struttura e la protezione per la comunità. I microbi che crescono in un biofilm hanno anche una caratteristica architettura generalmente costituiti da macrocolonies (contenente migliaia di cellule) circondato da piene di liquido canali. Biofilm cresciuto microbi sono anche noti per la loro resistenza a una vasta gamma di agenti antimicrobici, inclusi gli antibiotici clinicamente rilevanti. Il test piatto micropiastra è uno strumento importante per lo studio delle prime fasi di formazione di biofilm, ed è stato applicato principalmente per lo studio dei biofilm batterici, anche se questo test è stato utilizzato anche per studiare la formazione di biofilm fungine. Poiché questo test utilizza statica, batch condizioni di crescita, non consentono la formazione di biofilm maturo tipicamente associati ai sistemi di cella di flusso. Tuttavia, il test si è dimostrato efficace a individuare molti fattori necessari per l&#39;inizio della formazione di biofilm (cioè, flagelli, pili, adesine, enzimi coinvolti nella ciclico-di-GMP vincolanti e metabolismo) e così come i geni coinvolti nella produzione di polisaccaridi extracellulari. Inoltre, opera pubblicata indica che i biofilm cresciuto in piatti microtitolazione si sviluppano alcune proprietà di biofilm maturo, una tale tolleranza agli antibiotici e la resistenza alle effettori del sistema immunitario. Questo semplice test piatto microtitolazione consente la formazione di un biofilm sulla parete e / o fondo di un piatto di microtitolazione. La natura elevato throughput del test lo rende utile per schermi genetico, così come la formazione di biofilm test da ceppi diversi, in condizioni di crescita diverse. Le varianti di questo test sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm presto per una grande varietà di microbi, inclusi ma non limitati a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococchi, micobatteri e funghi. Nel protocollo qui descritto, ci concentreremo sull&#39;uso di questo test per studiare la formazione di biofilm da Pseudomonas aeruginosa organismo modello. In questo saggio, l&#39;estensione della formazione di biofilm è misurata utilizzando il colorante cristal violetto (CV). Tuttavia, una serie di altre macchie colorimetriche e metabolici sono stati segnalati per la quantificazione della formazione di biofilm utilizzando il test micropiastra. L&#39;, facilità a basso costo e flessibilità del dosaggio micropiastra ha reso uno strumento fondamentale per lo studio dei biofilm.

Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

I biofilm sono comunità di microbi aderenti a superfici, riscontrabili in contesti medici, industriali e naturali. In effetti, la vita all'interno di un biofilm...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire e studiare i biofilm in una piastra microtitolata. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo una coltura batterica a una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, la coltura viene incubata alla temperatura e per il tempo appropriati, in base al microrganismo, per colorare il biofilm.Viene aggiunto violetto di cristallo in ogni pozzetto contenente batteri, quindi i batteri vengono lavati. Infine, i pozzetti vengono fotografati e i batteri quantificati. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'accumulo e la formazione di biofilm nel tempo attraverso la misurazione del violetto di cristallo.Il principale vantaggio di questo metodo è che consente ai ricercatori di valutare rapidamente la formazione di biofilm in organismi batterici e fungini. Può inoltre essere configurato per schermate genetiche ad alto rendimento, oppure per identificare nuovi composti terapeutici in grado di inibire la formazione di biofilm. Preparare una coltura notturna di cinque millilitri del ceppo selvatico di pseudomonas, aerogen o di una variante mutante.In mezzo LB, diluire 10 microlitri di coltura in un millilitro di M 63

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione...

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

Questo video mostra un test per lo screening di composti antimicrobici che eliminano efficacemente i biofilm utilizzando una piastra a pioli. La metodologia monitora lo stato metabolico del biofilm dopo il trattamento con composti antimicrobici, facilitando la determinazione della concentrazione minima di eradicazione del biofilm.

Un saggio del biofilm su piastra a pioli per lo screening di agenti antibatterici

Il video dimostra un saggio di aderenza in fase solida per valutare la formazione di biofilm. In una piastra a più pozzetti, i batteri nei terreni integrati con sali biliari aderiscono alle superfici solide, formando biofilm, che viene confermato dalla colorimetria attraverso la colorazione con cristallovioletto e il trattamento con etanolo.

Un saggio di aderenza in fase solida per valutare la formazione di biofilm

Il video mostra un saggio di dispersione di biofilm utilizzando una piastra multi-pozzetto. Il trattamento con tampone e glucosio smonta il biofilm, rilasciando batteri, mentre i sali biliari inducono stress, trattenendo i batteri nella sostanza polimerica extracellulare protettiva. Una maggiore dispersione con tampone e glucosio conferma il successo del disassemblaggio del biofilm, stimato dalla misurazione delle unità formanti colonie.

Rilevamento del disassemblaggio del biofilm attraverso un saggio di dispersione

La maggior parte delle infezioni batteriche produce un biofilm. In virtù del loro ambiente, i batteri associati al biofilm sono spesso fenotipicamente resistenti ai farmaci. Le nuove molecole antibatteriche che uccidono i batteri nei biofilm sono quindi una priorità assoluta. Stabiliamo un test per lo screening rapido di composti antimicrobici efficaci nell'eradicazione dei biofilm.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Questo studio presenta lo sviluppo di metodologie riproducibili per studiare gli inibitori del biofilm e i loro effetti sulla multicellularità del Bacillus subtilis.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

Le infezioni da biofilm mostrano un'alta tolleranza alla chemioterapia. Nessun singolo test è in grado di catturare la complessità dei biofilm. Invece, sono necessari saggi complementari. Presentiamo una piattaforma di screening (sviluppata per S. aureus) che combina saggi di vitalità, biomassa e matrice di biofilm. Consente la scoperta di farmaci anti-biofilm, compresa la valutazione degli effetti chemioterapici a lungo termine.

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Questo protocollo presenta la metodologia per eseguire misurazioni della crescita del biofilm e della biomassa utilizzando dispositivi PCR-plate a pozzo profondo autoassemblati per lo screening statico del biofilm a coperchio ancorato a 96 pozzetti ad alta produttività.

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Impara a misurare la formazione precoce di biofilm batterici e fungini con una piastra a 96 pozzetti e la colorazione al violetto di cristallo. Questo metodo rapido consente analisi qualitative e quantitative.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Esplora altri video