Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione
30 gennaio 2011
Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire e studiare i biofilm in una piastra microtitolata. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo una coltura batterica a una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, la coltura viene incubata alla temperatura e per il tempo appropriati, in base al microrganismo, per colorare il biofilm.
Viene aggiunto violetto di cristallo in ogni pozzetto contenente batteri, quindi i batteri vengono lavati. Infine, i pozzetti vengono fotografati e i batteri quantificati. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'accumulo e la formazione di biofilm nel tempo attraverso la misurazione del violetto di cristallo.
Il principale vantaggio di questo metodo è che consente ai ricercatori di valutare rapidamente la formazione di biofilm in organismi batterici e fungini. Può inoltre essere configurato per schermate genetiche ad alto rendimento, oppure per identificare nuovi composti terapeutici in grado di inibire la formazione di biofilm. Preparare una coltura notturna di cinque millilitri del ceppo selvatico di pseudomonas, aerogen o di una variante mutante.
In mezzo LB, diluire 10 microlitri di coltura in un millilitro di M 63 fresco, un mezzo minimo integrato con magnesio, solfato, glucosio e acidi cassino. Successivamente, trasferire con una pipetta 100 microlitri di coltura diluita in pozzetti separati di una piastra rotonda a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro-24 ore per consentire la formazione di biofilm.
Una volta formati i biofilm, rimuovere la piastra dall'incubatore e scartare i sopranatanti di coltura capovolgendo la piastra e agitando per eliminare il liquido. Quindi immergere delicatamente la piastra in un contenitore piccolo pieno d'acqua per rimuovere eventuali cellule non legate o componenti del mezzo che potrebbero causare una colorazione di fondo. Agitare via l'acqua, asciugare la piastra tamponandola e ripetere il lavaggio.
Una volta che la piastra è pulita, aggiungere 125 microlitri per pozzetto di una soluzione di violetto di cristallo allo 0,1%. Per colorare le cellule, incubare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
Quindi lavare la piastra da tre a quattro volte come illustrato in precedenza. Asciugare energicamente la piastra su una pila di fazzoletti di carta per rimuovere il liquido in eccesso dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e lasciarla asciugare capovolta per alcune ore. Una volta asciutta la piastra, le pozzette possono essere fotografate con una fotocamera digitale per valutare la qualità dei biofilm.
Come mostrato qui, i batteri mobili come Pseudomonas aerogen a sinistra e Pseudomonas fluorescence a destra tendono a formare biofilm nella zona dell'interfaccia aria-liquido durante la crescita del biofilm. Al contrario, i batteri Staphylococcus ora, che sono non mobili, formano biofilm sul fondo delle pozzette. Per quantificare i biofilm, aggiungere prima 125 microlitri di acido acetico al 30% in ogni pozzetta, inclusa una pozzetta vuota contenente solo acido acetico, e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti per permettere la solubilizzazione del violetto di cristallo trattenuto dai biofilm.
Successivamente, trasferire i 125 microlitri di colorante solubilizzato da ogni pozzetto a una nuova piastra microtitolatrice piatta da 96 pozzetti. Utilizzando un lettore di piastre, quantificare l'assorbanza di ogni pozzetto a una lunghezza d'onda di 550 nanometri. La concentrazione di violetto cristallo in ogni pozzetto è proporzionale al numero di cellule nel biofilm.
Questo grafico mostra una quantificazione della formazione e dell'accumulo di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens nel tempo durante l'incubazione a 37 gradi Celsius. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di biofilm in piastra a 96 pozzetti, utilizzato in combinazione con altri metodi come la microscopia. Tale metodo può contribuire in modo significativo alla nostra comprensione della formazione del biofilm.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo saggio descrive un metodo rapido per misurare la formazione precoce di biofilm in batteri e funghi utilizzando una piastra a microtitolazione. Il biofilm viene visualizzato mediante colorazione con violetto di cristallo, consentendo analisi sia qualitative che quantitative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Ricerca sui biofilm
- Sviluppo di saggi
Sfondo
- I biofilm sono comunità di microrganismi che aderiscono alle superfici.
- Lo studio della formazione dei biofilm è fondamentale per comprendere il comportamento microbico.
- Il violetto di cristallo è un colorante comunemente utilizzato per visualizzare i biofilm.
- Questo metodo consente una valutazione rapida dello sviluppo del biofilm.
Scopo dello studio
- Stabilire un saggio affidabile per la formazione precoce del biofilm.
- Quantificare l'accumulo di biofilm nel tempo.
- Facilitare lo studio delle interazioni microbiche nei biofilm.
Metodi Utilizzati
- Aggiungere la coltura batterica in una piastra microtitolata a 96 pozzetti.
- Incubare la coltura alla temperatura e al tempo appropriati.
- Aggiungere il violetto di cristallo per colorare il biofilm.
- Lavare i pozzetti e scattare una fotografia per quantificare la formazione del biofilm.
Risultati principali
- I risultati mostrano l'accumulo di biofilm nel tempo.
- Dati quantitativi possono essere ottenuti da misurazioni del violetto di cristallo.
- Il saggio fornisce una chiara visualizzazione della formazione del biofilm.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per lo studio della formazione iniziale dei biofilm.
- Può essere applicato a diverse specie batteriche e fungine.
- Il saggio migliora la comprensione della dinamica microbica dei biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il saggio di formazione del biofilm in piatto microtitolatore consente una valutazione rapida e ad alto rendimento dello sviluppo del biofilm nelle fasi iniziali, supportando la validazione degli bersagli nella scoperta di agenti antimicrobici. Quantificando l'accumulo del biofilm mediante colorazione con violetto di cristallo, il metodo fornisce dati riproducibili e quantitativi che aiutano a ridurre i rischi associati ai candidati terapeutici mirati all'adesione microbica e alla persistenza. Questo approccio scalabile è applicabile a sistemi batterici e fungini, facilitando lo screening nelle fasi iniziali di composti modulatori del biofilm.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche identificando i geni e i fattori necessari per l'inizio della formazione del biofilm, come adesine, pili e vie di segnalazione del ciclico-di-GMP.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli mediante schermate di perdita di funzione in ceppi microbici in condizioni standardizzate.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo i composti che inibiscono la formazione precoce del biofilm da quelli privi di effetto.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi microbici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo metriche riproducibili per la formazione di biofilm.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione del saggio attraverso passaggi standardizzati di incubazione, colorazione e quantificazione, utilizzando un formato a piastra da 96 pozzetti.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma per schermate genetiche e librerie di composti su diverse ceppi microbici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Collega i dati sulla formazione precoce del biofilm ai profili di resistenza fenotipica, sostenendo la riduzione del rischio meccanicistica dei candidati antimicrobici.
- Continuità preclinica: Permette decisioni di avanzamento ponderate sul rischio collegando l'inibizione del biofilm in vitro alla tolleranza agli antibiotici e ai fattori effettori immunitari.
- Allineamento dei biomarcatori: Sostiene lo sviluppo di biomarcatori traslazionali attraverso output quantificabili che si correlano ai fenotipi di tolleranza associati al biofilm.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per programmi anti-infettivi rivolti alla resistenza mediata da biofilm.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di adesione microbica e formazione di biofilm mediante perturbazioni genetiche e chimiche.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la formazione standardizzata di biofilm e la quantificazione del violetto di cristallo, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Evidenzia misurazioni quantitative di assorbanza a 550 nm che permettono il confronto della biomassa del biofilm tra diverse condizioni e ceppi.
- Ricerca Translazionale: Collega i dati iniziali sull'inibizione del biofilm alla rilevanza preclinica modellando i meccanismi di tolleranza osservati nelle infezioni croniche.
- Riutilizzo Aziendale: Propone il metodo come piattaforma di screening riutilizzabile per programmi antimicrobici, antifungini e antibiofilm su diversi modelli di patogeni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione dell'obiettivo attraverso una riduzione misurabile della formazione del biofilm in seguito a interventi genetici o farmacologici.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità in formati a 96 pozzetti per applicazioni ad alto rendimento.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui nell'identificazione dei composti leader, riducendo i falsi positivi mediante quantificazione ortogonale del biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei composti aggiustata per il rischio, basata sull'inibizione dose-dipendente della formazione precoce del biofilm.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze microbiologiche in tecniche sterili, preparazione delle colture e manipolazione dei biofilm.
- Presuppone l'accesso a lettori di piastre in grado di misurare l'assorbanza a 550 nm e a piastre microtitrate standard da 96 pozzetti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i tempi di incubazione, i passaggi di lavaggio e i protocolli di colorazione, al fine di ridurre al minimo la variabilità tra i pozzetti.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si voglia estendere il metodo a organismi non modello o a funghi con proprietà adesive diverse.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'impossibilità di modellare l'architettura di biofilm maturi o fenotipi dipendenti dal flusso, come indicato nella fonte.
