Name: Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Impara a isolare e espandere cellule staminali neurali da embrioni di topo E14 mediante il saggio di neurosfere. Questo metodo consente di coltivare sfere neurali per studiare lo sviluppo cerebrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.

1. Impostazione di base prima di procedere alla dissezione: <ol><li> Volume appropriato di completo media NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente. </li><li> Il mezzo è riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Freddo HEPES-buffered medio minimo indispensabile (HEM), con elevata concentrazione di antibiotici (10%) è preparato per la dissezione e lo scopo di lavaggio. In alternativa, media NSC basale con l'integrazione di antibiotici può essere usato anche per questo scopo. </li><li> 25-30 ml di HEM freddo contenenti antibiotici è erogato in sterili 50 ml provette per la raccolta degli embrioni. </li><li> Diversi 10 centimetri di plastica piastre di Petri necessario a contenere gli embrioni e il cervello durante la dissezione e anche per tenere il tessuto sezionato. </li><li> Gli strumenti chirurgici, necessari per eliminare gli embrioni (forbici grandi, piccole forbici a punta, pinze grandi, piccole pinze curve) o per la dissezione del cervello embrionale (pinze piccolo, curvo pinza sottile, 45 ° angolo una pinza sottile, e forbicine) vengono sterilizzati con perle di vetro sterilizzatore a 250 ° C o altri metodi di autoclave disponibili. </li><li> Microscopio a dissezione è pulito con alcool al 70% e impostare all'interno di una cappa a flusso laminare o PC2. </li></ol> 2. La raccolta E14 cervello di topo e Micro-dissezione: <ol><li> Una volta accoppiato il mouse incinta è anestetizzato al giorno 14 ° di gestazione secondo il proprio protocollo istituzionale animali approvati. </li><li> Dislocazione cervicale viene eseguita per assicurarsi che l'animale non soffre il dolore e angoscia. </li><li> Il mouse anestetizzato è posto sulla sua schiena su una carta velina assorbente, e l'addome è sciacquato con etanolo al 70% per sterilizzare la zona. </li><li> La pelle sopra l'addome viene afferrata con una pinza di grandi dimensioni, e poi la pelle e la fascia sottostante è tagliato con le forbici di grandi dimensioni per esporre la cavità addominale e le corna uterine. </li><li> Cervice vengono rimossi con una pinza e forbici piccole e vengono trasferiti in una da 50 ml tubo contenente HEM freddo. </li><li> I tessuti uterino vengono trasferiti al cofano e poi sciacquate con una o due volte il volume abbastanza fresca HEM sterile fredda per rimuovere possibili contaminanti come il sangue e capelli. </li><li> I tessuti uterino vengono poi trasferiti su un piatto da 10 centimetri di Petri contenente HEM freddo. </li><li> Le corna uterine vengono aperti utilizzando piccole pinze e forbici curve e gli embrioni vengono trasferiti in un piatto di 10 centimetri nuova, che contiene HEM freddo. </li><li> Le teste degli embrioni sono separati a livello cervicale del midollo spinale e trasferito in un altro piastra Petri contenente HEM freddo. </li><li> La piastra Petri viene trasferita sotto un microscopio da dissezione per rimuovere il cervello dal cranio. </li><li> Le teste sono tenute con una pinza sottile curva dal lato caudale così come il lato dorsale delle teste sono rivolte verso l'alto. Utilizzando micro-forbici, prima un taglio orizzontale è fatto sopra gli occhi per poi proseguire sulla linea mediana dalla fronte verso la parte posteriore della testa. Assicurati di tagliare attraverso la pelle e il cranio e non danneggiare il cervello sottostante. </li><li> Il cervello è rimosso dal cranio premendo i bordi della sezione di taglio con un movimento all'indietro con le pinze curve. Questa procedura è continuata fino a quando tutti i cervelli vengono rimossi dal teschi. </li><li> Il cervello è tenuta ferma con le pinze curve in modo che il lato dorsale è rivolto verso l'alto e quindi utilizzando microscissors viene eseguito un taglio attraverso la corteccia di ciascun emisfero si estende dal bulbo olfattivo alla parte posteriore dell'emisfero per esporre le eminenze gangliari. </li><li> Utilizzando la pinza curva in una mano e il 45 ° angolo forcipe nell'altra, i lembi taglio di cortecce sono sparsi e le eminenze gangliari vengono sezionati fuori. </li><li> Il tessuto sezionato viene inserito in una capsula di Petri sterile 10 centimetri, e questa procedura viene ripetuta fino a quando tutti i cervelli sono stati micro-sezionato. </li><li> Pezzi di tessuto sono raccolti con 1 ml di medium NSC in una pipetta da 1 ml di punta e trasferito in una provetta da centrifuga da 15 mL. </li><li> Tessuto è poi dissociato accuratamente, ma delicatamente, premendo la punta della pipetta sul fondo della provetta e pipettaggio la sospensione su e giù. In questo modo le macchie sono suddivisi in singole cellule. Pipettaggio viene eseguita 3-4 volte in modo che una sospensione lattiginosa come si ottiene. Poi, la sospensione è lasciata riposare per 1-2 minuti in modo da non dissociati grumi precipitati. </li><li> Quasi la sospensione cellulare viene trasferita l'intera al tubo di altri e poi un altro 1 ml di medium NSC viene aggiunto al grumi rimasti e dissociato di singola cellula come descritto. </li><li> Il contenuto dei tubi sono raggruppati e centrifugato per 5 minuti a temperatura ambiente, a 700rpm (110g). </li><li> Il supernatante viene aspirata giù per l'attuale pellet, e le cellule sono risospese in 1 ml di medium completo NSC. </li><li> Il mezzo è delicatamente pipettati su e giù peravere una sospensione omogenea singola cella. </li><li> 10 ml di sospensione cellulare viene miscelato con 90 ml di trypan blu per eseguire una conta cellulare. </li><li> Infine, le cellule sono placcati alla densità di 2x10 5 cellule / ml in piena medio NSC integrato con 20ng / mL di fattore di crescita epidermico (EGF). 5 ml di mezzo è usato per T25, 20 ml per il T75 e T175 40 ml per fiaschi. </li><li> Neurosfere si formano in 5-7 giorni se posti in incubazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. In 6-7 giorni, le sfere dovrebbe misurare tra 150-200 micron e sarà pronto per sottocultura (passaggio). </li></ol> 3. Passaging ed espansione di NSCs embrionali: <ol><li> Quando le neurosfere sono pronti per la subcultura (150-200 micron di diametro), il mezzo con sfere sospese viene rimossa dal fiaschi, collocati in un apposito tubo di tessuto sterile cultura dimensioni, e centrifugati a 700 giri (110 g) per 5 minuti a a temperatura ambiente. </li><li> Il supernatante viene scartato e le sfere sono risospesi in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> La sospensione cellulare viene quindi incubato in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 minuti, poi un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene utilizzata per interrompere l'attività tripsina. </li><li> La sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato. </li><li> La sospensione cellulare viene centrifugata a 700 rpm (110g) per 5 min. Poi, il sopranatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di medium completo NSC. </li><li> 10 ml di sospensione cellulare viene miscelato con 90 ml di trypan blu per eseguire una conta cellulare. </li><li> Le cellule sono placcati in una concentrazione di 5x10 4 cellule / ml in totale medio NSC integrato con 20ng / mL di EGF in un apposito pallone di colture di tessuti dimensioni. 5 ml di mezzo è usato per T25, 20 ml per il T75 e T175 40 ml per fiaschi. </li><li> Neurosfere secondarie si formano in 5-7 giorni se posti in incubazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Nella scuola primaria la cultura embrionale NSC, la maggior parte delle cellule diventa ipertrofica e allegare ai piatti della cultura del tessuto su placcatura. Mentre la maggior parte delle cellule muoiono o differenziare, dopo 2-3 giorni, le cellule proliferative fare piccoli gruppi di cellule che si staccano dal substrato (Figura 1). Formazione di grandi aggregati sferoidali nelle prime 48 ore di cultura non deve essere confuso con sfere primarie. Formazione di aggregati dipende principalmente dalla quantità di detriti e non dissociata grumi di tessuto nella cultura. Neurosfere vero fase sono luminose e diventano più sferiche l'aumento delle dimensioni (Figura 2). Microspikes piccolo appare sulla superficie esterna di sfere vitali e sani (Figura 3). Dopo 5-7 giorni, le sfere devono essere rotonda, ma non compattato, e dovrebbe misurare tra 150 e 200 micron di diametro. Se neurosfere sono autorizzati a crescere troppo grandi (dopo 9-10 giorni in coltura), potrebbero formare aggregati o diventare di colore scuro a causa della morte delle cellule al centro delle sfere (vedi video). Neurosfere di grandi dimensioni potrebbe finalmente cominciare a differenziare in situ (allegando al substrato e la migrazione verso la periferia). E 'anche difficile dissociare neurosfere di grandi dimensioni e sottocultura loro. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Primaria E14 cultura NSC 3 giorni dopo placcatura. Frecce indicano i cluster proliferazione di NSC. Originale ingrandimento; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Primaria E14 cultura NSC 7 giorni dalla placcatura. Originale ingrandimento; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Passage uno E14 neurosfere 5 giorni dopo la placcatura. Si noti la micro-spikes (frecce) alla periferia delle sfere. Ingrandimento originale; 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il dosaggio neurosfere è il metodo di scelta per l&#39;isolamento e l&#39;espansione delle cellule staminali neurali 1-5 per la sua semplicità e riproducibilità. Questo saggio è uno strumento prezioso per la grande generazione di cellule precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbe essere utilizzato sia per in vitro e in vivo. Va sottolineato che neurosfere potrebbe essere generato sia dalla bona fide cellule staminali e progenitori neurali più ristretto. Pertanto, il ca...

* Per rendere HEM, mescolare 110L pacchetto di MEM and160ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il PH finale a 7,4 e conservarlo a 4 ° C.

stabilire embrionali di topo neural stem cell culture del saggio di neurosfere

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammiferi, le cellule staminali agisce come una fonte di cellule indifferenziate per mantenere la genesi e il rinnovamento cellulare in vari tessuti ed organi durante la vita dell&#39;animale. Essi possono potenzialmente sostituire le cellule che si perdono nel processo di invecchiamento o in via di infortuni e malattie. L&#39;esistenza di cellule staminali neurali (NSC) è stato descritto da Reynolds e Weiss (1992) negli adulti dei mammiferi sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando un siero privo di sistema di coltura romanzo, il saggio neurosfere (NSA). Da questo test, è anche possibile isolare ed espandere NSCs provenienti da diverse regioni del SNC embrionale. Queste NSCs espanse in vitro sono multipotenti e possono dar luogo a tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale. Mentre la NSA sembra relativamente semplice da eseguire, l&#39;attenzione alle procedure dimostrato qui è necessario per ottenere risultati affidabili e coerenti. Questo video dimostra praticamente NSA per generare ed espandere NSCs fin dal primo giorno embrionale 14-topo tessuto cerebrale e fornisce dettagli tecnici così si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta E14 embrioni di topo, microdissezione cervello per raccogliere le eminenze gangliari, dissociazione dei tessuti raccolti in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcatura cellule in coltura NSA. Dopo 5-7 giorni di cultura, la risultante neurosfere primarie sono diversi passaggi di espandere ulteriormente il numero delle NSCs per gli esperimenti futuri.

Questo protocollo video mostra l&#39;applicazione del test neurosfere per l&#39;isolamento e l&#39;espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Nei mammiferi, le cellule staminali fungono da fonte di cellule indifferenziate per mantenere la genesi e il rinnovamento cellulare in diversi tessuti e organi durante la vita...

Lo scopo di questo protocollo video è isolare ed espandere cellule staminali neurali dal cervello di topo embrionale utilizzando il saggio delle neurosfere. La procedura comprende il prelievo di embrioni di topo E14, seguito dalla microdissezione cerebrale per ottenere le eminenze gangliari, la dissociazione del tessuto prelevato per ottenere una sospensione di singole cellule e, infine, la semina delle cellule in coltura di neurosfere. Salve, sono Hassan Ali del laboratorio del Dott. Brent Frennels presso il Mite Brain Institute dell'Università della Florida.Oggi vi mostrerò come stabilire una coltura di neurosfere a partire dal cervello di topo embrionale, utilizzando il saggio delle neurosfere. Utilizziamo regolarmente questo saggio nel nostro laboratorio per isolare ed espandere cellule staminali neurali. Ok, cominciamo.Anestetizzare un topo gravido accoppiato in un determinato momento. Al giorno 14 di gestazione, eseguire una lussazione cervicale e sciacquare l'addome con etanolo al 70%. Afferrare la pelle dell'addome utilizzando pinze grandi e quindi tagliare la pelle e la fascia sottostante con forbici grandi.Per esporre la cavità addominale e le corna uterine, rimuovere le corna uterine contenenti gli embrioni e trasferirle in un tubo conico da 50 ml contenente him freddo. Dopo aver trasferito i tessuti uterini nella cappa a flusso laminare di classe II, rimuovere l'him dal tubo da 50 ml e risciacquare i tessuti con un volume sufficiente di him fresco e freddo per eliminare contaminanti come sangue e peli; eseguire due o tre lavaggi in questo modo. Trasferire i tessuti uterini in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente him freddo.Aprire le corna uterine utilizzando pinzette curve e forbici piccole e trasferire gli embrioni in una nuova piastra contenente emal fredda. Ripetere questa procedura fino a quando tutti gli embrioni sono stati raccolti. Successivamente, posizionare gli embrioni sotto il microscopio stereoscopico.Separare le teste degli embrioni al livello del midollo spinale cervicale e trasferirle in un'altra capsula di Petri contenente em freddo. Trattenere la testa con pinzette curve fini utilizzando forbici microchirurgiche. Prima, effettuare un taglio orizzontale sopra il naso e poi continuare a tagliare lungo la linea mediana dalla fronte verso la parte posteriore della testa.Assicurarsi di tagliare attraverso la pelle e il cranio senza danneggiare il cervello sottostante. Rimuovere il cervello dal cranio spingendo all'indietro i margini della sezione tagliata utilizzando la pinza curva. Continuare questa procedura fino a quando tutti i cervelli sono stati rimossi dai crani.Tenere fermo il cervello utilizzando pinze curve in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto, quindi con forbici microchirurgiche tagliare la corteccia di ciascun emisfero dalle bulbi olfattivi fino alla parte posteriore dell'emisfero. Per esporre le eminenze gangliari, mantenendo il cervello in posizione, dissezionare l'intera eminenza gangliare con pinze angolate a 45 gradi e trasferirla in un'altra capsula di Petri. L'eminenza gangliare è chiaramente visibile qui, con le sue parti mediale e laterale.In alternativa, è possibile dissezionare le eminenze gangliari rimuovendo i tessuti circostanti utilizzando pinzette fini. È anche possibile tagliare l'intera eminenza in una metà mediale e una laterale, se si desidera coltivare cellule provenienti da una di queste regioni.Ripetere questa procedura fino a quando tutti i cervelli sono stati microdissecati. Utilizzare un millilitro di mezzo per cellule staminali neurali per raccogliere i frammenti di tessuto e trasferirli in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Lasciare depositare gli aggregati di tessuto nel tubo da 15 millilitri per evitare di lasciare residui di tessuto.Rimuovere parte del mezzo sovrannatante e lavare la base della piastra di Petri per trasferire qualsiasi tessuto aggiuntivo nel tubo da 15 ml. Appoggiare la punta della pipetta sul fondo del tubo. Pipettare la sospensione su e gi&ugrave; da tre a quattro volte per frammentare il tessuto, ottenendo una sospensione di cellule singole.Quindi lasciare decantare la sospensione per un minuto in modo che gli aggregati non associati precipitino; trasferire quasi l'intera sospensione cellulare in un altro tubo da 15 ml. Aggiungere quindi un millilitro di mezzo per cellule staminali neurali agli aggregati rimanenti e dissociarli in singole cellule. Aspirare il contenuto dei tubi.Quindi centrifugare la sospensione a 700 giri/min o a 110 ×g per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo per cellule staminali neurali. Prelevare 10 microlitri della sospensione cellulare e mescolare accuratamente con 90 microlitri di trian blu.Quindi prelevare 10 microlitri di questa sospensione e trasferirli su un emocitometro. Eseguire un conteggio cellulare. Trasferire un totale di 20 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo conico da 50 ml per seminare una fiasca T80.Quindi mescolare la sospensione cellulare e aggiungere una quantità adeguata di cellule per ottenere una densità totale di 200.000 cellule per millilitro o 4 milioni di cellule per fiala T80. Aggiungere EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Mescolare le cellule presenti nel mezzo completo per cellule staminali neurali con il fattore di crescita e trasferire la sospensione cellulare in fiale T80.Etichettare il matraccio e osservare le cellule al microscopio per assicurarsi di avere una sospensione di cellule singole senza aggregati di tessuto. Trasferire il matraccio in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per cinque a sette giorni. Dopo cinque a sette giorni, valutare il matraccio al microscopio.A questo punto, si sono formati neurosfere che dovrebbero avere un diametro compreso tra 150 e 200 micron e sono pronte per essere sottocultivate. Raccogliere il contenuto della fiala in un tubo sterile per colture cellulari di dimensioni adeguate, centrifugare il tubo e scartare il soprannatante. Risospendere le sfere in un millilitro centrale di tripsina preriscaldata e collocare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi per due minuti.Quindi aggiungere un volume equivalente di inibitore della tripsina e mescolare bene ma delicatamente per arrestare l'attività della tripsina. Centrifugare nuovamente e rimuovere il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo per cellule staminali neurali ed eseguire un conteggio cellulare come indicato in precedenza. Per seminare una fiasca T175, trasferire un totale di 40 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo conico da 50 ml.Quindi mescolare le cellule e aggiungere una quantità appropriata di cellule per ottenere una densità totale di 50.000 cellule per M o 2 milioni di cellule per fiala T175. Successivamente, aggiungere EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Mescolare le cellule presenti nel mezzo completo per cellule staminali neurali con il fattore di crescita e trasferire la sospensione cellulare in una fiala T175.Etichettare il matraccio e trasferirlo in un incubatore per cinque a sette giorni. Questo è un esempio di coltura primaria di cellule staminali neurali E 14. Tre giorni dopo la semina, le frecce indicano aggregati di cellule staminali neurali in proliferazione.È inoltre possibile osservare cellule aderenti al substrato e differenziate. Questo è un esempio di coltura primaria di cellule staminali neurali E14 a sette giorni dal seeding. Come si può notare, sono presenti sfere di diverse dimensioni.Esistono anche cellule che sono differenziate. La quantità di detriti è molto inferiore rispetto alle colture di neurosfere primarie da adulto. Inoltre, le sfere non sono compatte e presentano microsporgenze lungo la periferia, indicando che le sfere sono sane e vitali.La sfera non dovrebbe crescere eccessivamente, poiché potrebbe diventare scura a causa della morte cellulare nel centro. Sfere di grandi dimensioni potrebbero inoltre aderire al substrato e differenziarsi. Questo è un esempio di neurosfere al primo passaggio derivate da tessuto E14, a cinque giorni dal trapianto.Anche qui, è possibile osservare le microspine alla periferia delle sferette. Abbiamo appena mostrato come coltivare neurosfere a partire dagli eminenze gangliari di topo al giorno E14, seguendo le stesse procedure descritte in questo documento. È inoltre possibile coltivare neurosfere da altre regioni del cervello, come la corteccia e il mesencefalo.Grazie per aver guardato e buona fortuna con le vostre colture di neurosfere.

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