Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere
11 gennaio 2011
Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.
Lo scopo di questo protocollo video è isolare ed espandere cellule staminali neurali dal cervello di topo embrionale utilizzando il saggio delle neurosfere. La procedura comprende il reperimento di embrioni di topo E14, seguito dalla microdissezione cerebrale per isolare le eminenze gangliari, la dissociazione del tessuto isolato per ottenere una sospensione monocellulare e, infine, la semina delle cellule in coltura di neurosfere. Salve, sono Hassan Ali del laboratorio del Dr. Brent Frenzel presso il Mite Brain Institute dell'Università della Florida.
Oggi vi mostrerò come stabilire una coltura di neurosfere a partire dal cervello di topo embrionale, utilizzando il saggio delle neurosfere. Utilizziamo regolarmente questo saggio nel nostro laboratorio per isolare ed espandere cellule staminali neurali. Ok, cominciamo.
Anestetizzare un topo gravido accoppiato in un determinato momento. Al giorno 14 di gestazione, eseguire una lussazione cervicale e sciacquare l'addome con etanolo al 70%. Afferrare la pelle dell'addome utilizzando pinze grandi e quindi tagliare la pelle e la fascia sottostante con forbici grandi.
Per esporre la cavità addominale e i corni uterini, rimuovere i corni uterini contenenti gli embrioni e trasferirli in un tubo conico da 50 ml contenente him freddo. Dopo aver trasferito i tessuti uterini nella cappa a flusso laminare di classe II, rimuovere l'him dal tubo da 50 ml e risciacquare i tessuti con un volume sufficiente di him fresco e freddo per eliminare contaminanti come sangue e peli; eseguire due o tre lavaggi in questo modo. Trasferire i tessuti uterini in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente him freddo.
Aprire le corna uterine utilizzando pinzette curve piccole e forbici, quindi trasferire gli embrioni in una nuova piastra contenente em freddo. Ripetere questa procedura fino a quando tutti gli embrioni non sono stati raccolti. Successivamente, posizionare gli embrioni sotto il microscopio stereoscopico.
Separare le teste degli embrioni a livello del midollo spinale cervicale e trasferirle in un'altra capsula di Petri contenente em freddo. Tenere la testa con pinzette curve fini utilizzando forbici microchirurgiche. Prima, effettuare un taglio orizzontale al di sopra del naso e poi continuare a tagliare lungo la linea mediana dalla fronte verso la parte posteriore della testa.
Assicurarsi di tagliare attraverso la pelle e il cranio senza danneggiare il cervello sottostante. Rimuovere il cervello dal cranio spingendo all'indietro i margini della sezione tagliata con la pinza curva. Proseguire questa procedura fino a quando tutti i cervelli sono stati rimossi dai crani.
Tenere fermo il cervello utilizzando la pinzetta curva in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto, quindi utilizzare le forbici microchirurgiche per tagliare la corteccia di ciascun emisfero dalle bulbi olfattivi fino alla parte posteriore dell'emisfero. Per esporre le eminenze gangliari, tenendo fermo il cervello, dissezionare l'intera eminenza gangliare con una pinzetta angolata a 45 gradi e trasferirla in un'altra capsula di Petri. L'eminenza gangliare è chiaramente visibile qui, con le sue parti mediale e laterale.
In alternativa, è possibile dissezionare le eminenze gangliari rimuovendo i tessuti circostanti utilizzando pinzette fini. È anche possibile tagliare l'intera eminenza in una metà mediale e una laterale, se si desidera coltivare cellule da una di queste regioni.
Ripetere questa procedura fino a quando tutti i cervelli sono stati microdissecati. Utilizzare un millilitro di mezzo per cellule staminali neurali per raccogliere i frammenti di tessuto e trasferirli in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Lasciare depositare gli aggregati di tessuto nel tubo da 15 millilitri per evitare di lasciare del tessuto residuo.
Rimuovere parte del mezzo sovrannatante e lavare la base della piastra di Petri per trasferire qualsiasi tessuto aggiuntivo nel tubo da 15 ml. Appoggiare la punta della pipetta sul fondo del tubo. Pipettare la sospensione su e giù da tre a quattro volte per frammentare il tessuto, ottenendo una sospensione di cellule singole.
Quindi lasciare decantare la sospensione per un minuto in modo che gli aggregati non associati precipitino; trasferire quasi l'intera sospensione cellulare in un altro tubo da 15 ml. Aggiungere quindi un millilitro di mezzo per cellule staminali neurali agli aggregati rimanenti e dissociarli in singole cellule. Aspirare il contenuto dei tubi.
Quindi centrifugare la sospensione a 700 giri/min o a 110 ×g per cinque minuti. Rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo per cellule staminali neurali. Prelevare 10 microlitri della sospensione cellulare e mescolare accuratamente con 90 microlitri di trian blu.
Quindi prelevare 10 microlitri di questa sospensione e trasferirli in un emocitometro. Eseguire un conteggio cellulare. Trasferire un totale di 20 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo conico da 50 ml per seminare una fiasca T80.
Quindi mescolare la sospensione cellulare e aggiungere una quantità adeguata di cellule per ottenere una densità totale di 200.000 cellule per millilitro o 4 milioni di cellule per fiasca T80. Aggiungere EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Mescolare le cellule presenti nel mezzo completo per cellule staminali neurali con il fattore di crescita e trasferire la sospensione cellulare in fiasche T80.
Etichettare il matraccio e osservare le cellule al microscopio per verificare la presenza di una sospensione monocellulare priva di aggregati di tessuto. Trasferire il matraccio in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per cinque a sette giorni. Dopo cinque a sette giorni, valutare il matraccio al microscopio.
A questo punto, si sono formati gli neurosfere e dovrebbero avere un diametro compreso tra 150 e 200 micron ed essere pronti per il subcultivo. Raccogliere il contenuto della fiasca in un tubo sterile per colture cellulari di dimensioni adeguate, centrifugare il tubo e scartare il soprannatante. Risospendere le sfere in un millilitro centrale di tripsina preriscaldata e collocare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi per due minuti.
Quindi aggiungere un volume equivalente di inibitore della tripsina e mescolare bene ma delicatamente per arrestare l'attività della tripsina. Centrifugare nuovamente e rimuovere il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo per cellule staminali neurali ed eseguire un conteggio cellulare come indicato in precedenza. Per seminare una fiasca T175, trasferire un totale di 40 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo conico da 50 ml.
Quindi mescolare le cellule e aggiungere una quantità appropriata di cellule per ottenere una densità totale di 50.000 cellule per M o 2 milioni di cellule per fiala T175. Successivamente, aggiungere EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro. Mescolare le cellule presenti nel mezzo completo per cellule staminali neurali con il fattore di crescita e trasferire la sospensione cellulare in una fiala T175.
Etichettare il pallone e trasferirlo in un incubatore per cinque a sette giorni. Questo è un esempio di coltura primaria di cellule staminali neurali E 14. Tre giorni dopo la semina, le frecce indicano aggregati di cellule staminali neurali in proliferazione.
È inoltre possibile osservare cellule attaccate al substrato e differenziate. Questo è un esempio di coltura primaria di cellule staminali neurali E14 a sette giorni dal seeding. Come si può notare, sono presenti sfere di diverse dimensioni.
Esistono anche cellule che sono differenziate. La quantità di detriti è molto inferiore rispetto alle colture di neurosfere primarie da adulto. Inoltre, le sfere non sono compatte e presentano microsporgenze lungo la periferia, indicando che le sfere sono sane e vitali.
La sfera non dovrebbe crescere troppo, poiché potrebbe diventare scura a causa della morte cellulare nel centro. Le sferoidi di grandi dimensioni potrebbero inoltre attaccarsi al substrato e differenziarsi. Questo è un esempio di neurosfere al primo passaggio derivate da embrione di 14 giorni, a cinque giorni dalla semina.
Anche qui, è possibile osservare le microspine alla periferia delle sferule. Abbiamo appena mostrato come coltivare neurosfere a partire dagli eminenze gangliari di topo al giorno E14, seguendo le stesse procedure descritte in questo documento. È inoltre possibile coltivare neurosfere da altre regioni del cervello, come la corteccia e il mesencefalo.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con le vostre colture di neurosfere.
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Panoramica
Questo protocollo video illustra l'applicazione del saggio delle neurosfere per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali neurali dalle eminenze gangliari del cervello di topo al giorno embrionale 14. La procedura comprende il prelievo di embrioni di topo E14, la microdissezione del cervello e la semina delle cellule in coltura di neurosfere.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia delle cellule staminali
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Le cellule staminali neurali sono fondamentali per lo sviluppo e il riparo del cervello.
- L'eminenza gangliare rappresenta una fonte importante di queste cellule durante lo sviluppo embrionale.
- Il saggio della neurosfera consente l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali in vitro.
- Questa tecnica è ampiamente utilizzata nella ricerca per studiare le proprietà delle cellule staminali neurali.
Scopo dello studio
- Isolare cellule staminali neurali dal cervello di topo embrionale.
- Amplificare queste cellule per ulteriori ricerche e applicazioni.
- Dimostrare il saggio della neurosfera come metodo affidabile per la coltura di cellule staminali.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di embrioni di topo E14.
- Microdissezione del cervello per ottenere le eminenze gangliari.
- Dissociazione del tessuto per creare una sospensione di cellule singole.
- Piastratura delle cellule in condizioni di coltura per corpi neurosferici.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule staminali neurali dalle eminenze gangliari.
- Stabilimento di colture di neurosfere espandibili.
- Dimostrazione della vitalità e della proliferazione delle cellule isolate.
- Potenziale per ulteriori applicazioni nella ricerca neuroscientifica.
Conclusioni
- L'assay della neurosfera è un metodo efficace per isolare ed espandere le cellule staminali neurali.
- Questo protocollo può essere utilizzato in diversi contesti di ricerca.
- Ulteriori studi possono esplorare il potenziale differenziativo di queste cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'assay della neurosfera consente l'isolamento e l'espansione di cellule staminali neurali di topo embrionali, fornendo una fonte rinnovabile di cellule multipotenti per la validazione di target del sistema nervoso centrale nelle fasi iniziali e per studi meccanicistici. Una coltura affidabile di neurosfere sostiene la fiducia predittiva nei modelli neurali rilevanti per le malattie, facilitando decisioni basate sulla valutazione del rischio nei percorsi scoperta focalizzati sulla neurobiologia. Questa capacità costituisce la base per la continuità traslazionale dalla scoperta alla ricerca preclinica nei settori della neurodegenerazione e della medicina rigenerativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi della biologia delle cellule staminali neurali e dei meccanismi delle vie di segnalazione in un sistema in vitro controllato.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi fornendo progenitori neurali multipotenti per saggi successivi.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico degli obiettivi del sistema nervoso centrale mediante studi di espansione e differenziazione riproducibili.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce colture standardizzate di cellule staminali neurali per screening quantitativi di composti e saggi fenotipici.
- Garantisce riproducibilità e scalabilità dei saggi basati su cellule neurali per flussi di lavoro ad alta produttività.
- Consente la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione affidabile di composti neuroattivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli neurali pertinenti per la scoperta e la validazione di biomarcatori traslazionali.
- Permette una continuità dalla fase iniziale di scoperta alla validazione preclinica nei programmi incentrati sul sistema nervoso centrale.
- Riduce il rischio biologico consentendo una valutazione predittiva della differenziazione neurale e della vitalità cellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio della neurosfera colloca la coltura delle cellule staminali neurali all'interfaccia tra scoperta precoce e ricerca preclinica, sostenendo i flussi di lavoro dal test delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Fornisce una piattaforma per la verifica basata su ipotesi dei percorsi di sviluppo e differenziazione neuronale.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per la valutazione di composti in contesti neurali.
- Analisi: Consente la misurazione della formazione, dimensione e vitalità dei neurosfere come letture quantitative.
- Ricerca traslazionale: Collega gli studi in vitro sulle cellule staminali neurali con modelli preclinici in vivo per l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una risorsa riutilizzabile di cellule staminali neurali per molteplici progetti di scoperta e validazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro delle cellule staminali neurali per garantire riproducibilità e scalabilità tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di neurobiologia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta nel sistema nervoso centrale con un'adeguata gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del cervello embrionale e nelle tecniche di coltura delle cellule staminali neurali.
- Richiede l'accesso a strutture sterili per la coltura dei tessuti e a strumentazione per il conteggio cellulare quantitativo.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi sperimentali per quanto riguarda la densità cellulare, la supplementazione con fattori di crescita e le condizioni di coltura.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse regioni cerebrali o stadi di sviluppo, come indicato dal protocollo.
- È essenziale un attento monitoraggio delle dimensioni e della vitalità delle neurosfere per prevenire la differenziazione o la morte cellulare.
