Organotipica Culture Slice ippocampale

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare fette organotipiche dell'ippocampo. Questo viene raggiunto innanzitutto dissezionando l'ippocampo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel tagliare l'ippocampo in fette.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel separare e ordinare le fette ippocampali. L'ultimo passaggio della procedura è coltivare le fette ippocampali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano fette ippocampali organiche sane mediante visualizzazione al microscopio stereoscopico o al microscopio ottico.

Ciao, mi chiamo Jimena Opitz e sono una ricercatrice nel laboratorio del dottor Andres bar presso l'Università di Washington a Seattle. Illustrerò il procedimento per la coltura di organotipi di ippocampo, LICs. In genere, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà a causa della necessità di dissezionare e tagliare rapidamente gli ippocampi e di prevenire contaminazioni, soluzione di dissezione sterile e coltura di tessuti.

Il mezzo può essere preparato fino a tre settimane in anticipo e conservato a quattro gradi Celsius come descritto nel protocollo scritto. Prima della preparazione di fette di ippocampo, è possibile preparare le colture. È necessario sterilizzare correttamente sia l'incubatore a flusso laminare sia l'equipaggiamento che verrà utilizzato per la dissezione.

Per prima cosa, pulire la superficie interna della cappa a flusso laminare con etanolo al 70%. Quindi posizionare il microscopio stereoscopico e tutti gli strumenti di dissezione all'interno della cappa. Preparare il taglia tessuti posizionando un pezzo pulito di foglio in teflon sulla piattaforma e montando una lama nuova.

Posizionare il taglia tessuti all'interno della cappa a flusso laminare e sterilizzare tutte le superfici e l'equipaggiamento con luce UV per 15 minuti. Spegnere la luce al termine del processo di sterilizzazione con UV. Lavorare all'interno della cappa a flusso laminare.

Per prima cosa, preparare le piastre per colture cellulari a sei pozzetti da utilizzare per la coltura delle fette di ippocampo. Pipettare 750 microlitri di SEM in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Quindi, utilizzando pinze sterili, posizionare un inserto per coltura cellulare in ciascun pozzetto della piastra per colture tessutali.

Avendo cura di non intrappolare bolle d'aria sotto l'inserzione. È importante che la membrana di ogni inserto per coltura cellulare sia bagnata con il mezzo di coltura per fette. Se la membrana è secca, verificare che non siano presenti bolle d'aria.

Se la membrana si trova al di sopra del menisco del mezzo SCM, è possibile aggiungere ulteriore mezzo al pozzetto. Posizionare le piastre di coltura preparate in un incubatore per colture cellulari, impostato a 35 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica, fino al momento dell'utilizzo.

Infine, riempire un secchiello per ghiaccio con una miscela di ghiaccio e sale e posizionarlo accanto all'area di decapitazione, lavorando all'interno della cappa. Riempire un becher da 100 millilitri con soluzione di dissezione. Immergere il becher nella miscela di ghiaccio e sale ed effettuare la gassatura della soluzione con una miscela al 5% di anidride carbonica e al 95% di ossigeno per 10-20 minuti, fino a quando il colore non passa dal rosa all'arancione.

E la soluzione per dissezione forma una miscela sospesa di soluzione congelata e liquida. Ora l'ambiente per dissezione e le piastre per coltura cellulare sono pronti per la dissezione. Avvolgimento da P tre a P sette.

I cuccioli vengono utilizzati per questa procedura. Le colture a fette possono essere preparate da un massimo di tre cuccioli contemporaneamente. Questa procedura verrà illustrata utilizzando un singolo cucciolo.

Prelevare rapidamente il cervello dal cucciolo decapitato e posizionarlo nel becher da 100 millilitri contenente la soluzione di dissezione Slurry Chill per un minuto. Durante questo periodo, preparare una piastra per dissezione aggiungendo circa 10 millilitri di soluzione di dissezione fredda sul fondo di una piastra per colture cellulari da 60 millimetri. Utilizzando un cucchiaio arrotondato o una spatola microscopica, trasferire il cervello dal becher da 100 millilitri alla piastra da 60 millimetri riempita con il mezzo di dissezione freddo. Assicurarsi che il cervello sia completamente ricoperto dalla soluzione di dissezione.

Posizionare la piastra contenente il cervello sotto il microscopio stereoscopico. Osservare attraverso il microscopio stereoscopico e individuare il cervello. Utilizzare pinzette da dissezione sterili per spostare il cervello al centro del campo visivo.

Tenere il cervello lungo la linea mediana con la pinzetta da dissezione premuta sul fondo della piastra. Utilizzando lo strumento da dissezione per l'ippocampo, staccare delicatamente gli emisferi corticali dal mesencefalo lasciando quest'ultimo al suo posto e, idealmente, senza staccare gli emisferi corticali dal resto del cervello; a questo punto l'ippocampo risulta esposto. Prendere lo strumento da dissezione per l'ippocampo ed estrarre l'ippocampo da un emisfero.

Quindi utilizzare l'ago da dissezione per rimuovere la maggior quantità possibile di tessuto non ippocampale. Una volta isolato e pulito il primo ippocampo, ripetere questo procedimento per il secondo ippocampo proveniente dall'emisfero opposto. Successivamente, utilizzare forbici sterili per tagliare la punta di una pipetta filtrante P 1000.

Posizionare la punta della pipetta su una pipetta sterile P 1000. Aspirare delicatamente un ippocampo e trasferirlo sul foglio di teflon nel taglia tessuti. Successivamente, posizionare in modo analogo il secondo ippocampo sul taglia tessuti.

Posizionare le metà dell'ippocampo sui loro lati concavi e allinearle perpendicolarmente alla lama; aspirare il liquido in eccesso dal foglio in teflon. Impostare il micrometro sulla posizione zero. Tagliare gli ippocampi in sezioni di 400 micrometri.

Preparare un altro puntale filtro P 1000 tagliato e montarlo su una pipetta sterile P 1000. Versare circa 10 millilitri di SCM freddo in una piastra sterile per colture cellulari da 60 millimetri. Utilizzando la pipetta, aggiungere del mezzo e trasferire le fette di ippocampo dal taglia al piatto.

Evitare la formazione di bolle; dopo aver ripetuto il processo di trasferimento per tutte le fette, posizionare la piastra sotto il microscopio stereoscopico. Infine, utilizzando una spatola a iride e una spatola dritta, separare delicatamente le fette l'una dall'altra.

Separare le fette ben definite e integre da quelle danneggiate. Le fette ippocampali ben definite sono ora pronte per essere coltivate. Rimuovere dal incubatore le piastre per colture cellulari a sei pozzetti precedentemente preparate, contenenti SCM e inserti per colture cellulari, utilizzando una pipetta P1000 con una punta larga tagliata e trasferire quattro o cinque fette individuali per membrana.

Se necessario, utilizzare la spatola ad iris per separare le fette. Fare attenzione a non posizionare le fette troppo vicino alla parete dell'inserto o troppo vicine tra loro. Senza toccare le fette, aspirare con cura il mezzo in eccesso dalla superficie superiore della coltura cellulare.

Inserire la membrana. Infine, riposizionare la piastra, che ora contiene le colture di tessuto ippocampale, nell'incubatore per colture cellulari. Impostare a 35 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo 48 ore, rimuovere la piastra dall'incubatore operando all'interno della cappa a flusso laminare. Aspirare il mezzo con una pipetta posteriore. Aggiungere 750 microlitri di SCM fresco preriscaldato per ogni piastra.

Anche in questo caso, assicurarsi che non si formino bolle sotto la membrana dell'inserto per coltura cellulare. Questo è un esempio di una fetta di ippocampo sana, pronta per essere coltivata. Le regioni dell'ippocampo, ovvero il CA1, il CA3 e il giro dentato, sono chiaramente visibili e integre.

Qui è mostrata una sezione ippocampale danneggiata, non utilizzata per la coltura. Infine, questo è un esempio di una sezione ippocampale sana dopo quattro giorni di coltura. Si noti che la sezione appare bianca al microscopio stereoscopico e che la superficie della sezione è pulita.

Le regioni dell'ippocampo, CA1, CA3 e giro dentato, sono chiaramente visibili e integre. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è molto importante ricordare di utilizzare tecniche adeguate per i corticosteroidi e di trattare con delicatezza il tessuto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare organotipicamente. Lisato ippocampale.

Grazie e buona fortuna con i vostri esperimenti.