Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye
5 novembre 2010
Dimostrazione di quantificazione del dsDNA utilizzando sonde molecolari PicoGreen colorante e Hitachi F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di un accessorio lettore di micropiastre.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la capacità dello spettrofotometro fluorescente F 7.000 con lettore di micropiastre di eseguire la quantificazione del DNA a doppio filamento utilizzando il colorante verde Pico. Ciò si ottiene preparando prima i campioni e i reagenti. Il secondo passo della procedura consiste nell'impostare lo strumento.
La terza fase della procedura consiste nel caricare i campioni nel lettore di micropiastre. La fase finale della procedura consiste nell'eseguire la misurazione di standard e campioni. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una curva di calibrazione lineare, che potrebbe essere utilizzata per la quantificazione del DNA a doppio filamento di campioni sconosciuti.
Accendi il fluorimetro Hitachi F 7, 000 Spectra per consentire alla lampada allo xeno di riscaldarsi per un'ora in Excel. Crea un file con gli standard e i dati di esempio e salvalo in formato CSV o separati da virgole. Per configurare prima il fluorimetro, fare clic sul pulsante del metodo che apre la finestra del metodo di analisi.
Nel campo di misurazione, selezionare fotometria dal menu a discesa. Ora fai clic sulla scheda di quantificazione. Nel campo del tipo di quantificazione, selezionare la lunghezza d'onda per indicare che la lettura della fluorescenza verrà effettuata utilizzando una lunghezza d'onda specificata.
Per il tipo di calibrazione, selezionare il primo ordine e per il numero di lunghezze d'onda, selezionarne uno. Inserisci i nanogrammi per millilitro per l'unità di concentrazione. Assicurarsi che la calibrazione manuale e le caselle della curva di forza attraverso lo zero non siano selezionate per le cifre Dopo la virgola, selezionare due, inserire zero per il limite di concentrazione inferiore e 10.000 per il campo del limite di concentrazione superiore.
Quindi, fare clic sulla scheda dello strumento e nel campo della modalità dati selezionare la fluorescenza. Verificare che il campo della velocità di taglio sia inattivo in quanto viene utilizzato solo per le misurazioni della fosforescenza. Nel campo della modalità lunghezza d'onda, selezionare entrambi i WL fissi nel campo ex WL uno, inserire 480 nanometri nel campo EM WL uno.
Entra in 520 nanometri. Lasciare inattivi tutti gli altri campi in EX ed EM. Impostare sia la fenditura EX che la fenditura EM a 5,0 nanometri.
Utilizzando i menu a discesa, lasciare la casella davanti al campo PMT voltage one to 1000 volts non selezionato. Per la tensione PMT, selezionare 700 volt dal menu a discesa. Inoltre, selezionare due per il calcolo statistico automatico numero uno per le repliche 0,1 secondi per il tempo di integrazione e zero per il ritardo.
Ora apri la scheda del monitor e imposta il campo massimo dell'asse del motivo su 10.000 e il campo minimo dell'asse del motivo su zero. Quindi selezionare la casella a sinistra dell'elaborazione dati aperta dopo l'acquisizione dei dati e, se necessario, la casella a sinistra del rapporto di stampa dopo l'acquisizione dei dati per un rapporto che deve essere stampato automaticamente al termine delle letture. Infine, per salvare tutti i parametri selezionati nelle diverse schede della finestra del metodo di analisi, fare clic sulla scheda generale e salvare con un nuovo nome di file in una posizione specificata.
Fare clic sul pulsante OK per chiudere questa finestra. Questa operazione completa l'impostazione dei parametri di test dello strumento. Per configurare il lettore di micropiastre, fare clic sul pulsante MPR per portare in primo piano la finestra di configurazione MPR.
Per prima cosa selezionare i pozzetti per gli standard. Ad esempio, fai clic sulla posizione A uno e trascina il mouse su E uno. Quindi fare clic sul pulsante di impostazione standard.
In questo modo verranno selezionate le posizioni da utilizzare per gli standard, come evidenziato in verde. Quindi selezionare le posizioni per i campioni. Allo stesso modo, fare clic e trascinare il mouse sulle posizioni corrispondenti sulla piastra, quindi fare clic sul pulsante del set di campioni, che evidenzierà automaticamente le posizioni selezionate in giallo.
Continuare a ripetere la stessa operazione per le posizioni delle misurazioni del campione desiderate. Per caricare gli standard e le informazioni di esempio sul file di variabili separate da virgole preparato in precedenza. Fare clic sulla scheda delle informazioni sul pozzo della finestra di configurazione MPR.
Seleziona il pulsante di caricamento delle informazioni sul pozzo e si aprirà una finestra di Esplora risorse per identificare il file csv dot delle informazioni sul pozzo. Dopo aver caricato le informazioni, la finestra dovrebbe essere visualizzata come tabella. Per preparare una soluzione di lavoro del reagente verde Pico, aggiungere 50 microlitri di reagente verde pico 200 X a 9,95 millilitri di tampone TE.
Per la curva standard, preparare diluizioni seriali di DNA a doppio filamento Lambda in tampone TE per concentrazioni finali, che vanno da uno a 100 nanogrammi per millilitro pipetta 150 microlitri di ciascuno standard in pozzetti designati di una piastra a 96 pozzetti. Quindi pipettare 150 microlitri di ciascun campione di prova nei corrispondenti pozzetti designati della piastra. Ora, utilizzando una pipetta multipla, aggiungere 150 microlitri di soluzione verde Pico a ciascun pozzetto e mescolare la soluzione e i campioni di DNA.
Incubare delicatamente la piastra in un'area buia per due-cinque minuti affinché si sviluppi la reazione. Fare clic sul pulsante della schermata di visualizzazione MPR per visualizzare la finestra di configurazione MPR nella parte superiore del display e fare clic sul pulsante di scambio della posizione. La piattaforma di supporto per micropiastre si sposterà verso la parte anteriore dello strumento, aprirà lo sportello del lettore di micropiastre e posizionerà la piastra a 96 pozzetti sulla piattaforma di supporto con il pozzetto A verso la parte anteriore e chiuderà lo sportello del lettore di micropiastre.
Fare clic sul pulsante della posizione iniziale per posizionare la posizione A una delle micropiastre nella posizione di misurazione. Fare clic sul pulsante del display del monitor per portare la finestra di misurazione sopra il display. Fare clic sul pulsante di misurazione per iniziare a misurare gli standard e i campioni sconosciuti.
Una buona curva di calibrazione viene valutata utilizzando i diversi parametri forniti dal software F 7, 000. Ad esempio, questa curva di calibrazione ideale ottenuta per la quantificazione del DNA a doppio filamento utilizzando il colorante verde Pico ha calcolato un coefficiente di determinazione di 0,99993. Il sistema ad alta produttività descritto è un assemblaggio in serie di tecnologie tra cui Pico Green Dye, uno spettrofotometro fluorescente Hitachi F 7.000, dotato di lettore di micropiastre e di un programma software per automatizzare la raccolta, l'archiviazione, l'analisi e la presentazione dei dati.
La combinazione di potenti tecnologie può soddisfare la crescente necessità di analizzare con precisione piccole quantità di doppio filamento. DNA.
Panoramica
Questo articolo dimostra la quantificazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) utilizzando il colorante PicoGreen e lo spettrofotometro a fluorescenza Hitachi F-7000 con un lettore di micropiastre. La procedura delinea la preparazione dei campioni, la configurazione dello strumento e i processi di misurazione per ottenere una curva di calibrazione lineare per la quantificazione del dsDNA.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Spettroscopia di fluorescenza
- Quantificazione del DNA
- Tecnologia del lettore di micropiastre
Sfondo
- Il colorante PicoGreen è un colorante fluorescente sensibile utilizzato per la quantificazione del dsDNA.
- L'Hitachi F-7000 è uno spettrofotometro a fluorescenza versatile.
- La quantificazione accurata del DNA è essenziale per vari esperimenti biologici.
- I sistemi ad alto rendimento facilitano l'analisi di più campioni contemporaneamente.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare la capacità dello spettrofotometro F-7000 per la quantificazione del dsDNA.
- Stabilire un metodo affidabile per misurare campioni di DNA sconosciuti.
- Creare una curva di calibrazione lineare per una quantificazione accurata.
Metodi utilizzati
- Preparazione del reagente PicoGreen e degli standard di DNA.
- Configurazione dei parametri dello spettrofotometro Hitachi F-7000.
- Caricamento dei campioni nel lettore di micropiastre.
- Misurazione della fluorescenza per generare una curva di calibrazione.
Risultati principali
- È stata stabilita una curva di calibrazione lineare per la quantificazione del dsDNA.
- Il metodo ha dimostrato un'elevata sensibilità e accuratezza.
- I risultati hanno mostrato un coefficiente di determinazione di 0,99993.
- Il sistema ha efficacemente analizzato piccole quantità di dsDNA.
Conclusioni
- La combinazione del colorante PicoGreen e dello spettrofotometro F-7000 fornisce un metodo robusto per la quantificazione del DNA.
- Questo approccio ad alto rendimento soddisfa le esigenze di un'analisi accurata nella ricerca biologica.
- Il metodo può essere applicato a vari studi che richiedono misurazioni precise del DNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
