Name: Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara a quantificare il dsDNA con il colorante PicoGreen e lo spettrofotometro Hitachi F-7000. Questo metodo ad alta sensibilità genera una curva di calibrazione lineare per misurare campioni di DNA sconosciuti con precisione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Strumento Setup <ol><li> Accendere il spettrofluorimetro e lasciare scaldare per 1 ora. </li><li> Utilizzo di Excel crea un file con gli standard ed i dati del campione, come mostrato nella Figura 1 e salvarlo in valori separati da virgola formato "csv". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Standard e campioni di dati. </li><li> Istituito fluorimetro come segue: <ol><li> Clicca sul <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Icona 1"> pulsante, si aprirà la finestra metodo di analisi, mostrata in Fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Metodo di analisi finestra, nella scheda Generale. Effettuare le seguenti selezioni: <ul><li> Nel campo "Misura", selezionare Fotometria dal menu a discesa. </li><li> Nel campo "Operatore", inserire il nome dell'operatore appropriato. </li><li> Non è necessario inserire le informazioni nel campo "strumento". Questo viene selezionato automaticamente dal software. </li><li> Il campo "Sampling" non è attivo quando si utilizza il lettore per micropiastre. </li><li> Inserire eventuali commenti che è possibile includere nel rapporto nel campo "Commenti". </li><li> Nel campo "accessori", inserire le informazioni relative agli accessori utilizzati per questo test. </li><li> Nota i pulsanti sul lato destro della finestra. </li><li> Il pulsante "Carica" ​​permette di caricare Metodi di analisi precedentemente salvato. </li><li> Il pulsante "Salva" consente di aggiornare una serie di parametri di prova o di metodo di analisi precedentemente salvato e caricato, utilizzando lo stesso nome. </li><li> "Salva con nome" pulsante permette di salvare una nuova serie di parametri di prova o di metodo di analisi sotto il nome desiderato. </li></ul> Ora cliccate sulla scheda "quantificazione", vedi figura 3 e effettuare le seguenti selezioni. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Metodo di analisi finestra, scheda quantificazione. <ul><li> Nel "tipo di quantificazione", selezionare lunghezza d'onda. Questo indica che la lettura della fluorescenza sarà effettuata utilizzando la lunghezza d'onda selezionata. </li><li> Nel "tipo di calibrazione" di campo, selezionare 1 ° ordine. </li><li> Nel campo "Numero di lunghezze d'onda", selezionare 1. </li><li> Nella "unità di concentrazione", immettere ng / ml. </li><li> Lasciare le caselle non selezionate per "Calibrazione manuale" e "curva di Forza per lo zero". </li><li> Nella "Digit dopo punto decimale", selezionare 2. </li><li> Nel "basso limite di concentrazione", immettere 0. </li><li> Nel "campo superiore limite di concentrazione, immettere 10000. </li></ul> Ora cliccate sulla scheda "Strumenti" e effettuare le seguenti selezioni. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Metodo di analisi finestra, nella scheda strumento <ul><li> Nella modalità "Dati:", selezionare fluorescenza. </li><li> La "velocità Tagliere" campo non è attivo in questo momento, viene utilizzato solo per le misure fosforescenza. </li><li> Nella modalità "Wavelength", selezionare Entrambi fisso WL. </li><li> Nel campo "EX / WL1" entrare 480nm. </li><li> Nella "EM / WL1" inserire 520nm. </li><li> Tutti gli altri campi sotto EX e EM non sono attive in questo momento. </li><li> Nella "EX fessura" campo 5.0nm selezionare dal menu a discesa. </li><li> Nella "EM fessura" campo 5.0nm selezionare dal menu a discesa. </li><li> Lasciate selezionata la casella di fronte al "Tensione PMT 1-1000V campo". </li><li> Nella "PMT tensione", selezionare 700V dal menu a discesa. </li><li> Nella "calc Auto statistica. Numero" campo selezionare 2. </li><li> Nel campo "Replica", selezionare 1. </li><li> Nel "tempo di integrazione" campo selezionare 0.1s. &lt;/ Li&gt; </li><li> Nel campo "Ritardo" immettere o selezionare 0. </li></ul> Fare clic sulla scheda "Monitor". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Figura 5"> Figura 5. Metodo di analisi finestra, scheda Monitor. <ul><li> Nella "asse Y", "Max:", selezionare 10000 </li><li> Nella "asse Y", "Min:", selezionare 0. </li><li> Selezionare la casella a sinistra del "Aprire il trattamento dei dati dopo l'acquisizione dei dati". </li><li> Lasciate selezionata la casella a sinistra del "rapporto di stampa dopo l'acquisizione dei dati", a meno che non si desidera un rapporto da stampare automaticamente dopo le letture sono state completate. </li></ul> Fare clic sulla scheda "Report", vedi Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Figura 6"> Figura 6. Metodo di analisi finestra, scheda Report. <ul><li> Nel campo "Uscita", selezionare Stampa rapporto dal menu a discesa. Si può anche selezionare "Utilizza Microsoft Excel" se si desidera che i dati esportati in Excel, o "Stampa Foglio Usa Generator" se si utilizza il componente aggiuntivo opzionale Generator programma rapporto che permetterà generare report personalizzati fatto. </li><li> Selezionare le caselle per gli elementi che si desidera includere nel rapporto. </li><li> Per salvare tutti i parametri selezionati nelle diverse schede del "metodo di analisi" finestra, clicca di nuovo sulla scheda "Generale" e salvare con un nome di file e in una posizione in cui si riusciva a trovarli per un uso futuro, e fare clic sul " OK "per chiudere questa finestra. </li><li> Questo completa l'impostazione dei parametri dello strumento di prova. </li><li> Ora ci sarà istituito il lettore per micropiastre. </li><li> Clicca sul <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Icon 2"> pulsante, che porterà la finestra Setup MPR in cima. </li></ul> Seleziona pozzi per la standard e dei campioni nel Setup MPR Finestra / Plate scheda, come mostrato nella Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Figura 7"> Figura 7. MPR finestra di installazione, scheda Plate. <ul><li> Clicca sulla posizione A1 e trascinare il mouse per E1, quindi fare clic sul <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Icona 3"> pulsante. In questo modo selezionare le posizioni da utilizzare per gli standard. Quelle posizioni verranno evidenziati in colore verde. </li><li> Ora abbiamo bisogno di selezionare F1 posizioni H3 per i campioni. Fare clic e trascinare il mouse a partire F1 posizione, alla posizione H3 e quindi fare clic sul <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Icona 4"> pulsante, questo metterà in evidenza le posizioni di colore giallo. </li><li> Quindi ripetere la stessa operazione per le posizioni A2 a E3, per selezionare quelle posizioni per le misure del campione. </li><li> Ora, caricare il file di Comma Separated variabile (csv) preparati in anticipo, le prescrizioni e le informazioni del campione. </li></ul> Clicca sul "Bene informazioni" scheda della "Finestra Setup MPR", come mostrato nella Figura 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Figura 8"> Figura 8. MPR finestra di installazione, scheda Informazioni Bene. <ul><li> Quindi fare clic sul <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Icona 5"> pulsante. Una finestra di Windows Explorer che si aprirà come mostrato nella Figura 9, che permette la localizzazione del "Bene information.csv" file e il caricamento. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Figura 9"> Figura 9. Caricamento ben campione. Dopo aver caricato il "Bene informazione" del file, le "informazioni Well" sarà come mostrato nella Figura 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Figura 10"> Figura 10. Loaded informazioni ben campione. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. PicoGreen saggio Preparazione del campione <ol><li> Preparare 1X tampone TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) con l'aggiunta di 1 mL di 20 X TE Buffera 19 ml di dI H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione reagente PicoGreen aggiungendo 50 microlitri 200 X reagente PicoGreen a 9,95 ml di buffer di 1 X TE. </li><li> Preparare gli standard (Lambda dsDNA) facendo diluizioni seriali di magazzino dsDNA (100 mg / mL). In primo luogo preparare una soluzione di 50 mg / mL dsDNA aggiungendo 25 l di magazzino dsDNA (100 mg / ml) e 25 microlitri 1 x tampone TE. Preparare quindi le soluzioni standard con l'aggiunta di volumi indicati di dsDNA e buffer come elencati nella tabella seguente: <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrazione di dsDNA </td><td> Volume di dsDNA </td><td> Volume di tampone </td></tr><tr><td> 1 mg / mL </td><td> 20 l di 50 mg / mL dsDNA </td><td> 980 microlitri 1 X TE Buffer </td></tr><tr><td> 0,1 mg / ml </td><td> 100 l di 1 mg / mL dsDNA </td><td> 900 microlitri 1 X TE Buffer </td></tr><tr><td> 0,01 mg / ml </td><td> 100 l di 0,1 mcg / mL dsDNA </td><td> 900 microlitri 1 X TE Buffer </td></tr><tr><td> 0,001 mg / ml </td><td> 100 l di 0,01 mg / mL dsDNA </td><td> 900 microlitri 1 X TE Buffer </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Misura degli standard e fluorescenza del campione <ol><li> Pipettare 150 ml di ogni standard nei pozzetti A1-E1 di una piastra 96 ​​pozzetti, per Figura 7, e secondo la seguente tabella: <table border="1"><tbody><tr><td> Bene </td><td> Standard </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 mg / mL </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 mg / ml </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 mg / ml </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0,001 mg / ml </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE Buffer </td></tr></tbody></table></li><li> Pipettare 150 campioni microlitri sconosciuto in pozzi F1 per H3, mostrato in figura 7 </li><li> Versare la soluzione PicoGreen preparata al punto 1,2 in un trogolo progettato per multicanale uso pipetta. Utilizzare una pipetta multicanale per fornire 150 ul di soluzione PicoGreen ai pozzetti A1-H3. Mix di soluzioni e standard delicatamente con pipetta. </li><li> Piastra in luogo buio e aspettare 2-5 minuti per la reazione di svilupparsi. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Una buona curva di calibrazione viene valutata utilizzando i diversi parametri forniti dal F-7000 del software su misura degli standard e il calcolo della curva di calibrazione dal software. Il coefficiente di determinazione indica la bontà di adattamento degli standard misurata e la curva di calibrazione calcolati. Quanto più questo valore è a "1", migliore è la misura del valore misurato e la curva di calibrazione. Se il valore è ben lungi dall'essere "1", le norme devono essere ri-misurato, preparato ancora una volta, o l'idoneità della curva di calibrazione cambiato. Figura 11 mostra un esempio di una curva di calibrazione con un coefficiente di determinazione calcolato = 0,99993, ottenuto per la quantificazione del DNA a doppia elica con PicoGreen colorante. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Figura 11"> Figura 11. Esempio di curva di calibrazione dsDNA.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno e Kendra L. Cox sono dipendenti di Hitachi High Technologies America, che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.

Pipettaggio attenzione durante la preparazione dei campioni, così come usando uno spettrofotometro stabile e sensibile fluorescenza è essenziale per ottenere buoni risultati e riproducibili. Nel caso dello spettrofotometro a fluorescenza utilizzata per questo test, si consiglia di utilizzare 300 microlitri volume del campione finale nel lettore per micropiastre. Abbassare il volume diminuisce la sensibilità, e un maggiore volume può causare la contaminazione incrociata tra pozzi.

<table><tbody><tr><td>Acqua distillata H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per saggio Quant-iT Picogreen dsDNA di Invitrogen</td><td>Reagente</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Piastre microfluorimetriche Nalge Nunc p/n 237108</td><td>Materiale</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale Eppendorf a 12 canali</td><td>Materiale</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Eppendorf da 1000 &amp;mu;L</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Eppendorf da 200 &amp;mu;L</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta serologica da 10 mL</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta</td><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro fluorimetrico Hitachi F-7000 con software FL Solutions 2.1</td><td>Attrezzatura</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Accessorio lettore di piastre per F-7000</td><td>Attrezzatura</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione di dsdna con il f-7000 hitachi fluorescenza spettrofotometro e picogreen dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantificazione del DNA, specialmente in piccole concentrazioni, è un compito importante, con una vasta gamma di applicazioni biologiche tra cui standard di test di biologia molecolare come la sintesi e la purificazione del DNA, applicazioni diagnostiche come la quantificazione dei prodotti di amplificazione del DNA, e la rilevazione di molecole di DNA in droga preparati. Durante questo video viene mostrata la capacità del spettrofotometro Hitachi F-7000 fluorescenza dotato di un accessorio Micro Reader piastra per eseguire quantificazione dsDNA utilizzando sonde molecolari Quant-it PicoGreen kit di reagenti coloranti. Lo spettrofotometro a fluorescenza F-7000 offre alta sensibilità e le misure ad alta velocità. Si tratta di un sistema altamente flessibile in grado di misurare la fluorescenza, luminescenza e fosforescenza. Modalità di misurazione sono disponibili diversi, tra cui lunghezza d&#39;onda di scansione, scansione del tempo, fotometria e 3-D di misura scansione. Lo spettrofotometro ha una sensibilità nel range di 50 picomoles di fluorescina quando si utilizza un volume di 300 microlitri del campione in micropiastra, ed è in grado di misurare la velocità di scansione di 60.000 nm / minuto. Dispone inoltre di un ampio range dinamico fino a 5 ordini di grandezza, che consente l&#39;utilizzo di curve di calibrazione in un ampio range di concentrazioni. Il sistema ottico utilizza tutte le ottiche riflettenti per la massima energia e sensibilità. La gamma di lunghezze d&#39;onda di serie è da 200 a 750 nm, e può essere estesa a 900 nm quando si usa uno dei fotomoltiplicatori opzionale vicino infrarosso. Il sistema permette il controllo della temperatura opzionale per il lettore di piastre 5-60 gradi Celsius usando un esterno opzionale circolatore controllato la temperatura del liquido. Il lettore di micropiastre consente l&#39;utilizzo di 96 micropiastre bene, e la velocità di misura per 96 pozzetti è meno di 60 secondi quando si utilizza la modalità cinetica. Controlli software per l&#39;F-7000 e micropiastre Reader sono anche molto flessibili. I campioni possono essere impostati sia in formato colonna o riga, e qualsiasi combinazione di pozzi possono essere scelti per la misura del campione. Questo consente un utilizzo ottimale della micropiastra. Inoltre, il software consente l&#39;importazione micro configurazioni di esempio piatto creato in Excel e salvato in valori separati da virgola, o in formato &quot;csv&quot;. Micropiastre configurazioni di misura possono essere salvate e richiamate dal software per comodità e maggiore produttività. Risultati dei dati può essere emesso un rapporto standard, in Excel, o di un programma facoltativo Report Generator.

Dimostrazione di quantificazione del dsDNA utilizzando sonde molecolari PicoGreen colorante e Hitachi F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di un accessorio lettore di micropiastre.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

La quantificazione del DNA, specialmente a basse concentrazioni, è un compito fondamentale con un'ampia gamma di applicazioni biologiche, tra cui la biologia molecolare standard...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la capacità dello spettrofotometro fluorescente F 7,000 con lettore di microplacche di eseguire la quantificazione del DNA a doppio filamento utilizzando il colorante Pico green. Questo viene realizzato preparando innanzitutto i campioni e i reagenti. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'impostare lo strumento.Il terzo passaggio della procedura consiste nel caricare i campioni nel lettore di micropiastre. L'ultimo passaggio della procedura è l'esecuzione della misurazione degli standard e dei campioni. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano una curva di calibrazione lineare, che può essere utilizzata per la quantificazione del DNA a doppio filamento di campioni sconosciuti.Accendere lo spettrofluorimetro Hitachi F 7,000 per permettere alla lampada allo xenon di riscaldarsi per un'ora in Excel. Creare un file contenente i dati dei campioni e degli standard e salvarlo in formato valori separati da virgola o CSV. Per configurare lo spettrofluorimetro, fare prima clic sul pulsante metodo, che apre la finestra del metodo di analisi.Nel campo di misurazione, selezionare la fotometria dal menu a discesa. Fare ora clic sulla scheda di quantificazione. Nel campo del tipo di quantificazione, selezionare lunghezza d'onda per indicare che la lettura della fluorescenza verrà effettuata utilizzando una lunghezza d'onda specificata.Per il tipo di calibrazione, selezionare il primo ordine e per il numero di lunghezze d'onda selezionare uno. Inserire nanogrammi per millilitro come unità di concentrazione. Assicurarsi che le caselle di calibrazione manuale e forzatura della curva attraverso lo zero non siano selezionate. Dopo il punto decimale, selezionare due, inserire zero per il limite inferiore di concentrazione e 10.000 per il campo del limite superiore di concentrazione.Successivamente, fare clic sulla scheda dello strumento e nel campo modalità dati selezionare fluorescenza. Verificare che il campo velocità di modulazione sia inattivo, poiché viene utilizzato esclusivamente per le misurazioni di fosforescenza. Nel campo modalità lunghezza d'onda, selezionare entrambi WL fissato nel campo ex WL uno e inserire 480 nanometri nel campo EM WL uno.Immettere 520 nanometri. Lasciare tutti gli altri campi sotto EX e EM inattivi. Impostare sia la fenditura EX che la fenditura EM a 5,0 nanometri.Utilizzando i menu a discesa, lasciare deselezionata la casella davanti al campo della tensione del PMT da 1 a 1000 volt. Per la tensione del PMT, selezionare 700 volt dal menu a discesa. Inoltre, selezionare due per il numero di calcoli statistici automatici, uno per le repliche, 0,1 secondi per il tempo di integrazione e zero per il ritardo.Ora aprire la scheda monitor e impostare il campo massimo dell'asse y a 10.000 e il minimo dell'asse y a zero. Quindi selezionare la casella a sinistra di "elabora i dati dopo l'acquisizione" e, se necessario, la casella a sinistra di "stampa il rapporto dopo l'acquisizione" per ottenere un rapporto che verrà stampato automaticamente al termine delle letture. Infine, per salvare tutti i parametri selezionati nelle diverse schede della finestra del metodo di analisi, fare clic sulla scheda generale e salvare con un nuovo nome file in una posizione specificata.Fare clic sul pulsante OK per chiudere questa finestra. In questo modo si completa la configurazione dei parametri del test dello strumento. Per configurare il lettore di micropiastre, fare clic sul pulsante MPR per portare in primo piano la finestra di configurazione del MPR.Selezionare innanzitutto le pozzette per gli standard. Ad esempio, fare clic sulla posizione A1 e trascinare il mouse fino alla posizione E1. Quindi fare clic sul pulsante imposta standard.Questo selezionerà le posizioni da utilizzare per gli standard, evidenziate in colore verde. Successivamente, selezionare le posizioni per i campioni. Analogamente, fare clic e trascinare il mouse sulle posizioni corrispondenti della piastra, quindi fare clic sul pulsante del set di campioni, che evidenzierà automaticamente le posizioni selezionate in giallo.Continuare a ripetere la stessa operazione per le posizioni in cui si desidera effettuare le misurazioni del campione. Per caricare le informazioni relative agli standard e ai campioni nel file di variabili separato da virgole preparato in precedenza, fare clic sulla scheda informazioni pozzetti della finestra di configurazione MPR.Selezionare il pulsante per le informazioni sui pozzetti e si aprirà una finestra di Windows Explorer per identificare il file CSV con le informazioni sui pozzetti. Dopo aver caricato le informazioni, la finestra dovrebbe visualizzare una tabella. Per preparare una soluzione lavorativa del reagente Pico green, aggiungere 50 microlitri di reagente Pico green 200 X a 9,95 millilitri di tampone TE.Per la curva standard, preparare delle diluizioni seriali di DNA bicatenario Lambda in tampone TE per ottenere concentrazioni finali comprese tra 1 e 100 nanogrammi per millilitro; pipettare 150 microlitri di ogni standard nelle pozzette designate di una piastra a 96 pozzette. Successivamente, pipettare 150 microlitri di ciascun campione da analizzare nelle corrispondenti pozzette designate della piastra. A questo punto, utilizzando una multicanale, aggiungere 150 microlitri di soluzione Pico green in ogni pozzetta e mescolare la soluzione con i campioni di DNA.Incubare delicatamente la piastra in un'area buia per due-cinque minuti per consentire lo sviluppo della reazione. Fare clic sul pulsante dello schermo del MPR per portare la finestra di configurazione del MPR in primo piano sul display e fare clic sul pulsante di scambio posizione. La piattaforma di supporto per la micropiastra si sposterà verso la parte anteriore dello strumento, aprirà la porta del lettore di micropiastre e posizionerà la piastra a 96 pozzetti sulla piattaforma di supporto con il pozzetto A1 rivolto verso l'anteriore, quindi chiuderà la porta del lettore di micropiastre.Fare clic sul pulsante della posizione iniziale per posizionare il punto A di una delle micropiastre nella posizione di misurazione. Fare clic sul pulsante di visualizzazione del monitor per portare la finestra di misurazione in primo piano sul display. Fare clic sul pulsante di misurazione per iniziare a misurare gli standard e i campioni sconosciuti.Una curva di calibrazione valida viene valutata utilizzando i diversi parametri forniti dal software F 7,000. Ad esempio, questa curva di calibrazione ideale ottenuta per la quantificazione del DNA a doppio filamento mediante il colorante Pico green presenta un coefficiente di determinazione calcolato pari a 0,99993. Il sistema ad alta produttività descritto è un assemblaggio seriale di tecnologie che include il colorante Pico Green, uno spettrofotometro fluorescente Hitachi F 7,000 dotato di lettore per micropiastre e un programma software per automatizzare la raccolta, l'archiviazione, l'analisi e la presentazione dei dati.La combinazione di tecnologie avanzate può soddisfare la crescente necessità di analizzare con precisione piccole quantità di DNA a doppio filamento.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

L'uso di sistemi NanoDrop microvolumi come alternativa pratica ed efficace ai tradizionali metodologia di quantificazione acidi nucleici è descritto attraverso la dimostrazione di due protocolli di acido nucleico quantificazione microvolumi.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.

Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; E l&#39;umano fecale associata HF183 Marker in Waters

Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Questo protocollo delinea la progettazione di sonde di ibridazione split che utilizzano l'aptamero fluorescente DAP-10-42 come reporter di segnale e la loro applicazione per il rilevamento dell'acido nucleico e la differenziazione tra bersagli con sostituzioni a singolo nucleotide.

Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

Questo protocollo fornisce operazioni dettagliate sulla preparazione del campione, raccolta dati e analisi degli spettri di fluorescenza intrinseca del DNA.

Imaging spettroscopico a super-risoluzione delle molecole di DNA utilizzando contrasto intrinseco

Impara a quantificare il dsDNA con il colorante PicoGreen e lo spettrofotometro Hitachi F-7000. Questo metodo ad alta sensibilità genera una curva di calibrazione lineare per misurare campioni di DNA sconosciuti con precisione.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Esplora altri video