Name: Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dellorecchio interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri la consegna mirata di morpholinos nell'otocisti di Danio rerio mediante microiniezione ed elettroporazione. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo dell'orecchio interno isolando gli effetti specifici sul sistema uditivo.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca Sordità al Yc S e la NSF (IOS 0.930.096) alla KDB. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS

1. Fare Elettrodi per elettroporazione <ol><li> Tagliare 75 micron diametro del filo di tungsteno (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) di lunghezza adeguata (circa 3-5 cm) </li><li> Mettere filo di tungsteno attraverso molex cavo connettore (pin ottone stampato) </li><li> Avvolgere i fili di tungsteno e il connettore del cavo molex con guaina termorestringente (SPC Technology, Chicago, IL) e al calore di becco Bunsen o pistola ad aria calda per sigillare il tubo riducendo al filo </li><li> Per affilare la punta del filo di tungsteno, immergere il filo in idrossido di sodio 1,0 N (Conrad et al. 1993) e, usando una graffetta come l'altro elettrodo, elettrolizzare il filo con un Elettroporatore onda quadra. Le condizioni che usiamo sono 5 da 50 Volt impulsi di ciascuna della durata di 100 ms con 50 ms tra gli impulsi. Elettrodi deve essere affilato ad un diametro di 15-20 micron </li><li> Tenere i fili in un vassoio all'interno di scanalature premuto in plastilina prima dell'uso in elettroporazione </li></ol> 2. Configurazione Stazione di elettroporazione <ol><li> Nastro affilato 75μm elettrodi di tungsteno di micromanipolatori (strumenti di precisione World). </li><li> Micromanipolatori posto su entrambi i lati del palco microscopio da dissezione (Leica). </li><li> Collegare gli elettrodi ad un cuy-21 Proteggere Elettroporatore Modifica Onda quadra (Figura 1). </li><li> Accendere il elettroporatore e impostare i parametri per l'elettroporazione, tra tensione, durata dell'impulso e il numero di impulsi. I parametri più efficaci per questo esperimento sono risultati essere tre 13-volt impulsi che ogni durato 5.0ms, con 100 ms tra ogni impulso. Se elettroporazione crea bolle d'aria nell'embrione, ridurre la lunghezza degli impulsi. </li></ol> 3. Microiniezione di Morpholinos Into Zebrafish vescicole Otic <ol><li> Zebrafish embrioni raccolta da un serbatoio di allevamento. Incubare gli embrioni in embrione di sensibilizzazione di media con 0,3 PPM blu di metilene (Westerfield, 2005) a 28,5 ° C durante la notte. </li><li> Tirare aghi di vetro con un estrattore Sutter P-97 elettrodi </li><li> Caldo di un gel di base (1% agarosio in acqua i pesci in un piatto da mm 10 Petri) a 37 ° C in un bagno d'acqua </li><li> Riscaldare 1% agarosio a basso punto di fusione (LMPA) in acqua i pesci fino al fuso e tenerlo caldo nel bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Riempire un ago di vetro con una soluzione morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) e tagliare la punta di diametro adeguato. Montare l'ago per l'iniezione su un micromanipolatore (Kuhn). </li><li> Taglio punta dell'ago a circa 10 micron ed iniettarlo in olio minerale per garantire che la punta permette di consegna sufficiente di soluzione morfolino. </li><li> Dechorinate embrioni postfertilization a 24 ore (HPF) e anestetizzare con MS222 (tricaine, Sigma) in 0,3 PPM acqua di metilene di pesce azzurro. </li><li> Allinea 3-5 embrioni anestetizzato sulla base di gel con il lato destro per comodo analisi uniforme </li><li> Mettete 1-2 gocce di 1% LMPA su ogni embrione e lasciate solidificare per fissare l'embrione in posizione </li><li> Ruotare la piastra Petri in modo che la vescicola otica si trova sul lato destro </li><li> Posizionare l'ago nel lume della vescicola otica e iniettare la soluzione morfolino con un pneumatico PV820 PicoPump (Strumenti di precisione mondiale) con un serbatoio di azoto allegato (Figura 2) </li></ol> 4. Procedura di elettroporazione <ol><li> Spostare gli embrioni montato la stazione elettroporazione immediatamente dopo l'iniezione </li><li> Posizionare l'elettrodo positivo sul tessuto appena posteriormente alla vescicola dell'orecchio, ma non penetrano; inserire l'elettrodo negativo nel cervello appena anteriormente alla vescicola otica </li><li> Applicare corrente utilizzando un pedale o premendo un interruttore. </li><li> Versare l'acqua i pesci su agarosio e rimuovere gli embrioni di agarosio, rimestando e una pipetta di vetro. Fare attenzione a non danneggiare gli embrioni. Per gli embrioni che sono difficili da rimuovere, utilizzare un ago per rompere delicatamente via qualsiasi LMPA che circonda l'embrione. </li><li> Embrioni posto in un piatto di pesce con l'acqua di blu di metilene ed aumentare il embrioni a stadi desiderato per l'analisi (morfologica, immunoistochimica, ibridazione in situ anlaysis, etc e microscopici). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stazione di elettroporazione. Elettrodi sono stati realizzati con fili di tungsteno affilati 75μm e collegati da porta ad un cuy-21 onda Proteggere Modifica Piazza Elettroporatore. Questi elettrodi sono state registrate a micromanipolatori. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Stazione di iniezione. Tutti gli embrioni sono stati iniettati nel orecchio destro a fini di normalizzazione. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Colorazione falloidina di filamenti di actina con 3 embrioni dpf. (A) L'embrione injecte 3 dpfd con controllo MO ha colorazione forte falloidina nella macula posteriore (pm). (B) L'embrione che è stato iniettato con il controllo MO e poi elettroporate avevano livelli simili di colorazione in falloidina pm negli embrioni di iniezione unica. (C) Iniezione con MOS mif nella vescicola otica da solo non ha causato la riduzione di colorazione falloidina, mentre l'iniezione di Mos mif con elettroporazione causato una drastica riduzione di colorazione falloidina nel pm (D). Sono, macula anteriore. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Colorazione falloidina di filamenti di actina con 5 larve dpf. Non c'era alcuna differenza tra l'iniezione solo (A) e iniezione con elettroporazione, quando lo standard di controllo morfolino è stato utilizzato (B). Tuttavia, i 5 larve dpf che sono stati iniettati con mif Morpholinos e elettroporate hanno evidenziato una ridotta colorazione falloidina nella macula posteriore (pm) (D), anche se meno drammatico di 3 dpf, se confrontato con l'embrione che è stato iniettato con mif Morpholinos solo (C ). Sono, macula anteriore. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Colorazione tubulina acetilato di embrioni a 3 dpf. L'embrione in (A) non ha ricevuto alcuna iniezione o elettroporazione. L'embrione in (B) è stata elettroporate ma non ha ricevuto l'iniezione. Ricevere embrioni a iniezione e elettroporazione (C, D) con mif Morpholinos era visibilmente diminuito tubulina colorazione rispetto ai controlli. (Pm, macula posteriore). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Colorazione tubulina acetilato di embrioni a 3 dpf con controllo morfolino. (A) degli embrioni, senza alcun trattamento ha mostrato una forte colorazione tubulina acetilata nella macula posteriore (pm) e innervazione estesa. (B) degli embrioni iniettati con controllo morfolino. (C) degli embrioni trattati con elettroporazione solo. (D) embrione di controllo con il controllo morfolino iniettato e elettroporate ha livelli simili di tubulina acetilata nella macula posteriore e innervazione rispetto al non trattamento di controllo.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

La produzione di questo articolo è stato sponsorizzato da Strumenti Gene, LLC che producono reagenti citati nel video e testo.

Noi abbiamo introdotto con successo MOS oligonucleotide antisenso nell&#39;orecchio dell&#39;embrione 24 zebrafish HPF. Embrioni che sono state sollevate dopo l&#39;iniezione ed elettroporazione sono stati vitali. Se gli embrioni sono sopravvissuti l&#39;elettroporazione, sono cresciuti a tassi normali rispetto agli embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento, così come gli embrioni che erano stati soltanto iniettato e gli embrioni che era stato solo elettroporate. Abbiamo osservato gli effetti della commissione interbancaria multilaterale e mif-MOS, come dopo l&#39;iniezione orecchio ed elettroporazione attraverso l&#39;etichettatura con falloidina e tubulina acetilata. Colorazione falloidina di filamenti di actina in cellule ciliate sensoriali della macula posteriore indica che l&#39;elettroporazione di mif e mif-come MO al 24-HPF stadio causato cambiamenti nella cella dei capelli e / o numeri stereocilia rispetto agli embrioni che erano solo iniettato il MOS (Figura 3). Questa diminuzione del numero di cellule dei capelli è coerente con i risultati di Shen et al. (Inviato) che MOS a mif e mif simile a causare una riduzione del numero di cellule ciliate nella macula sacculare. La diminuzione del numero di cellule dei capelli in embrioni che sono stati iniettati con MOS e elettroporate dimostrare che elettroporazione può aiutare nello spostamento del MOS attraverso la membrana cellulare, aumentando così la portata degli effetti morfologici rispetto agli embrioni in cui la vescicola otica era solo iniettato. I cambiamenti nella morfologia del ganglio statoacoustic sono stati osservati attraverso la colorazione tubulina acetilata. Il grado di innervazione del ganglio statoacoustic ha risentito, come gli embrioni che sono stati iniettati e elettroporate mostrano diminuzione ramificazione dei neuriti (Figura 5). Ci possono anche essere ridotta di condensazione delle cellule gangliari e / o riduzione del numero di cellule gangliari, perché la colorazione tubulina acetilata è significativamente diminuito negli embrioni che sono stati entrambi iniettato e elettroporate. Perché mif ha dimostrato di essere fondamentale per lo sviluppo del sistema nervoso (Suzuki et al., 2004), i cambiamenti osservati dopo l&#39;elettroporazione può essere il risultato di trasfezione aumentato del MIF e mif-come MO soluzione nelle cellule neuroblasti. Elettroporazione di oligo antisenso Morpholinos direttamente in un tessuto di sviluppo è uno strumento utile per controllare l&#39;espressione di un gene durante lo sviluppo del tessuto che, sia spazialmente e temporalmente, nell&#39;embrione. Elettroporazione di mif e mif-MOS, come nei tessuti dell&#39;orecchio interno portato a morfologia anormale sia della macula posteriore e il ganglio statoacoustic. C&#39;è stata una riduzione del numero delle cellule ciliate sensoriali nella macula posteriore negli embrioni che erano stati iniettati e elettroporate rispetto a embrioni che non aveva ricevuto alcun trattamento o con embrioni che erano stati o solo iniettata o solo elettroporate. C&#39;era anche una diminuzione del grado di innervazione della patch posteriore sensoriali dal ganglio statoacoustic e la dimensione del SAG. L&#39;elettroporazione è un metodo prezioso per trasfezione macromolecole nei tessuti specifici, con il vantaggio di osservare gli effetti primari di quel particolare DNA, l&#39;RNA, o MO nel tessuto desiderato e discriminante da questi effetti secondari su altri tessuti, compreso il cervello, cresta neurale e mesenchima periotica sullo sviluppo dell&#39;orecchio interno (Barald e Kelley, 2004).

<ol><li> MOS: 0,3 mm di una combinazione di per MIF, mif-come MO1 e MO2 mif-come è stato utilizzato. Mif MO è gratuita per il codone di inizio di mRNA zebrafish mif: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Due MOS sono stati utilizzati per mif-like mif-come MO1 è gratuita per il sito traslazionale inizio:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, mentre mif-come MO2 derivato da AS sequenza al confine intron1/exon 2: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Controllo MO era la sequenza nucleotidica strapazzate da Strumenti Gene: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> blu di metilene (0,3 ppm) in acqua i pesci </li><li> MS222 (tricaine, Sigma; 0,64 mm in acqua i pesci) </li><li> Basso punto di fusione agarosio (LMPA; Roche) </li><li> rosso fenolo (Sigma) </li><li> Anti-acetilato tubulina (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 capra anti-topo secondo anticorpo (sonde molecolari) </li><li> Texas rosso-falloidina (sonde molecolari) </li></ol>

consegna diretta di morpholinos mif into the otocyst zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Negli ultimi anni, elettroporazione è diventata una tecnica popolare per la transfezione in vivo di DNA, RNA, e Morpholinos in vari tessuti, tra cui l&#39;occhio, il cervello, e somiti di zebrafish. Il vantaggio di elettroporazione rispetto ad altri metodi di manipolazione genetica è che i tessuti specifici possono essere mirati, sia spazialmente e temporalmente, per l&#39;introduzione di macromolecole con l&#39;applicazione di corrente elettrica. Qui si descrive l&#39;utilizzo di elettroporazione per la trasfezione mif e mif-come Morpholinos nei tessuti dell&#39;orecchio interno lo sviluppo del pesce zebra. In studi precedenti, mif morfolino iniettate in embrioni a 1 - a stadio di 8 cellule portato a cambiamenti morfologici diffusi nel sistema nervoso e degli occhi, così come l&#39;orecchio. Prendendo di mira i tessuti dell&#39;orecchio interno nelle fasi successive dello sviluppo, possiamo determinare gli effetti primari di MIF nell&#39;orecchio sviluppo interno, al contrario di effetti secondari che possono derivare da l&#39;influenza di altri tessuti. Utilizzando tubulin falloidina e acetylated colorazione per studiare la morfologia dei neuroni, processi neuronali e cellule ciliate associati con la macula posteriore, siamo stati in grado di valutare l&#39;efficacia di elettroporazione come metodo per la trasfezione mirati nell&#39;orecchio zebrafish interno. Le vescicole otic di embrioni 24hpf sono stati iniettati con Morpholinos e elettroporate e sono stati poi confrontati con embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento o erano stati solo iniettato o elettroporate. Embrioni che sono stati iniettati e elettroporate ha mostrato una diminuzione del numero delle cellule dei capelli, diminuzione della innervazione dal ganglio statoacoustic (SAG) e neuroni SAG meno rispetto ai gruppi di controllo. I nostri risultati hanno mostrato che la consegna diretta dei Morpholinos in otocysts nelle fasi successive evita la non specifico del sistema nervoso e gli effetti della cresta neurale Morpholinos consegnato in fase di 1-8 cellule. Consente inoltre l&#39;esame degli effetti che sono diretti per l&#39;orecchio interno e non effetti secondari su un orecchio da effetti primari sul cervello, cresta neurale o mesenchima periotica.

Un metodo per fornire Morpholinos direttamente nel otocyst pesce zebra a 24hpf è stato sviluppato. Mediante microiniezione di Morpholinos nel lume del vescicola otica ed elettroporazione di effettuare la penetrazione, siamo stati in grado di bypassare l&#39;effetto di Morpholinos sul cervello e ottenere effetti specifici per l&#39;orecchio interno.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

Negli ultimi anni, l'elettroporazione è diventata una tecnica diffusa per la trasfezione in vivo di DNA, RNA e morfolini in vari tessuti, tra cui il...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di somministrare direttamente nei vescicoli otici del pesce zebra, a un giorno o a 24 ore dalla fecondazione, oligonucleotidi antisense, morpholino o altre molecole che alterano lo sviluppo. In questo esempio, utilizziamo morpholino contro la prima neurotrofina responsabile dello sviluppo del ganglio acustico statico, una citochina del sistema immunitario chiamata fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi, o MIF, per determinare se i morpholino diretti contro questa molecola influenzino lo sviluppo dell'orecchio interno o la neurogenesi. Questo risultato si ottiene innanzitutto introducendo i morpholino nella cavità del vescicolo otico mediante microiniezione, quindi si esegue l'elettroporazione, che facilita il passaggio dei morpholino dalle cavità ai tessuti cellulari dei vescicoli otici.Successivamente, gli embrioni vengono allevati a 28,5 gradi Celsius al fine di osservare gli effetti dei morphos sullo sviluppo dell'orecchio interno e sulla neurogenesi. Nei giorni seguenti, si ottengono risultati che mostrano una riduzione delle cellule ciliate sensoriali dell'orecchio interno, nonché una diminuzione dell'innervazione da parte del ganglio statoacustico, basata su immunohistochimica e colorazioni foid e, che marciano rispettivamente la tubulina acetilata nelle cinocilia e l'actina nelle stereocilia sulla superficie delle cellule ciliate. Abbiamo originariamente sviluppato questo metodo di iniezione ed elettroporazione di morphos nell'embrione di pollo insieme a uno studente universitario molto talentuoso del laboratorio.Katie Holmes è riuscita a ridurne la scala alle dimensioni del pesce zebra. L'attuale gruppo di ricerca, composto da Yuchi, una ricercatrice postdottorato, e Matt Wyatt, uno studente laureato, insieme a Deb Thompson, ex ricercatrice postdottorato nel laboratorio, ha perfezionato questa tecnica per il pesce zebra. Si spera che questo metodo possa rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo e della ricerca uditiva, tra cui se effetti morfologici specifici su un sistema organico come l'orecchio possano essere distinti da effetti dello sviluppo generalizzati che influenzano molti sistemi organici e sono secondari rispetto all'orecchio, ad esempio effetti sul cervello che influenzano secondariamente l'orecchio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le microiniezioni agli stadi da una a quattro cellule, è che questo metodo introduce direttamente i morphos nell'orecchio in stadi successivi. In questo modo si possono evitare gli effetti secondari sull'orecchio interno, concentrandosi sugli effetti diretti dei morphos sul brand. Per preparare gli elettrodi, iniziare tagliando un filo di tungsteno del diametro di 75 micrometri, lungo circa da tre a cinque centimetri. Far passare il filo di tungsteno attraverso un connettore per cavo Molex.Successivamente, avvolgere i fili di tungsteno e il connettore del cavo Molex con guaina termorestringente ed applicare calore mediante un becco Bunsen o una pistola termica per sigillare la guaina intorno al filo. Per affilare la punta del filo di tungsteno, immergere il filo in una soluzione di idrossido di sodio 1 N e, utilizzando una graffetta come altro elettrodo, elettrolizzare il filo con un'onda quadra. Le condizioni che utilizziamo sono cinque impulsi di 50 volt, ciascuno della durata di 100 millisecondi, con intervalli di 50 millisecondi tra un impulso e l'altro.Eseguire tre ripetizioni con la punta dell'elettrodo immersa nell'idrossido di sodio 1 N. Inserire leggermente di più l'elettrodo nell'idrossido di sodio ed eseguire un'ulteriore ripetizione. Inserire ulteriormente l'elettrodo, avanzando ancora di una distanza approssimativamente uguale entrambe le volte ed eseguire un'ultima ripetizione.Questo affilatura graduale produce una punta molto fine sull'elettrodo, consentendo un'inserzione degli elettrodi nell'embrione di pesce zebra in via di sviluppo più precisa e meno dannosa. Prima dell'uso per l'elettroporazione per l'iniezione microscopica di morpholino nei vescicoli otici del pesce zebra, mantenere i fili premuti nella pasta modellabile all'interno di un vassoio. Preparare innanzitutto dei contenitori per l'accoppiamento con una barriera di plastica per separare i maschi dalle femmine la sera precedente.Collocare quattro maschi e quattro femmine nel serbatoio e lasciare il serbatoio in una stanza di incubazione con un ciclo chiaro-scuro di 14 a 10 per tutta la notte. La mattina successiva, dopo l'accensione delle luci, rimuovere il divisorio e lasciare i pesci indisturbati per circa 20-30 minuti. Separare i maschi dalle femmine ed eliminare gli adulti riproduttori dal serbatoio di riproduzione.Collocarli in vasche contenenti acqua fresca per pesci. Raccogliere gli embrioni dalla vasca di riproduzione versando l'acqua contenente le uova attraverso un colino. Sciacquare le uova nel colino più volte con acqua fresca per uova prima di trasferirle in una capsula di Petri.Rimuovere eventuali uova non fecondate o opache e incubare gli embrioni in mezzo di coltura con 0,3 PP m di blu di metilene a 28,5 gradi Celsius durante la notte, mentre gli embrioni incubano. Tirare le micropipette di vetro con un elettrodo puller Sutter P 97 appena prima dell'iniezione. Riscaldare una base di gel AROS costituita da 1% agros in acqua per pesci in una piastra di Petri da 10 millimetri a 37 gradi Celsius in un bagno termico, 1% di agros a basso punto di fusione o LMPA in acqua per pesci fino a completa fusione e mantenerla calda nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Riempire un ago di vetro con una soluzione di morfo e tagliare la punta al diametro appropriato, circa da 10 a 15 micron. Montare l'ago da iniezione su un micromanipolatore collegato a una pompa pneumatica Pico Pump PV820 con bombola di azoto. Decorticare gli embrioni a 24 ore dalla fecondazione e anestetizzarli con trica nell'acqua per pesci al 0,3 PPM di blu di metilene.Successivamente, allineare da tre a cinque embrioni anestetizzati sulla base di gel AROS con il lato destro rivolto verso l'alto per un'analisi uniforme e agevole; applicare una o due gocce di LMPA all'1% su ciascun embrione e lasciar solidificare per fissare l'embrione in posizione. Ruotare la piastra di Petri in modo che la vescicola otica si trovi sul lato destro. Quindi inserire l'ago nella cavità della vescicola otica ed iniettare la soluzione morfo utilizzando il pedale a pedale.Immediatamente dopo la microiniezione, spostare gli embrioni montati alla stazione di elettroporazione per configurare la stazione di elettroporazione. Innanzitutto, fissare con del nastro le elettrodi al tungsteno affilati da 75 micrometri ai micromanipolatori. Successivamente, posizionare i micromanipolatori su entrambi i lati del tavolo del microscopio stereoscopico.Accendere l'elettroporatore e impostare i parametri per l'elettroporazione. I parametri più efficaci per questo esperimento si sono rivelati essere tre impulsi di 13 volt di due millisecondi ciascuno, con un intervallo di 100 millisecondi tra ogni impulso.Inserire gli elettrodi in modo che la vescicola otica sia affiancata uniformemente, con un elettrodo superficiale rispetto alla vescicola otica e l'altro profondo rispetto ad essa. Successivamente, applicare una corrente utilizzando un pedale o premendo un interruttore quando l'elettroporazione è terminata. Versare acqua per pesci sugli aros e rimuovere gli embrioni utilizzando una pipetta di vetro e ruotando delicatamente la piastra.Procedere con cautela per non danneggiare gli embrioni difficili da rimuovere. Utilizzare un ago per rimuovere delicatamente qualsiasi LMPA presente attorno ad essi. Trasferire gli embrioni in una piastra contenente acqua per pesci con blu di metilene ed allevare gli embrioni fino alle fasi desiderate per l'immunohistochimica morfologica.Nell'ibridazione C due e nell'analisi microscopica, vengono mostrati qui risultati rappresentativi di iniezione nell'orecchio ed elettroporazione di morphos. La macula posteriore o uditiva, indicata con PM, è uno degli organi dell'udito nel pesce quando viene marcata con Phin rosso. In questa fotografia, i fasci di actina nei stereocili sulle cellule sensoriali a cigli appaiono come puntini rossi sul ping pong.La macula a forma di pagaia, osservata mediante marcatura fluorescente con Phin in un embrione di tre giorni post-fecondazione iniettato con MIF morpholino, mostra un maggior numero di filamenti di actina all'interno delle stereociglia sulle cellule ciliate rispetto agli embrioni della stessa età che sono stati sia elettroporati che iniettati. Tuttavia, l'iniezione e l'elettroporazione con il morpholino di controllo standard non hanno causato una riduzione della colorazione F e rispetto all'iniezione del solo morpholino. I risultati sono simili nella macula posteriore, sebbene meno marcati dopo cinque giorni in larve che sono state iniettate ed elettroporate, confrontate con l'embrione iniettato solo con MIF morpholino.Non c'è stata alcuna differenza tra iniezione soltanto e iniezione con elettroporazione quando è stato utilizzato il morph controllo standard. Questo embrione, che è stato colorato con un anticorpo contro la tubulina acetilata, non ha ricevuto alcuna iniezione né elettroporazione di MIF Morphoses. Questo embrione è stato sottoposto a elettroporazione ma non ha ricevuto alcuna iniezione.Entrambi gli embrioni mostrano una colorazione normale per la tubulina acetilata. Entrambi gli embrioni sono stati iniettati ed elettroporati. Presentavano una colorazione per la tubulina visibilmente ridotta rispetto ai controlli e un numero molto inferiore di processi neuronali associati all'orecchio e ai gangli circostanti.Quando il morpho di controllo è stato utilizzato per l'iniezione e l'elettroporazione, non è stata osservata una riduzione dell'estensione della colorazione per la tubulina acetilata, né una diminuzione dell'innervazione da parte del ganglio acustico, rispetto all'iniezione del morpho da solo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se effettuata correttamente. La parte più difficile della tecnica da apprendere è l'elettroporazione; particolare attenzione deve essere prestata per non danneggiare il cervello, e l'uso di elettrodi affilati aiuterà a ridurre questo problema.

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Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l'espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo...

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

Il protocollo descrive l'abbattimento mirato dell'espressione genica nel pesce zebra mediante iniezione di morfolino nella coda.

Iniezione di Morpholino: un metodo per abbattere l'espressione genica bersaglio per studiare la funzione nel pesce zebra

In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.

Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di embrioni di ratto E16

Scopri la consegna mirata di morpholinos nell'otocisti di Danio rerio mediante microiniezione ed elettroporazione. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo dell'orecchio interno isolando gli effetti specifici sul sistema uditivo.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dellorecchio interno (Video) | JoVE Journal

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell'orecchio interno

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