Un metodo alternant al tradizionale modello della NASA arti posteriori di scarico in topi

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire lo scarico degli arti posteriori, o hu, nei topi mediante un metodo più semplice e diretto, che minimizzi lo stress per l'animale. Questo metodo di applicazione alla coda induce con successo l'atrofia degli arti posteriori senza compromettere la salute generale e il peso corporeo. Il primo passaggio consiste nell'implantare un anello caudale in un topo adulto.

È importante che il peso corporeo e le osservazioni relative alla salute vengano registrati per tutta la durata dello studio. Successivamente, l'apparato di scarico degli arti posteriori viene assemblato e posizionato all'interno di una gabbia dove avverrà lo scarico. Una volta che l'animale si è ripreso, viene posizionato all'interno dell'apparato per la procedura di scarico.

In definitiva, i risultati possono essere ottenuti mediante misurazioni della massa corporea e muscolare che hanno evidenziato un'atrofia muscolare degli arti posteriori nei topi non sollecitati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnica di fissaggio con nastro di Maori Holton, è che la cute della coda è sempre visibile. I topi non sono in grado di uscire dall'apparato di sospensione né di giocare con l'anello, e si riprendono più rapidamente mantenendo un peso corporeo stabile.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della fisiologia muscoloscheletrica, nonché della biologia gravitazionale e spaziale, ad esempio su come prevenire l'atrofia muscolare scheletrica e la perdita ossea dopo lunghi periodi di inattività fisica, riposo a letto, immobilizzazione degli arti, microgravità, malattie neuromuscolari e con l'avanzare dell'età. Abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando abbiamo riscontrato complicazioni con la tecnica di fissaggio della coda di Maury Holden. Perdevamo costantemente animali e dati sperimentali a causa della fuga dei topi dall'apparato degli arti posteriori durante la dimostrazione di questa tecnica.

Oggi sono presenti Andre's Ferrara, ricercatore associato senior del mio laboratorio, con l'assistenza di Jacqueline Chrissy, studentessa dottoranda del laboratorio, e Andrew Dunn, studente universitario dello stesso laboratorio. Iniziare sterilizzando l'area chirurgica, anestetizzando il topo adulto con isoflurano, quindi registrare il peso del topo e posizionarlo su un tappetino riscaldante. Preparare la coda per l'intervento chirurgico strofinandola con soluzione di clorexidina.

Iniziare a contare a partire dall'estremità dei peli del corpo alla base della coda per individuare lo spazio intervertebrale quinto, sesto o settimo tra due protuberanze ossee sulla coda. Utilizzare un emostato e un ago 20 5G per creare un foro pilota tra due vertebre, penetrando nello spazio intervertebrale. Rimuovere l'ago e inserire un filo di sutura in acciaio.

Tagliare a una lunghezza di 10 centimetri attraverso il foro. Cinque centimetri di sutura devono sporgere da ciascun lato della coda. Appoggiare la punta del pollice sulla coda e utilizzare l'altra mano per avvolgere la sutura di acciaio intorno al pollice.

Twista le estremità per formare un grande anello. La parte avvolta o circolare deve essere lunga circa tre millimetri. Fissa un capo del filo di sutura con un emostatico e piegalo in un anello più piccolo, il cui estremo va attaccato il più vicino possibile alla torsione del grande anello originale.

Tagliare il filo in eccesso e ripiegare indietro il filo attorcigliato. Arrestare qualsiasi sanguinamento residuo con bastoncini di nitrato d'argento. Lasciare l'animale in recupero per cinque a sette giorni prima dello scarico dell'arto posteriore o dello hu dopo l'intervento chirurgico.

Collocare singolarmente la casa del misero per evitare che gli anelli della coda si aggroviglino. Sovrapporre un'asta di acciaio scanalata placcata spessa un pollice e larga tre ottavi di pollice sulla sommità della gabbia e fissarla con del nastro adesivo. Aggiungere un altro dado e un dado a ghiera, ma non avvitarli completamente per permettere regolazioni successive.

Inserire la vite meccanica attraverso il foro centrale della bobina per impedire che cada. Avvitare un dado autobloccante in nylon all'estremità della vite meccanica. La bobina deve ruotare liberamente.

Inserire il gancio a sgancio rapido di un moschettone da pesca nella parte inferiore del rocchetto. Utilizzare delle pinze per modellare un gancio a forma di S da una graffetta. Inserire un'estremità del gancio a forma di S nel foro del moschettone da pesca e chiuderlo premendo con le pinze.

Posizionare un filo a forma di U parallelamente alla vite sulla parte interna della gabbia e piegare le estremità verso l'esterno. Per sostenere una bottiglia piena d'acqua, inserire la bottiglia nel filo a forma di U con il beccuccio rivolto verso il basso, ma senza farlo toccare il fondo. Fissare la bottiglia alla gabbia con nastro adesivo robusto.

Aprire una molletta per raccoglitore da due pollici, lasciando una tensione sufficiente a trattenere alcuni pezzi di cibo senza schiacciare le pastiglie prima della procedura di scarico degli arti posteriori. Registrare il peso del topo da utilizzare per i confronti. Successivamente, inserire l'estremità aperta del gancio a forma di S nell'anello più piccolo che sporge dalla coda.

Regolare l'altezza del mouse stringendo o allentando il dado a farfalla inferiore sulla vite della macchina. Gli arti inferiori non devono sostenere il peso. Una volta raggiunta l'altezza ottimale, stringere il dado a farfalla superiore e riposizionare la bottiglia dell'acqua con un nuovo filo modellato in modo che il mouse non possa arrampicarsi sul beccuccio con gli arti posteriori.

Per misurare il consumo alimentare durante lo studio, pesare le pastiglie prima di posizionarle nella pinza del raccoglitore. Fornire circa otto-dieci grammi per consentire un consumo di circa cinque-sei grammi di mangime al giorno. Per ogni posizione del topo, posizionare la pinza del raccoglitore con il cibo sul fondo della gabbia in modo che il topo non possa arrampicarcisi sopra, e fissarla con nastro adesivo isolante.

Utilizzando due pollici per due pollici di piume di gallo in modo allentato. Avvolgere la coda sull'ancoretta. Avvolgere una piccola parte di coda intorno alle piume di gallo, fissando le piume di gallo alla coda.

Questo passaggio è importante per evitare che la coda penda verso il basso, causando l’afflusso di sangue alla punta e la necrosi della coda. Ripetere la stessa procedura per un ulteriore animale sull’altro lato della gabbia. Quando si alloggiano due animali per gabbia, posizionarli in modo che possano quasi toccarsi l’un l’altro.

Al centro della gabbia. Aggiungo una piccola quantità di lettiera in cob alla gabbia, assicurandomi che non ce ne sia abbastanza perché il topo possa utilizzarla per formare un mucchio. Dopo la procedura di scarico dell'arto posteriore, rimuovere l'animale dall'apparato e rimuovere l'anello caudale.

Utilizzando un tagliafilo, registrare il peso corporeo e restituire l'animale alla sua gabbia per il recupero. Dopo un periodo di recupero, gli animali vengono nuovamente lasciati in attesa e vengono misurati il muscolo soleo e le masse surrenali. I pesi corporei prima dell'intervento chirurgico sulla coda non differivano significativamente da quelli rilevati cinque giorni dopo l'intervento e prima dell'hu.

Sebbene lo scarico degli arti posteriori per 14 e 28 giorni abbia provocato una lieve perdita di massa corporea, questa non è risultata statisticamente significativa; i topi hanno infatti recuperato completamente i pesi corporei precedenti allo scarico. Dopo tre giorni di recupero, qui viene mostrato il consumo alimentare di topi di controllo deambulanti e di topi sottoposti a scarico.

L'assunzione alimentare giornaliera media non è risultata diversa nei topi HU rispetto ai controlli durante un periodo di 28 giorni. Un'atrofia significativa del muscolo soleo è stata osservata dopo 14 e 28 giorni di HU, indicando una procedura efficace già dopo tre giorni di recupero. La massa del soleo è risultata significativamente maggiore rispetto a entrambi i gruppi HU, ma comunque significativamente inferiore rispetto agli animali di controllo ambulatoriali.

Entrambe le ghiandole surrenali, destra e sinistra, sono state escisse e pesate per fornire un indicatore dello stress animale. Come mostrato qui, i pesi medi erano confrontabili tra i topi di controllo e quelli HU. Una volta acquisita padronanza, la chirurgia di adattamento può essere completata in cinque-dieci minuti per topo, e l'allestimento della gabbia può essere portato a termine in 15 minuti seguendo questa procedura. Altri metodi come il ricarico degli arti, il recupero dall'atrofia da inattività e l'utilizzo di topi Hein possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio su come i sistemi muscolare e scheletrico possano recuperare e rispondere a prolungati periodi di inattività.

Ora che hai visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire lo scarico degli arti posteriori nei topi. Questa tecnica permette lo studio di diversi tessuti e sistemi, come quelli cardiovascolare, muscoloscheletrico e intestinale, in condizioni di scarico e ricarico, utilizzando una varietà di modelli murini come knockout o knockin.