Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare cellule progenitrici miogeniche e adipogeniche vitali dal muscolo scheletrico speculare. Ciò si ottiene raccogliendo prima il tessuto muscolare da topi soppressi. In una seconda fase, il campione viene digerito enzimaticamente, dissociando il tessuto in singole cellule.

utilizzato lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza o i fatti per isolare le cellule progenitrici. Si ottengono risultati che mostrano la vitalità e la differenziazione delle cellule isolate quando trapiantate in topi riceventi sulla base della colorazione istochimica per l'etichetta genetica, che in questo esempio è la fosfatasi alcalina umana. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a tecniche preesistenti come il prepl è che le cellule possono essere isolate direttamente dall'animale in diversi punti temporali.

Ad esempio, dopo aver indotto un danno tissutale, il che significa che non c'è selezione sulla popolazione cellulare e la popolazione cellulare può essere analizzata a livello molecolare per osservare i diversi stadi che le cellule attraversano durante il processo di rigenerazione in vivo. Quindi questa tecnica può aiutare a rispondere a una domanda critica nel campo della rigenerazione tissutale, e in particolare, quale ruolo svolge ogni tipo di cellula durante la rigenerazione in vivo e come questi tipi di cellule interagiscono tra loro per ricostruire un tessuto sano? Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia di malattie come la distrofia muscolare.

Poiché lo studio di questi progenitori può eventualmente consentire strategie rigenerative per questo tipo di malattie. Inoltre, le implicazioni di questa tecnica si estendono a una serie di altri tessuti che vanno dal cuore al adiposo perché almeno i progenitori fibro adipogenici sono stati trovati in ogni singolo tessuto che abbiamo testato finora. In generale, i neofiti di questa tecnica avranno difficoltà perché le tecniche di dissociazione dure ridurranno la vitalità cellulare e creeranno troppi detriti, che interferiranno con la separazione pulita delle cellule in seguito.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di applicare la citometria a flusso, che viene solitamente utilizzata per le cellule APOE, allo studio delle cellule staminali nei tessuti solidi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante in quanto le fasi di dissociazione tissutale sono difficili da apprendere perché è molto difficile descriverle correttamente. A dimostrare questa tecnica oggi sarà Linky, un assistente di ricerca nel mio laboratorio che per primo ha sviluppato e ottimizzato la tecnica Per questa procedura sono necessari almeno due topi.

Un topo viene utilizzato per le cellule per fornire i controlli necessari per il colore singolo e l'isotipo degli anticorpi per i fatti, e l'altro fornirà il campione da ordinare. Per iniziare, procurati topi di età compresa tra le sette e le 12 settimane che sono stati precedentemente soppressi in una cappa da laboratorio sterile. Metti il topo soppresso su un tovagliolo di carta sterile, a faccia in su e spruzza accuratamente la pelliccia con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione con una pinza in una mano e forbici affilate nell'altra.

Sollevare la pelle nella regione addominale e praticare una piccola incisione longitudinale. Afferrare la pelle su ciascun lato dell'incisione e staccare la pelle per esporre completamente i muscoli degli arti posteriori. Successivamente, asportare il tessuto muscolare inserendo le forbici chiuse sotto il muscolo e sopra la tibia e quindi aprendo le forbici.

Il bordo posteriore delle lame forzerà delicatamente la separazione del muscolo dalla tibia. Ripetere per entrambi i lati della tibia e posizionare il fazzoletto in una capsula di Petri da 60 millimetri. Ora asporta il tessuto muscolare dal femore allo stesso modo e aggiungi il tessuto alla capsula di Petri.

Ripeti per ogni topo usando una capsula di Petri per topo. Successivamente, dissociare il tessuto in singole cellule. Aggiungere due millilitri o 1000 unità di collagenasi, due e 20 microlitri di soluzione madre di cloruro di calcio da 250 millimolari a ciascuna capsula di Petri di tessuto muscolare.

Quindi lavorando rapidamente e con attenzione. Usa due pinze grigie, una seghettata e una con due denti per strappare il tessuto in pezzi di un millimetro cubo. Rimuovere e scartare quanto più tessuto non muscolare possibile.

Coprire le piastre di Petri e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, recuperare le piastre e rimetterle nella cappa sterile del laboratorio. Togliete lo stantuffo da una siringa da tre millilitri e usatelo per schiacciare il fazzoletto.

Utilizzare uno stantuffo per piastra per evitare la contaminazione incrociata. Aggiungere circa cinque millilitri di PBS sterile freddo a ciascuna piastra di Petri e trasferire il contenuto della piastra in una provetta conica da 50 millilitri. Sciacquare con altri cinque millilitri di PBS per recuperare tutto il tessuto e aggiungerlo al tubo conico.

Lavare e centrifugare i campioni tre volte secondo il protocollo. Quindi, aggiungere un millilitro di una soluzione composta da collagenasi D disspazio due e cloruro di calcio a ciascuna provetta e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per un'ora. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di PBS sterile freddo alle provette, agitare brevemente le provette e tritrarle più volte per dissociare i grumi.

Riempire bene le provette con PBS, mescolare e metterle sul ghiaccio Per rimuovere eventuali pezzi di tessuto di grandi dimensioni rimanenti, posizionare un colino cellulare da 40 micron su una provetta conica da 50 millilitri sul ghiaccio e filtrare la sospensione cellulare. Dividere il flusso in modo uniforme in tre provette coniche da 50 millilitri riempite con PBS freddo e sterile e centrifugare a 1600 giri/min per cinque minuti a otto gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura la S e posizionare le cellule sul ghiaccio per la colorazione e lo smistamento delle cellule progenitrici miogeniche e adipogeniche.

Innanzitutto, impostare i sei controlli misti di colorazione a colore singolo secondo il protocollo scritto allegato. Questi controlli includono la colorazione no stain, lo ioduro di propidio, gli anticorpi marcati con FSE CD 31 e CD 45, l'anticorpo marcato SC one P size seven e l'anticorpo marcato con PC alfa sette A. Successivamente, impostare le tre miscele di colorazione per il controllo dell'isotipo anticorpale secondo il protocollo scritto.

Una volta preparate le miscele di colorazione, etichettare nove provette da 1,5 millilitri per i campioni di controllo del singolo colore e dell'isotipo. Resus sospendere e combinare le celle dei tre tubi conici in un volume totale di un millilitro di tampone fax. Successivamente, erogare 100 microlitri di cellule in ciascuna provetta di controllo einor etichettata e pipettare tra cinque e 10 microlitri di miscele coloranti a seconda della concentrazione degli anticorpi nelle provette di controllo corrispondenti.

Risospendere le cellule dal topo campione in 200 microlitri di tampone fax e combinarle in una delle provette coniche da 50 millilitri. Quindi aggiungere 800 microlitri del cocktail di anticorpi. Miscelare ciascuna delle provette di controllo e delle provette del campione.

Incubateli bene sul ghiaccio per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare le cellule aggiungendo un millilitro di tampone fax a ciascuna delle nove provette di controllo e circa 20 millilitri di tampone fax alla provetta del campione. Centrifugare le provette di controllo a 3000 giri/min per cinque minuti.

Centrifugare la provetta conica del campione a 1600 giri/min per cinque minuti. Quindi aspirare e gettare la boccina dopo la centrifugazione. Risospendere le celle di controllo in ciascuna provetta con un millilitro di tampone fax e risospendere le celle del campione in quattro millilitri di tampone fax.

Aggiungere lo ioduro di propidio alle celle campione e ai controlli isotipici, nonché al pi greco. Tubo di controllo colore singolo. Pipettare le cellule in tubi fax attraverso il tappo del filtro cellulare per rimuovere i grumi rimanenti che possono influenzare il citometro.

Impostare lo strumento fax con un unico colore e controlli di isotipo. Ordinare le cellule campione in base al protocollo scritto allegato e raccogliere ogni popolazione separatamente. E una provetta di raccolta da 3,5 millilitri Progenitori miogenici vitali sono la popolazione che è hulked e alfa sette un PC positivo e PI CD 31 FE CD 45 FE e ska.

Un PE di dimensione sette negativi progenitori adipogenici vitali sono hulked e ska un PE di dimensione sette positivi e pi CD 31 FE, CD 45 FE e alfa sette un PC negativo. Un singolo topo selvatico può produrre circa una volta 10 al quinto progenitore adipogenico e da 1,5 a due volte 10 al quinto. Progenitori miogenici con maggiore del 95% di vitalità.

Per preparare le cellule per il trapianto nei topi ospiti, le cellule vengono lavate. La prima centrifuga distorce le celle a 1500 giri/min per cinque minuti. Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferirle in provette eorr.

Centrifugare le provette a 3000 giri/min per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Quindi resus sospendere i progenitori miogenici nella PBS o i progenitori adipogenici nel matri matrigel a circa 10 alle sei cellule per millilitro. Dopo aver preparato i topi ospiti anestetizzati per ogni tipo di cellula donatrice, secondo il protocollo scritto, utilizzare una siringa da insulina da tre decimi di centimetro cubo per iniettare 20 microlitri circa 20.000 cellule di progenitori miogenici o adipogenici.

Lasciare il tempo appropriato affinché le cellule trapiantate si differenzino, di solito circa tre settimane. Quindi isolare il tessuto bersaglio e prepararlo per la criosezione come descritto nel protocollo in questa figura, la strategia di smistamento è dimostrata per isolare i progenitori adipogenici e miogenici le cellule vitali sono state identificate sulla base della dispersione diretta e laterale La colorazione del falco a dispersione laterale è stata utilizzata per escludere un detrito nucleare e lo ioduro di propidio o la colorazione PI è stata utilizzata per escludere le cellule morte, Le cellule ematopoietiche ed endoteliali, o rispettivamente le cellule CD 45 e CD 31, sono state quindi escluse dai cancelli di smistamento. Infine, il sottoinsieme che è alfa sette positivo.

SKA one negativo contiene tutti i progenitori miogenici e la popolazione che è alfa sette negativa. SKA one positivo contiene tutti i progenitori adipogenici, la fluorescenza meno un controllo dell'isotipo conferma la specificità della colorazione. Inoltre, sono stati eseguiti controlli di purezza dei sottogruppi adipogenici e miogenici.

Dopo lo smistamento in questo esempio rappresentativo, le cellule donatrici progenitrici adipogeniche che esprimono fosfatasi alcalina umana transgenica iniettata per via sottocutanea possono essere identificate nel tessuto ospite mediante istochimica come indicato dalla colorazione marrone. Cellule donatrici progenitrici miogeniche che esprimono cellule transgeniche. La fosfatasi alcalina umana iniettata per via intramuscolare è stata identificata in questa sezione di tessuto come mostrato in marrone.

Utilizzando l'istochimica Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Se vengono elaborati più campioni, il tempo aumenterà. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare in modo rapido e delicato.

Pertanto, evitare di elaborare troppi campioni alla volta. Prolungare il tempo di elaborazione ridurrà notevolmente la variabilità cellulare dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi dell'espressione di colono SC OG, mediante R-T-P-C-R quantitativa possono anche essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come rispondono queste cellule pro al danno in vivo dopo il suo sviluppo?

Questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo della rigenerazione tissutale per esplorare il crosstalk tra le cellule pro nel tessuto danneggiato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare questi tessuti senza danni. Le cellule progenitrici identificano le cellule progenitrici in base ai loro marcatori di servizio e analizzano il loro potenziale di sviluppo in vivo.

Grazie per aver guardato. Buona fortuna con il tuo esperimento.