Name: Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Impara a isolare progenitori miogenici e adipogenici dal muscolo scheletrico murino mediante digestione enzimatica e FACS. Questo metodo consente l'analisi della rigenerazione tessutale in vivo.

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1. Tessuto Collezione: <ol><li> Utilizzare topi tra 7 e 12 settimane di età. Di solito, almeno due animali sono utilizzati: uno è quello di impostare il FACS monocolore controlli necessari per il risarcimento e per campioni isotipo fluorescenza-meno-un controllo. L'altro è il campione reale per l'ordinamento. </li><li> Euthanize i topi da CO 2 inalazione o secondo un protocollo di etica della scelta. Topi posto su un tovagliolo di carta, rivolta verso l'alto, e spruzzare con il 70% di etanolo a fondo per evitare la contaminazione con la pelliccia del mouse. </li><li> Sollevare la cute nella regione addominale con una pinza, poi fare un piccolo taglio longitudinale con forbici affilate. </li><li> Sbucciate i due lembi di pelle in direzioni opposte (su e giù) per esporre completamente i muscoli degli arti posteriori sotto. </li><li> Dell'accisa il tessuto muscolare inserendo ed estendendo le forbici lungo entrambi i lati della tibia. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il femore per estrarre il tessuto muscolare. </li><li> Mettere tutti i tessuti muscolari asportati in 60 millimetri di Petri-piatti, utilizzando un piatto per il tessuto di ogni topo. </li><li> Ripetere quanto sopra per tutti i mouse. </li></ol> 2. Dissociare tessuto in cellule singole per digestione enzimatica: In questa sezione del protocollo, utilizzare i reagenti e strumenti sterili e lavorare in condizioni sterili. <ol start="9"><li> Aggiungere 2 ml di Collagenasi II (Sigma, cat # 6885, 500U / mL) e 20 l di 250mm CaCl 2 magazzino ad ogni Petri-piatto. </li><li> Lacerare il tessuto muscolare in piccoli pezzi (circa 1 mm 3) con due pinze (una seghettato, una con 2 denti, da Strumenti Scienze Arti, cat # 11051-10, 11154-10), facendo attenzione a rimuovere ed eliminare il più contaminati non-tessuto muscolare possibile. </li><li> Coprire il Petri-piatti e incubare loro a 37 gradi centigradi per 30 minuti. </li><li> Recuperare il Petri-piatti e usare una siringa da 3 ml stantuffo a schiacciare a fondo i pezzi di tessuto. Utilizzare uno stantuffo per ogni campione per evitare contaminazioni. </li><li> Aggiungete un po '(~ 5 ml) PBS freddo sterile ad ogni Petri-piatto e trasferire i fanghi tessuto in un tubo 50mL Falcon (sciacquare la Petri-piatto, se necessario, di recuperare tutti i tessuti) </li><li> Agitare la provetta Falcon vigorosamente, riempire la provetta con PBS, centrifugare @ 800 giri x 5 minuti (da banco Eppendorf top Modello: 5810R), e aspirare il surnatante (ripetere 3 volte) </li><li> Aggiungere 1 ml di miscela Collagenasi D (Roche, Cat # 11088882001, 1,5 U / mL) / dispasi II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / mL) e 10μL di CaCl 2 (250mm) a ciascuna provetta, incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per un'ora. </li><li> Aggiungere 5-10 ml di freddo, sterile PBS, vortice e pipetta accuratamente per omogeneizzare il tessuto. </li><li> Riempire i tubi con PBS e mescolare bene. </li><li> Trasferire il liquido in un colino cellula 40μm collocato su un tubo 50 ml Falcon per filtrare i pezzi di altri grandi produttori di tessuto. Dividere ogni campione uniformemente in tre 50mL tubi Falcon. Riempire ciascuno dei tubi con PBS quindi si centrifuga @ 1600rpm per 5 minuti a 8 gradi Celsius. </li><li> Eliminare il supernatante e raccogliere le cellule per la colorazione. </li></ol> 3. Anticorpi colorazione e ordinamento: In questa sezione del protocollo, l'uso FACS tamponi sterili e la raccolta e il lavoro in condizioni sterili. Anticorpi commerciali sono generalmente considerati sterili se correttamente gestita. <ol start="20"><li> Per singolo colore e campioni di controllo isotipico, risospendere il campione in 1 ml di buffer FACS e dividere le cellule sospese in nove 1,5 ml di pre-etichettati tubi Eppendorf (100 l ogni tubo). <ol><li> Impostare colorazione singolo colore si mescola in base alla seguente tabella: ATTENZIONE: La concentrazione finale di anticorpi isotipo di controllo nella macchia dovrebbe corrispondere a quello dell'anticorpo primario sono il controllo. Per esempio, se anti-Sca-1 è usato per 1 μg/10 6 celle, il suo isotipo corrispondente deve essere utilizzato alla stessa concentrazione. <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nome del tubo </td><td> Azienda </td><td> Cat # </td><td> clone </td><td> isotipo </td><td> diluizione </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Non macchia </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Fatti in casa </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Fatti in casa </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Impostare colorazione controllo isotipico mescola con la seguente tabella: <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo # </td><td> Nome di tubo </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-Cy7 </td><td> A-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Pipettare il singolo colore e di isotopi mescola colorazione di controllo (di solito regolare la concentrazione di anticorpi in modo che tra 5 e 10 ml di colorazione miscela vengono aggiunti ad ogni campione) nel tubo Eppendorf appropriato dal punto 20. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora. </li></ol></li><li> Macchia cellule di topo campione con 800μL del cocktail di anticorpi (in basso) per l'ordinamento delle cellule FACS. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 1 ora. Anticorpi cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, SCA1-PECY7, α-7 APC ATTENZIONE: Il rapporto ottimale di anticorpi contro le cellule devono essere determinata individualmente ogni titolazione degli anticorpi, in quanto possono esistere differenze significative tra i lotti. La quantità ottimale di anticorpi da utilizzare devono essere espressi in μgs di anticorpi per 10 6 cellule bersaglio e mantenuta costante durante l'utilizzo dello stesso lotto di anticorpi. Chiaramente, se il numero di cellule bersaglio non cambia significativamente tra gli esperimenti, o se il volume colorazione è in scala con il numero di cellule, una diluizione fisso di ciascun anticorpo può essere utilizzato anche. </li><li> Lavaggio: Aggiungere circa 1 ml di buffer di FACS per ognuna delle 9 provette di controllo, aggiungere circa 20 mL di tampone FACS alla provetta. </li><li> Centrifugare le provette Eppendorf @ 3000rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5417C). Centrifugare la provetta @ 1600rpm per 5 minuti (da banco centrifuga Eppendorf in alto, Modello: 5810R). </li><li> Aspirare e scartare il supernatante da tutti i tubi. </li><li> Risospendere le cellule nel buffer FACS (1 ml per ciascuno dei controlli, da 4 ml per il campione ordinamento), le cellule Pipettare in "tubi FACS" attraverso il filtro delle cellule tappo (cat BD Falcon # 352235, 40μm dimensioni dei pori) per rimuovere macchie rimanenti che possono influire sul citometro. </li><li> Impostare il FACS sorter con controlli singolo colore e controlli isotipo. </li><li> Raccogliere le cellule ordinati secondo la tabella seguente in un buffer di 3,5 ml di raccolta (95% DMEM, 5% FBS) separatamente. Normalmente, quando la raccolta entrambi gli arti posteriori, un mouse di tipo selvatico potrebbe produrre circa 150.000 cellule progenitrici miogeniche o 100.000 cellule progenitrici adipogenico, con la vitalità superiore al 95%, come giudicato da rianalizzati cellule ordinati per FACS al termine della procedura (Figura 1 ) Definizione dei progenitori miogenici e adipogenico base alla colorazione della superficie <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo / macchia </td><td> Progenitrici miogenici (MP) </td><td> Progenitrici adipogenico (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Trapianto: <ol start="28"><li> Centrifugare le cellule ordinati @ 1500rpm per 5 minuti, togliere le cellule surnatante e trasferimento in autoclave i tubi Eppendorf (1,5 ml), lavare le cellule con 500 l di PBS sterile (i livelli di free!), Quindi si centrifuga @ 3000rpm per 5 minuti. Il mantenimento di tutti i reagenti in condizioni sterili e lavorare in un cappuccio colture di tessuti, risospendere progenitori miogenici in PBS, o progenitrici adipogenico in Matrigel (BD cat # 354234) a circa 10 6 cellule / ml. </li><li> Trapianto di progenitori miogenici o progenitrici adipogenico ai topi destinatario. <ol><li> Anestetizzare il mouse con isoflouran secondo la vostra politica istituzione. </li><li> Radersi i capelli intorno alla regione di iniezione, poi sterilizzare la pelle strofinando con etanolo al 70% </li><li> Iniettare 20μL dei progenitori miogenici o progenitori adipogenico (= 20k cellule) con un 3 / 10 siringa da insulina CC (cat BD # 309300). </li></ol></li><li> Dopo un tempo adeguato (tre settimane funziona bene, ma miofibre transgenici che esprimono i marcatori del donatore-derivati ​​sono di solito evidenti entro una settimana dopo il trapianto), anestetizzare i topi destinatario da passaggio 29 mediante iniezione intraperitoneale di 400 microlitri Avertin (Cat Sigma # T04840-2, 25 mg / ml), poi profumato transcardially con 50mL PBS (contiene 10 mM di EDTA) per primo, seguito da 15 ml del 4% PFA. Raccogliere tessuto bersaglio, post-fix con 4% PFA durante la notte, se necessario, poi il trasferimento al 20% di saccarosio durante la notte. Incorpora in ottobre, congelare e cryosection. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: MP quando vengono trapiantate nel muscolo scheletrico del mouse, che prontamente si fondono con pre-esistente miofibre. Pertanto, qualsiasi etichetta genetico presente nelle cellule del donatore sarà facilmente individuabile nelle fibre che li ha accolti. La figura 2 mostra un esempio in cui le cellule trapiantate espresso umane phostphatase alcalino, ha rivelato istochimicamente. AP quando vengono trapiantate il risultato dipende in larga misura l'ambiente del sito trapianto: quando queste cellule trapiantate per via sottocutanea dare origini a adipociti e miofibroblasti (vedi figura 2). In molti altri siti, compresi i muscoli, non sopravvivono a meno degenerazione grassa è stata indotta 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ordinamento strategia per l'isolamento delle popolazioni progenitrici dal muscolo scheletrico (A) strategia Ordinamento:. Cellule vitali sono state identificate sulla base di dispersione in avanti e side scatter. Colorazione Hoechst è stato utilizzato per escludere detriti anuclear e ioduro di propidio (PI) colorazione di escludere le cellule morte. Ematopoietiche (CD45) ed endoteliali (CD31), le cellule sono state escluse dalle porte di smistamento. Il α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - sottoinsieme contiene tutti i progenitori miogenici (MP). Il Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - popolazione contiene progenitori adipogenico (AP). (B) Fluorescenza-minus-one (FMO) controlla isotipo confermare la specificità della macchia. (C) Purezza controlli di sottoinsiemi MP e AP dopo l'ordinamento. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi seguenti MP e AP di trapianto. AP sono stati trapiantati per via sottocutanea (pannello superiore) e MP per via intramuscolare (pannello inferiore). In entrambi i casi, le cellule del donatore origine da un topo transgenico che esprime fosfatasi alcalina umano, identificato dalla colorazione marrone.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di trovare un equilibrio ragionevole tra alti rendimenti e alti vitalità delle cellule purificate. La fase più critica per garantire che le cellule sane sono state recuperate è, prevedibilmente, la dissociazione enzimatica del tessuto di partenza. Il trattamento del tessuto deve essere particolarmente delicato, che è difficile da dimostrare o apprezzare anche in un formato audiovisivo. Un altro fattore chiave è la durata della procedura. Più a lungo ci vuole per andare dal donatore al ricevente l&#39;animale, minore è la vitalità e, quindi, l&#39;efficienza attecchimento. In caso di domanda sulla vitalità che non è immediatamente risposto, cercando alla frequenza di eventi PI positivi nei campioni di cellule purificate dopo l&#39;ordinamento, si consiglia un test di diluizione limita a misurare clonogenicità viene eseguita 3. Sorta tipici muscolo danneggiato regolarmente resa di circa 1 in 15-20 cellule in grado di avviare colonie miogenici o fibro / adipogenico in vitro. Mentre praticamente del 100% delle colonie avviato da parlamentari contenere miotubi differenziati, solo circa un terzo delle colonie ottenute da FAP contenere adipociti oltre a miofibroblasti actina del muscolo liscio positivi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Collagenasi II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 U / ml </td></tr><tr><td> Collagenasi D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 U / ml </td></tr><tr><td> Spostare II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2,4 u / ml </td></tr><tr><td> cellula filtro </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 micron </td></tr><tr><td> Tubo con filtro cellulare </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 micron </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clone 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Fatto in casa </td><td></td><td> Clone I3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clone D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrina APC </td><td> Fatto in casa </td><td> Informarsi con Rossi laboratorio </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Muscolo scheletrico contiene popolazioni progenitore più di distinte origini embrionale e potenziale di sviluppo. Progenitori miogenici, di solito risiede in una &quot;posizione delle cellule satellite&quot; tra la membrana plasmatica miofibre e la laminina-ricchi membrana basale che ensheaths esso, sono auto-rinnovamento delle cellule che sono esclusivamente impegnati nel 1,2 lignaggio miogenico. Recentemente abbiamo descritto una seconda classe di progenitori nave associate in grado di generare e miofibroblasti adipociti bianchi, che risponde ai danni da entrare in modo efficace la proliferazione e fornisce supporto trofico per le cellule miogenici durante la rigenerazione dei tessuti 3,4. Uno dei test più affidabile per determinare il potenziale di sviluppo e rigenerazione di una popolazione di cellule dato si basa sul loro peso e il trapianto di 5-7. A tal fine abbiamo ottimizzato i protocolli per la loro purificazione mediante citometria di flusso dal muscolo dissociato enzimaticamente, che illustrerà in questo articolo. Le popolazioni ottenuti usando questo metodo contenere cellule colonia miogeniche o fibro / adipogenico formando: non altri tipi di cellule sono in grado di espandere in vitro o sopravvivere in consegna vivo. Tuttavia, quando queste popolazioni vengono utilizzati subito dopo l&#39;ordinamento per l&#39;analisi molecolare (ad es qRT-PCR) si deve tenere presente che i sottoinsiemi appena ordinati può contenere altre cellule agente inquinante che non hanno la capacità di formare colonie o engrafting destinatari.

Metodo per la dissociazione enzimatica, l&#39;etichettatura e la purificazione della superficie mediante citometria a flusso di fibro / adipogenico e progenitori miogenici da topo muscolo scheletrico.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Il muscolo scheletrico contiene molteplici popolazioni di progenitori di diverse origini embrionali e potenzialità di sviluppo. I progenitori miogenici, che solitamente risiedono...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare cellule progenitrici miogeniche e adipogeniche vitali da muscolo scheletrico simmetrico. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando il tessuto muscolare da topi sacrificati. Come secondo passaggio, il campione viene digerito enzimaticamente, dissociando così il tessuto in cellule singole.In seguito, la fluorescenza attivata dalla selezione cellulare o FACS viene utilizzata per isolare le cellule progenitrici. Si ottengono risultati che mostrano vitalità e differenziazione delle cellule isolate dopo il trapianto in topi riceventi, basati su colorazione istochimica per l'etichetta genetica, che in questo esempio è la fosfatasi alcalina umana. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche preesistenti come prepl è che le cellule possono essere isolate direttamente dall'animale in diversi punti temporali.Ad esempio, dopo aver indotto un danno tissutale, quando non vi è alcuna selezione sulla popolazione cellulare, è possibile analizzare la popolazione cellulare a livello molecolare per osservare le diverse fasi che le cellule attraversano durante il processo di rigenerazione in vivo. Pertanto, questa tecnica può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della rigenerazione tissutale, in particolare quale ruolo svolge ciascun tipo cellulare durante la rigenerazione in vivo e come questi tipi cellulari interagiscono tra loro per ricostruire un tessuto sano. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di malattie come la distrofia muscolare.Dallo studio di questi progenitori potrebbero alla fine derivare strategie rigenerative per questo tipo di malattie. Inoltre, le implicazioni di questa tecnica si estendono a numerosi altri tessuti, dal cuore al tessuto adiposo, poiché almeno i progenitori fibro-adipogenici sono stati ritrovati in ogni singolo tessuto finora analizzato. In generale, i principianti incontreranno difficoltà perché tecniche di dissociazione troppo aggressive ridurranno la vitalità cellulare e produrranno troppi detriti, che successivamente interferiranno con la separazione pulita delle cellule.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo deciso di applicare la citometria a flusso, solitamente utilizzata per cellule APOE, allo studio delle cellule staminali nei tessuti solidi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante poiché i passaggi di dissociazione del tessuto sono difficili da apprendere, essendo molto complessi da descrivere in modo adeguato. A dimostrare la tecnica oggi sarà linky, un assistente di ricerca del mio laboratorio che per primo ha sviluppato e ottimizzato la procedura. Per questa procedura sono necessari almeno due topi.Un topo viene utilizzato per fornire le necessarie controlli monocromatici e di isotipo degli anticorpi per i fatti, mentre l'altro fornirà il campione da ordinare. Per iniziare, procurarsi topi di età compresa tra sette e dodici settimane che siano stati precedentemente sottoposti a eutanasia in una cappa sterile. Posizionare il topo eutanasizzato su un tovagliolo di carta sterile, a pancia in su, e spruzzare accuratamente il pelo con etanolo al 70% per prevenire contaminazioni, tenendo una pinza in una mano e delle forbici affilate nell'altra.Sollevare la pelle nella regione addominale ed effettuare una piccola incisione longitudinale. Afferrare la pelle su ciascun lato dell'incisione e staccarla per esporre completamente i muscoli dell'arto posteriore. Successivamente, asportare il tessuto muscolare inserendo le forbici chiuse al di sotto del muscolo e al di sopra della tibia, quindi aprendo le forbici.Il bordo posteriore delle lame forzerà delicatamente la separazione del muscolo dalla tibia. Ripetere l'operazione su entrambi i lati della tibia e posizionare il tessuto in una piastra di Petri da 60 millimetri. Ora escindere il tessuto muscolare dal femore nello stesso modo e aggiungere il tessuto alla piastra di Petri.Ripetere per ogni topo utilizzando una piastra di Petri per ogni animale. Successivamente, dissociare il tessuto in singole cellule. Aggiungere due millilitri o 1000 unità di collagenasi, due e 20 microlitri di soluzione madre di cloruro di calcio 250 millimolari a ciascuna piastra di Petri contenente tessuto muscolare.Quindi procedere rapidamente e con attenzione. Utilizzare due pinzette grigie, una zigrinata e una con due denti, per strappare il tessuto in pezzi di un millimetro cubo. Rimuovere e scartare la maggior quantità possibile di tessuto non muscolare.Coprire le piastre di Petri e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, recuperare le piastre e riportarle nella cappa da laboratorio sterile. Rimuovere lo stantuffo da una siringa da tre millilitri ed utilizzarlo per frantumare il tessuto.Utilizzare un pistillo per ogni piastra per evitare contaminazioni incrociate. Aggiungere circa cinque millilitri di PBS freddo e sterile in ciascun piatto di Petri e trasferire il contenuto del piatto in un tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare con ulteriori cinque millilitri di PBS per recuperare tutti i tessuti e aggiungerli al tubo conico.Lavare e centrifugare i campioni tre volte secondo il protocollo. Successivamente, aggiungere un millilitro di una soluzione composta da collagenasi D dys spazio due e cloruro di calcio in ogni provetta e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per un'ora. Al termine dell'incubazione, aggiungere cinque millilitri di PBS freddo e sterile nelle provette, vortexare brevemente le provette e tritare più volte per dissociare gli aggregati.Riempire le provette con PBS, mescolare bene e porre sul ghiaccio. Per rimuovere eventuali frammenti residui di tessuto, posizionare un filtro cellulare da 40 micron su una provetta conica da 50 millilitri posta sul ghiaccio e filtrare la sospensione cellulare. Dividere il flusso in parti uguali in tre provette coniche da 50 millilitri contenenti PBS freddo e sterile e centrifugare a 1600 giri/min per cinque minuti a otto gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante e porre le cellule sul ghiaccio per la colorazione e il sorting delle cellule progenitrici miogeniche e adipogeniche.Per prima cosa, preparare i sei controlli misti di colorazione singola a colori secondo il protocollo scritto allegato. Questi controlli includono il controllo senza colorazione, il colorante hulk, ioduro di propidio, gli anticorpi marcati con FSE per CD31 e CD45, l'anticorpo marcato con SC one P size seven e l'anticorpo marcato con alpha seven A PC. Successivamente, preparare le tre miscele di controllo per l'isotipo degli anticorpi seguendo il protocollo scritto.Dopo aver preparato le miscele di colorazione, etichettare nove provette einor da 1,5 millilitro per i campioni monocromatici e i controlli isotipici. Ri-sospendere e combinare le cellule provenienti dalle tre provette coniche in un volume totale di un millilitro di buffer fax. Successivamente, distribuire 100 microlitri di cellule in ciascuna provetta einor etichettata come controllo e aggiungere da cinque a dieci microlitri delle miscele di colorazione, a seconda della concentrazione degli anticorpi, nelle rispettive provette di controllo.Risospendere le cellule del topo campione in 200 microlitri di tampone fax e combinare in uno dei tubi conici da 50 millilitri. Quindi aggiungere 800 microlitri del cocktail di anticorpi. Mescolare ciascuno dei tubi di controllo e dei tubi campione.Incubare bene i campioni sul ghiaccio per un'ora. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule aggiungendo un millilitro di buffer fax a ciascuna delle nove provette di controllo e circa 20 millilitri di buffer fax alla provetta del campione. Centrifugare le provette di controllo einor a 3000 RPM per cinque minuti.Centrifugare il campione nel tubo conico a 1600 giri/min per cinque minuti. Quindi aspirare e scartare il soprannatante dopo la centrifugazione. Risospendere le cellule di controllo in ciascun tubo eppendorf con un millilitro di tampone fax e risospendere le cellule del campione in quattro millilitri di tampone fax.Aggiungere ioduro di propidio alle cellule del campione, ai controlli isotipici e al controllo monocromatico del pi. Pipettare le cellule in provette per citofluorimetria attraverso il cappuccio con filtro cellulare per rimuovere eventuali aggregati residui che potrebbero influenzare il citometro.Impostare lo strumento di citofluorimetria con un colore singolo e controlli isotipici. Separare le cellule del campione seguendo il protocollo scritto allegato e raccogliere ogni popolazione separatamente. Utilizzare una provetta da raccolta da 3,5 millilitri. I progenitori miogenici vitali costituiscono la popolazione che è FSC alta e positiva per alfa sette integrina, mentre è negativa per PI, CD31, FE, CD45, FE e Sca.Un singolo progenitore adipogenico negativo di dimensione PE sette viene isolato e risulta positivo per PE di dimensione sette e per pi CD31 FE CD45 FE e alfa sette a PC negativo. Un singolo topo wild type può fornire circa 1 × 10⁵ progenitori adipogenici e da 1,5 a 2 × 10⁵ progenitori miogenici con una vitalità superiore al 95%.Per preparare le cellule per il trapianto in topi ospiti, si lavano le cellule. Centrifugare innanzitutto le cellule alterate a 1500 RPM per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferirle in provette einor.Centrifugare i tubi a 3000 giri/min per cinque minuti ed eliminare il soprannatante. Successivamente, risospendere i progenitori miogenici in PBS o i progenitori adipogenici in matrigel a circa 10⁶ cellule per millilitro. Dopo aver preparato i topi ospiti anestetizzati per ciascun tipo di cellula donatrice, secondo il protocollo scritto, utilizzare una siringa per insulina da 0,3 cm³ per iniettare 20 microlitri, corrispondenti a circa 20.000 cellule di progenitori miogenici o adipogenici.Attendere il tempo appropriato affinché le cellule trapiantate si differenzino, generalmente circa tre settimane. Quindi isolare il tessuto bersaglio e prepararlo per la criosezione come descritto nel protocollo in questa figura, la strategia di selezione viene dimostrata per isolare i progenitori adipogenici e miogenici; le cellule vitali sono state identificate in base allo scatter anteriore e laterale; la colorazione con hawk è stata utilizzata per escludere i detriti nucleari e la colorazione con ioduro di propidio o PI è stata utilizzata per escludere le cellule morte; le cellule ematopoietiche e le cellule endoteliali, o rispettivamente le cellule CD45 e CD31, sono state quindi escluse dai gate di selezione. Infine, il sottoinsieme positivo per alfa sette.SKA uno negativo contiene tutti i progenitori miogenici e la popolazione che è negativa per alfa sette. SKA uno positivo contiene tutti i progenitori adipogenici; i controlli di fluorescenza meno uno con isotipo confermano la specificità della colorazione. Inoltre, sono stati eseguiti controlli di purezza sui sottoinsiemi adipogenici e miogenici.Dopo il sorting in questo esempio rappresentativo, le cellule donatrici progenitrici adipogeniche che esprimono la fosfatasi alcalina umana transgenica, iniettate per via sottocutanea, possono essere identificate nel tessuto dell'ospite mediante istochimica, come indicato dalla colorazione bruna. Le cellule donatrici progenitrici miogeniche che esprimono la fosfatasi alcalina umana transgenica, iniettate per via intramuscolare, sono state identificate in questa sezione di tessuto, come mostrato in marrone.Utilizzando l'istochimica, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se svolta correttamente. Se si stanno processando più campioni, il tempo aumenterà. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente e con delicatezza.Pertanto, evitare di processare troppi campioni contemporaneamente. Prolungare il tempo di lavorazione ridurrà notevolmente la variabilit&agrave; cellulare a seguito di questa procedura. Altri metodi, come l'analisi dell'espressione di colono SC OG mediante R-T-P-C-R quantitativo, possono essere eseguiti anche per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: come rispondono queste cellule progenitrici al danno in vivo dopo il loro sviluppo?Questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo della rigenerazione dei tessuti, permettendo di esplorare la comunicazione tra le cellule progenitrici nei tessuti danneggiati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe acquisire una buona comprensione di come dissociare questi tessuti senza provocare danni. Le cellule progenitrici vengono identificate sulla base dei loro marcatori superficiali e viene analizzato il loro potenziale di sviluppo in vivo.Grazie per aver guardato. In bocca al lupo per il vostro esperimento.

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