L'interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di abbattere l'espressione genica endogena iniettando embrioni di drosophila con RNA a doppio filamento per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi. Ciò si ottiene raccogliendo e allineando prima gli embrioni in linea retta. Successivamente, gli aghi vengono preparati e utilizzati per iniettare l'RNA a doppio filamento negli embrioni.

Infine, gli embrioni vengono posti in una camera umida per svilupparsi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano difetti nella fusione del ramo tracheale della drosophila attraverso la colorazione degli anticorpi di embrioni in stadio avanzato o osservando le larve al microscopio a campo chiaro. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come lo screening genetico in avanti per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi è che si tratta di un approccio genetico inverso relativamente semplice e rapido per analizzare le funzioni geniche prima che un mutante sia disponibile per quel gene.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come l'identificazione dei geni critici necessari per lo sviluppo del sistema tracheale D. Questo è un modello eccellente per studiare la morfogenesi degli organi dei mammiferi come le vie aeree dei vertebrati, il sistema circolatorio, i dotti renali e l'epitelio esplorativo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci vuole tempo per imparare metodi come allineare gli embrioni, rompere gli aghi e iniettare RNA a filamento negli embrioni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi che coinvolgono la quantità di doppio filamento. L'RNA iniettato varia tra gli embrioni e la dimostrazione scritta dell'aspetto degli embrioni sinciziali e blastodermici può essere difficile. Questi passaggi sono difficili da imparare perché l'iniezione di quantità adeguate di RNA a doppio filamento in embrioni di blasto sinciziale è un passaggio fondamentale per abbattere efficacemente l'espressione dei geni endogeni.

Per iniziare, allestisci gabbie a 25 gradi Celsius utilizzando mosche da due a quattro giorni W 1, 1, 1, 8, cambia le piastre del succo d'uva ogni ora durante il giorno per sincronizzare la raccolta delle uova in un periodo di uno o due giorni. Prima della raccolta. Raccogli embrioni di syn city o blaster derm per un'ora a 25 gradi Celsius, un pezzo rettangolare di agar di succo d'uva, quindi taglia leggermente una linea al centro dell'agar con la lama del rasoio.

Utilizzare una sonda metallica per trasferire gli embrioni dalla piastra del succo d'uva al pezzo di succo d'uva. Agar. Allinea circa 50 embrioni in linea retta con gli embrioni, gli assi più lunghi con un angolo di 45 gradi rispetto alla linea al centro dell'agar. Assicurati che tutti gli embrioni puntino nella stessa direzione con le estremità posteriori rivolte lontano dalla linea.

Taglia un pezzo rettangolare di nastro biadesivo e incollalo su un vetrino coprioggetti di 18 x 18 millimetri. Raccogli gli embrioni usando il nastro adesivo sul foglietto di presentazione. Posizionare il vetrino coprioggetto su un vetrino.

Premere leggermente gli embrioni sul nastro biadesivo e lasciare asciugare gli embrioni all'aria per circa 10 minuti. Coprire gli embrioni con un sottile strato di olio di carbonio 700 halo. Attendi circa 10 minuti fino a quando gli embrioni sono chiari al microscopio.

Gli aghi vengono preparati per la microiniezione tirando tubi capillari di vetro. Nelle impostazioni del programma utilizziamo un estrattore per aghi di World Precision Instruments. Calore uno, ritardare quattro indietro.

Caricare l'ago con due microlitri di RNA a doppio filamento utilizzando una pipetta Einor P 20 con punte einor micro loader. Prepara un vetrino con sopra un vetrino coprioggetto pulito e fissali insieme. Portare l'ago riempito contro il bordo del vetrino coprioggetto, creando una punta acuminata.

L'RNA a doppio filamento fuoriesce dalla punta dell'ago. Quando si preme il pedale della pompa pico, preparare uno scivolo con una goccia d'olio al centro. Inserire l'ago nella goccia d'olio.

Regolare l'impostazione sulla pompa pico per espellere da 100 a 200 picolitri di RNA a doppio filamento quando si preme il pedale. Doppio filamento. L'RNA può essere visto come una piccola posizione di goccioline.

La punta dell'ago nella parte posteriore del primo embrione preme il pedale della pompa pico. L'RNA a doppio filamento apparirà come un piccolo. nel sito di iniezione.

Termina l'iniezione di RNA a doppio filamento negli embrioni sul vetrino. Uccidi tutti gli embrioni dermici non blaster. Posizionare il vetrino coprioggetto in una camera umida coperta, come una capsula di Petri di plastica a 18 gradi Celsius fino a quando gli embrioni non si sono sviluppati fino allo stadio embrionale o larvale desiderato.

Per gli embrioni che si sono sviluppati fino allo stadio embrionale desiderato, utilizzare una sonda per rimuovere gli embrioni dal nastro biadesivo e spingerli fino al bordo del vetrino coprioggetto. Lavare gli embrioni con eptano in una fiala di raccolta con rete di nylon sul fondo. Lavare gli embrioni tre volte con PB tating in candeggina al 50% per cinque minuti e lavare nuovamente gli embrioni tre volte con PBT.

Trasferire gli embrioni dalla fiala di raccolta in un pezzo di rete di nylon utilizzando una pipetta, immergere il pezzo di rete di nylon nella soluzione fissativa. Fissare gli embrioni per 30 minuti. Rimuovere lo strato inferiore della soluzione fissativa.

Quindi izzarli con metanolo, gli embrioni vengono trasferiti in una provetta Eppendorf e immunocolorati con due anticorpi A 12 e di diffusione, utilizzando protocolli standard di colorazione degli anticorpi per gli embrioni che si sono sviluppati fino allo stadio larvale desiderato. Prepara un vetrino con una goccia di carbonio halo, 700 olio al centro e due piccoli vetrini coprioggetti su ciascun lato della goccia d'olio. Trasferire una larva sul vetrino e poi applicare un vetrino coprioggetti sopra la goccia d'olio.

Osserva le larve al microscopio a campo chiaro. Risultati rappresentativi sia dell'RNA a doppio filamento di diffusione che del GFP a doppio filamento. L'iniezione di RNA è mostrata qui.

GFP a doppio filamento. Gli embrioni iniettati con RNA mostrano una normale fusione tracheale e la proteina di diffusione è presente nelle cellule di fusione. Le frecce indicano le celle di fusione positiva della diffusione laterale del tronco e l'asterisco indica la posizione della fusione normale.

Tuttavia, gli embrioni iniettati con RNA a doppio filamento di diffusione mostrano una fusione di branca fallita e le proteine di diffusione non sono presenti nelle cellule di fusione. Il triangolo indica il sito della fusione dei rami fallita quando gli embrioni iniettati con RNA a doppio filamento si sono sviluppati fino allo stadio larvale. Le larve G-F-P-R-N AI mostrano una normale fusione dei rami tracheali indicata da un asterisco.

D'altra parte, le larve di diffusione RN AI hanno dimostrato una fusione di rami fallita indicata da triangoli. Questi risultati mostrano l'effetto del knockdown dell'espressione genica di diffusione endogena mediante iniezione di RNA a doppio filamento in embrioni di drosophila. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di uccidere tutti gli embrioni enseal blaster dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare la funzione di nuovi geni per lo sviluppo degli organi nella drosofila. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come abbattere i geni endogeni iniettando RNA a doppio filamento negli embrioni di drosophila.