Name: Linterferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara a silenziare l'espressione genica in embrioni di Drosophila mediante iniezione di dsRNA. Questo metodo rapido permette di identificare geni essenziali per lo sviluppo tracheale e altri organi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare Stefano per Crews dysfusion cDNA, anticorpi Dys e w le mosche 1118.

1. Raccolta degli embrioni <ol><li> Impostare gabbie a 25 ° C con 2-4 giorni di età w 1118 piastre succo flies.Grape vengono cambiati ogni ora durante il giorno per sincronizzare la raccolta delle uova in 1-2 giorni prima del periodo di raccolta </li><li> Raccogliere embrioni per 1 ora a 25 ° C </li><li> Tagliare un pezzo rettangolare di agar succo d'uva, tagliate leggermente al centro con una lama di rasoio, lasciare una riga nel agar </li><li> Utilizzare una sonda di metallo per il trasferimento degli embrioni da piastra succo d'uva al vostro pezzo di agar succo d'uva, li allineano in linea retta con l'asse più dell'embrione a 45 gradi con la linea in mezzo l'agar. Ottenere una retta di circa 50 embrioni. Assicurarsi che tutti gli embrioni punto nella stessa direzione, con estremità posteriore che punta lontano dalla linea. </li><li> Tagliare un pezzo rettangolare di nastro doppio bastone, e posizionarlo di una scivolata copertura 18x18mm. </li><li> Pick up embrioni con nastro doppio bastone sul vetrino </li><li> Mettere il vetrino di un vetrino, asciugare l'embrione in aria per circa 10 min. </li><li> Coprire l'embrione con un sottile strato di 700 Halocarbon, ora è pronto per l'iniezione. </li></ol> 2. Tirare Needle Fai aghi microiniezione tirando tubi di vetro capillari. Noi utilizziamo un estrattore ago dal Instrument mondiale di precisione (modello PUL-1). Le specifiche estrattore programma aghi sono: calore: 1, ritardo di 4. 3. Riempimento del Needles Back-carico aghi utilizzando la pipetta Eppendorf p20 dotato di Eppendorf punte Microloader, normalmente carico 1,5-2 dsRNA microlitri 4. Break the Needles <ol><li> Prima di rompere l'ago, inserire un vetrino in una diapositiva. </li><li> Preparare un vetrino con una goccia di olio al centro della diapositiva </li><li> Accendere il III Picospritzer picopump per regolare la pressione dell'aria </li><li> Rompere l'ago riempito contro il bordo di un vetrino, la creazione di una punta aguzza. </li><li> Quando la punta è rotto, passo sul pedale del Picospritzer III picopump, alcuni dsRNA sarà fuoriuscire dalla punta dell'ago. </li><li> Estrarre il vetrino con il coprioggetto. </li><li> Inserire l'ago sotto la goccia di olio al centro della diapositiva preparato prima. </li><li> Regolare l'impostazione del III Picospritzer picopump per ottenere 100-200PL dsRNA quando fate un passo sul pedale. dsRNA può essere visto come una piccola goccia. </li></ol> 5. Iniezione <ol><li> Portare la punta dell'ago alla parte posteriore dell 'embrione Blastoderm prima nello stesso piano focale e iniettare l'embrione fuori centro del 30-50% lunghezza d'uovo. </li><li> Dopo passo sul pedale del III Picospritzer picopump, una piccola quantità di dsRNA apparirà come un puntino nel sito di iniezione. </li></ol> 6. Analisi fenotipica <ol><li> Dopo l'iniezione, collocare il vetrino in una camera coperta umida (plastica Petri) a 18 ° C fino a quando gli embrioni sviluppano allo stadio embrionale desiderato. </li><li> Utilizzare la sonda per rimuovere gli embrioni dal nastro biadesivo e spingerli verso il bordo dello slip di copertura. Lavare gli embrioni fuori dalla diapositiva in un flaconcino di raccolta con rete di nylon sul fondo utilizzando eptano, lavare 3 volte con PBT. Embrioni Dechorionate nel 50% di candeggina per 5 minuti, e lavare 3 volte con PBT. Trasferimento degli embrioni dal flacone collezione ad un pezzo di rete di nylon, e poi immergere la rete di nylon nella soluzione di fissativo (5 ml eptano, 4,5 ml di PBS, 0,5 ml di formaldeide 37%) per rilasciare embrioni. Fissare gli embrioni nella soluzione fissante per 30min. Devitellinize embrioni con metanolo, il trasferimento di embrioni per una provetta Eppendorf, e immunostain gli embrioni utilizzando protocolli standard. </li><li> Gli embrioni possono anche sviluppare appropriarsi stadio larvale. </li><li> Preparare un vetrino con una goccia di olio Halocarbon 700 nel mezzo </li><li> Trasferire una larve alla diapositiva, mettere un vetrino in cima </li><li> Osservare le larve al microscopio in campo chiaro. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Un esempio di dsRNA abbattere dysfusion (dis) gene in embrione Drosophlia è mostrato in Fig. 1. GFP-dsRNA embrioni iniettati sono il controllo negativo. Disfunzione è un fattore di trascrizione bHLH PAS espressi nelle cellule fusione tracheale. GFP-dsRNA embrioni iniettati mostrano normale fusione tracheale, e proteine ​​Dys è presente nelle cellule di fusione (Figura 1A). D'altra parte, disfunzioni dsRNA embrioni iniettati mostrano fusione ramo fallito, e le proteine ​​Dys non sono presenti nelle cellule di fusione (Figura 1B). Quando dsRNA iniettato embrioni si sviluppano allo stadio larvale, la disfunzione dsRNA larve iniettate hanno mostrato la fusione ramo fallito (Fig.1D) rispetto al GFP-dsRNA controllo iniettato negativo (Figura 1C). Questi risultati hanno dimostrato efficace abbattere di espressione genica endogena disfunzioni da dsRNA iniezione in embrioni di Drosophila <img src="/files/ftp_upload/2477/2477fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rimozione della funzione di disfunzioni da disfunzione RNAi rivela tracheale fusione defects. Embrioni Blastoderm (w 1118) sono stati iniettati sia con GFP-dsRNA (controllo negativo) o disfunzioni dsRNA e analizzati per difetti tracheale. (A) Fase 16 embrioni iniettati con GFP-dsRNA e colorati con α-Dys e MAb 2A12 che macchia il lume tracheale. Prominente mostrata è il tronco laterale, che ha fuso. Le frecce indicano laterale tronco Dys cellule positive fusione. (B) Fase 16 embrioni iniettati con disfunzione dsRNA e colorati con α-Dys e MAb 2A12. L'embrione ha mostrato una mancanza di fusione tronco laterale (l'asterisco indica la posizione normale di un tronco di fusione laterale in embrioni di controllo). Nessun Dys cellule positive sono state osservate, indicando che la disfunzione RNA effettivamente abolito proteina Dys. (Da C a D) di secondo instar larve sia con GFP-dsRNA o disfunzione dsRNA sono stati esaminati dal campo chiaro microscopia per difetti tracheale. (C) Siti di fusione sono contrassegnati da un asterisco GFP-dsRNA larve controllo iniettato. (D) Il tronco laterale non è riuscito a fondere nel dys-RNA larve iniettate, (*) indica la posizione normale di una fusione tronco laterale.

<ol><li>St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-219 (1992).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Misquitta, L., Paterson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+gene+function+in+Drosophila+by+RNA+interference+%28RNA-i%29%3A+a+role+for+nautilus+in+embryonic+somatic+muscle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).</li>
<li>Horowitz, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis.</a> Circ. Res. 103, 784-795 (2008).</li>
<li>Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis%3A+molecular+mechanisms+of+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).</li>
<li>Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfusion+transcriptional+control+of+Drosophila+tracheal+migration%2C+adhesion%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+dysfusion+basic+helix-loop-helix+%28bHLH%29-PAS+gene+controls+tracheal+fusion+and+levels+of+the+trachealess+bHLH-PAS+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;attuale metodo di iniezione di dsRNA consente qui una analisi molto sensibile e rapida della funzione del gene nello sviluppo di Drosophila tracheale. Questo metodo può potenzialmente essere applicato per analizzare la funzione del gene per altri tessuti e lo sviluppo degli organi.

<table><tbody><tr><td>Olio alogenato 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Pompata picopompa Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>21170M</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;interferenza di rnai per iniezione in dsrna drosophila embrioni

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Screening genetico è uno dei metodi più potenti disponibili per ottenere intuizioni complesso processo biologico 1. Nel corso degli anni molti miglioramenti e strumenti per la manipolazione genetica si sono resi disponibili in Drosophila 2. Subito dopo la scoperta iniziale Frie e Mello 3 che doppio filamento di RNA possono essere utilizzate per knockdown l&#39;attività di singoli geni in Caenorhabditis elegans, è stato mostrato interferenza dell&#39;RNA (RNAi) per fornire un potente approccio inverso genetico di analizzare le funzioni del gene nello sviluppo di Drosophila organo 4, 5. Molti organi, compreso il polmone, rene, fegato e sistema vascolare, sono composti da tubolari ramificate reti di trasporto che i fluidi vitali o gas 6, 7. L&#39;analisi della formazione di Drosophila tracheale fornisce un ottimo sistema modello per studiare la morfogenesi degli altri organi tubolari 8. The Berkeley Drosophila Genome Project ha rivelato centinaia di geni che si esprimono nel sistema tracheale. Per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della formazione del tubo, la sfida è comprendere il ruolo di questi geni nello sviluppo tracheale. Qui, abbiamo descritto un metodo dettagliato di dsRNA iniezione in embrione di Drosophila espressione genica knockdown individuali. Siamo riusciti abbattuto endogeno dysfusion (dis) espressione genica mediante iniezione dsRNA. Disfunzione è un bHLH-PAS proteina espressa nelle cellule fusione tracheali, ed è necessario per la fusione ramo tracheale 9, 10. disfunzione RNAi completamente eliminato espressione disfunzioni e ha portato in difetto di fusione tracheale. Questo metodo relativamente semplice fornisce uno strumento per identificare i geni requried per tissure e lo sviluppo degli organi in Drosophila.

RNA interference è stato dimostrato molto efficace per analizzare la funzione del gene in<em&gt; Drosophila</emSviluppo&gt; tracheale. Un protocollo dettagliato utilizzato da Jiang laboratorio di iniettare dsRNA in embrioni di volare a knockdown espressione genica è illustrato. Questa tecnica ha il potenziale per lo screening dei geni necessari per lo sviluppo di tessuti e organi in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Lo screening genetico è uno dei metodi più potenti a disposizione per acquisire conoscenze sui processi biologici complessi 1. Nel corso degli anni, numerosi miglioramenti ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ridurre l'espressione genica endogena iniettando RNA a doppio filamento in embrioni di drosophila per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo e allineando gli embrioni in una linea retta. Successivamente, vengono preparate delle micropipette che vengono utilizzate per iniettare l'RNA a doppio filamento negli embrioni.Infine, gli embrioni vengono collocati in una camera umida per lo sviluppo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano difetti nella fusione dei rami tracheali di *Drosophila* mediante colorazione con anticorpi su embrioni in stadio avanzato, oppure osservando le larve al microscopio in campo chiaro. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo schermo genetico diretto per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi, è che si tratta di un approccio genetico inverso relativamente semplice e rapido per analizzare le funzioni geniche prima che sia disponibile un mutante per quel gene.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo,

rnai-interference-by-dsrna-injection-into-drosophila-embryos

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un metodo per identificare i regolatori sensibilizzati postembrionale di espressione proteica e la localizzazione...

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d'alimentazione.

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

L'interferenza dell'RNA è una tecnica potente e ampiamente applicabile per manipolare l'espressione genica in fasi di sviluppo specifiche. Qui, descriviamo i passaggi necessari per l'implementazione di questa tecnica nel coleottero subacqueo acquatico Thermonectus marmoratus, dall'acquisizione di sequenze geniche al knockdown di geni che influenzano la struttura o il comportamento.

Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Impara a silenziare l'espressione genica in embrioni di Drosophila mediante iniezione di dsRNA. Questo metodo rapido permette di identificare geni essenziali per lo sviluppo tracheale e altri organi.

L'interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Esplora altri video