L'interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ridurre l'espressione genica endogena iniettando RNA a doppio filamento in embrioni di drosophila per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo e allineando gli embrioni in una linea retta. Successivamente, vengono preparate delle micropipette che vengono utilizzate per iniettare l'RNA a doppio filamento negli embrioni.

Infine, gli embrioni vengono collocati in una camera umida per lo sviluppo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano difetti nella fusione dei rami tracheali di *Drosophila* mediante colorazione con anticorpi su embrioni in stadio avanzato, oppure osservando le larve al microscopio in campo chiaro. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo schermo genetico diretto per identificare i geni necessari per lo sviluppo degli organi, è che si tratta di un approccio genetico inverso relativamente semplice e rapido per analizzare le funzioni geniche prima che sia disponibile un mutante per quel gene.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come l'identificazione di geni essenziali necessari per lo sviluppo del sistema tracheale di D. Si tratta di un ottimo modello per studiare la morfogenesi di organi mammiferi come le vie aeree dei vertebrati, il sistema circolatorio, i dotti renali e l'epitelio esplorativo. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà, poiché richiede tempo per apprendere tecniche come l'allineamento degli embrioni, la rottura degli aghi e l'iniezione di RNA a filamento singolo negli embrioni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi che riguardano la quantità di RNA a doppio filamento iniettata variano da embrione a embrione e una descrizione scritta dell'aspetto degli embrioni sinciziali e del blastoderma può risultare difficile. Questi passaggi sono difficili da apprendere perché iniettare quantità adeguate di RNA a doppio filamento negli embrioni sinciziali al blastoderma è un passaggio cruciale per ridurre efficacemente l'espressione dei geni endogeni.

Per iniziare, allestire gabbie a 25 gradi Celsius utilizzando moscerini W 1 1 1 8 di due-quattro giorni di età, cambiando le piastre di succo d'uva ogni ora durante il giorno per sincronizzare la raccolta delle uova in un periodo di uno-due giorni. Prima della raccolta, raccogliere embrioni di syn city o blaster derm per un'ora a 25 gradi Celsius; quindi prendere un pezzo rettangolare di agar al succo d'uva e praticare leggermente un solco al centro dell'agar con la lametta.

Utilizzare una sonda metallica per trasferire gli embrioni dalla piastra di succo d'uva al pezzo di succo d'uva. Agar. Allineare circa 50 embrioni in una linea retta, con gli assi longitudinali degli embrioni a un angolo di 45 gradi rispetto alla linea al centro dell'agar. Assicurarsi che tutti gli embrioni siano orientati nella stessa direzione, con le estremità posteriori rivolte lontano dalla linea.

Tagliare un pezzo rettangolare di nastro adesivo doppia faccia e attaccarlo su un coprioggetto di 18 per 18 millimetri. Raccogliere gli embrioni utilizzando il nastro sul coprioggetto. Posizionare il coprioggetto su un vetrino.

Premere leggermente gli embrioni sul nastro adesivo doppiofaccia e lasciarli asciugare all'aria per circa 10 minuti. Coprire gli embrioni con uno strato sottile di olio di carbonio 700 halo. Attendere circa 10 minuti finché gli embrioni non risultino chiari al microscopio.

Gli aghi vengono preparati per la microiniezione tirando tubi capillari di vetro. Utilizziamo un estrattore di aghi della World Precision Instruments con le impostazioni del programma: riscaldamento uno, ritardo quattro, indietro.

Caricare l'ago con due microlitri di RNA a doppio filamento utilizzando una pipetta Einor P 20 con punte micro loader einor. Preparare un vetrino con un cover slip pulito posizionato sopra e fissarli insieme con del nastro adesivo. Appoggiare l'ago riempito contro il bordo del cover slip, creando una punta affilata.

L'RNA a doppio filamento fuoriesce dalla punta dell'ago. Quando si preme il pedale del pompa pico, preparare un vetrino con una goccia di olio al centro. Inserire l'ago nella goccia di olio.

Regolare l'impostazione della pompa pico per espellere da 100 a 200 picolitri di RNA a doppio filamento quando si preme il pedale. L'RNA a doppio filamento può essere visto come una piccola goccia posizionata.

La punta dell'ago nella porzione posteriore del primo embrione preme il pedale del pico pompa. L'RNA a doppio filamento apparirà come un piccolo rigonfiamento nel sito di iniezione.

Terminare l'iniezione di RNA a doppio filamento negli embrioni sul vetrino. Eliminare tutti gli embrioni non derivanti da blaster derm. Posizionare il coprioggetto in una camera umida coperta, ad esempio una piastra di Petri di plastica, a 18 gradi Celsius fino a quando gli embrioni non avranno raggiunto lo stadio embrionale o larvale desiderato.

Per gli embrioni che hanno raggiunto lo stadio embrionale desiderato, utilizzare una sonda per rimuoverli dal nastro adesivo doppiofaccia e spingerli verso il bordo del coprioggetto. Lavare gli embrioni con eptano in un vial di raccolta provvisto di una rete in nylon sul fondo. Lavare gli embrioni tre volte con PBT, immergendoli per cinque minuti in una soluzione di candeggina al 50%, quindi lavarli nuovamente tre volte con PBT.

Trasferire gli embrioni dal vial di raccolta a un pezzo di rete in nylon utilizzando una pipetta; immergere il pezzo di rete in nylon nella soluzione fissativa. Fissare gli embrioni per 30 minuti. Rimuovere lo strato inferiore della soluzione fissativa.

Quindi fissare gli embrioni con metanolo, trasferirli in una provetta eppendorf e sottoporli a immunomarcatura con due anticorpi A 12 e anticorpi anti-diffusione, utilizzando protocolli standard di marcatura con anticorpi per embrioni sviluppati allo stadio larvale desiderato. Preparare un vetrino con una goccia di olio al carbonio alogenato 700 al centro e due piccoli coprioggetti posti ai lati della goccia d'olio. Trasferire una larva sul vetrino, quindi applicare un coprioggetto sopra la goccia d'olio.

Osservare le larve al microscopio in campo chiaro. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi sia della diffusione dell'RNA a doppio filamento sia dell'iniezione di RNA a doppio filamento GFP.

Embrioni a doppio filamento di RNA di GFP iniettati mostrano una normale fusione tracheale e la proteina di diffusione è presente nelle cellule di fusione. Le frecce indicano le cellule di fusione positive alla diffusione del tronco laterale e l'asterisco indica la posizione della fusione normale.

Tuttavia, negli embrioni iniettati con RNA a doppio filamento si osserva un fallimento della fusione dei rami e le proteine di diffusione non sono presenti nelle cellule di fusione. Il triangolo indica il sito di fallimento della fusione dei rami quando gli embrioni iniettati con RNA a doppio filamento si sviluppano fino allo stadio larvale. Le larve G-F-P-R-N AI mostrano una normale fusione dei rami tracheali, indicata dall'asterisco.

D'altra parte, le larve RN AI di diffusion hanno dimostrato un fallimento nella fusione dei rami, indicato dai triangoli. Questi risultati mostrano l'effetto dell'abbattimento dell'espressione genica endogena di diffusion mediante iniezione di RNA a doppio filamento in embrioni di drosophila. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eliminare tutti gli embrioni enseal blaster al termine del loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo, permettendo di esplorare la funzione di geni novelli nello sviluppo degli organi in drosophila. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come silenziare geni endogeni mediante l'iniezione di RNA a doppio filamento in embrioni di drosophila.