Name: Proteine localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Scopri la localizzazione proteica in neurosfere 3D di cellule staminali neurali ippocampali postnatali. Questo metodo combina immunomarcatura e ricostruzione tridimensionale per studiare l'organizzazione spaziale delle proteine.

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Ringraziamo Evan Dysart e Marc Léonard per l&#39;assistenza tecnico esperto in produzione e l&#39;editing video, Matt Cooke per l&#39;assistenza nella raccolta dei dati, e Sarah Gelbard per l&#39;assistenza editoriale esperti. L&#39;opera è stata finanziata da sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) a SALB, un&#39;iniziativa di formazione strategica nel programma di sovvenzioni Health Research di SALB e SF (Programma di Formazione in CIHR Lipidomica neurodegenerative, TGF 9121), e le infrastrutture il sostegno della Fondazione canadese dell&#39;Ontario Innovazione Innovazione e fiducia a SF. SI ha ricevuto una borsa di studio Ontario Laurea in Scienze e Tecnologie con il contributo del Consorzio di ricerca di Parkinson. NV riceve un Istituto di invecchiamento e Programma di formazione CIHR in Lipidomica neurodegenerative borsa di studio post-professionale. Noi riconosciamo con gratitudine il supporto software educativo e tecnico fornito da AutoDesk ricerca.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Cura Comitato Ottawa degli animali e del Consiglio canadese di prodotti per animali.

Questo protocollo descrive una procedura per la cultura e serialmente cryosection NPC dell&#39;ippocampo post-natale, localizzare l&#39;espressione di proteine ​​da immunolocalizzazione, ed infine ricostruire e analizzare la posizione topografica delle cellule immunopositive all&#39;interno del neurosfere intero 3D. Grazie alla combinazione di cultura biologia cellulare e tecniche di lavorazione, immagini di microscopia (OpenLab, Improvvisazione e altri software di analisi delle immagini), le capacità del software di editing grafico (Adobe Photoshop), e l&#39;animazione 3D e capacità software per il compositing (Autodesk Maya), vi presentiamo una metodologia di ricostruire la tutta la composizione cellulare di culture 3D da immagini 2D di serie consentendo la ricostruzione fedele della posizione cellulare e l&#39;espressione della proteina in tutto una cultura neurosfere. Questo protocollo può essere combinato con efficacia pari alla registrazione e la ricostruzione di sezioni sottili epifluorescente serial o confocale Z-stack attraverso spesse sezioni seriali. Perché l&#39;espansione clonale di NPC singola cultura neurosfere ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello, l&#39;impatto della sua struttura 3D rappresenta un importante determinante destino NPC in progenie esposta al stesso ambiente sperimentale 1. La divergenza tra lignaggio e l&#39;espressione della proteina al centro e la periferia di sezioni neurosfere di serie suggerisce che molteplici fattori fisici compresa la posizione delle cellule, sollecitazioni meccaniche, e la forza di taglio giocano un ruolo importante nella regolazione della NPC biologia 2. Inoltre, l&#39;espressione della proteina connessina, qui analizzata, ha dimostrato di cambiare a seconda di quando gli NPC sono coltivate come neurosfere 3D in sospensione o placcato su un substrato di laminina con funzionali connessina comunicazione mediata alterata se le cellule sono coltivate su plastica e substrato o in 3D gratis fluttuante culture 3. L&#39;impatto della posizione cellulare sul destino NPC rimane poco chiaro. E &#39;tecnicamente impegnativo per analizzare l&#39;impatto di posizione spaziale all&#39;interno della cultura 3D su biologia NPC dato che la valutazione antigenica di lignaggio e proteine ​​di segnalazione richiede interruzioni di architettura 3D per permettere permeabilizzazione cellulare e di anticorpi accesso a tutte le celle. Qui mostriamo che una metodologia di visualizzazione ibrida fornisce un mezzo per stabilire se alcune proteine ​​mostra unica localizzazioni di posizione nella cultura 3D, può essere usata per capire e testare la funzione delle proteine ​​e la regolazione rispetto alla localizzazione regionale nel neurosfere, e, cosa forse più importante , fornisce i dati di posizione necessario per studiare l&#39;impatto della topografia 3D e posizionamento cellulare sul destino NPC nella cultura 3D.

* Tutti gli altri reagenti chimici standard elencati nel protocollo sono di Sigma-Aldrich. Tutti gli altri reagenti standard di coltura tissutale sono da Invitrogen.

proteine ​​localizzazione in 3d cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

L&#39;importanza delle 3 dimensioni (3D) topografia nell&#39;influenzare staminali neurali e cellule progenitrici (NPC) fenotipo è ampiamente riconosciuto ancora difficile da studiare. Quando dissociato dal cervello embrionale o post-natale, NPC singolo proliferare in sospensione per formare neurosfere. Cellule figlie all&#39;interno di queste culture spontaneamente adottare distinte linee di sviluppo (neuroni, oligodendrociti ed astrociti) nel corso di espansione, pur essendo esposti alla stesso ambiente extracellulare. Questa progressione ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello ed è spesso usato per studiare la biologia di base NPC in un ambiente controllato. Valutare l&#39;impatto della topografia 3D e posizionamento cellulari all&#39;interno di queste culture, sul destino NPC, tuttavia, è difficile. Di localizzare ed identificare proteine ​​bersaglio lignaggi NPC mediante immunocitochimica, libero di fluttuare neurosfere deve essere placcato su un substrato o sezionato in serie. Questa elaborazione è necessaria per garantire permeabilizzazione equivalente cellulare e accedere anticorpi per tutta la sfera. Come risultato, le immagini 2D epifluorescente di criosezioni confocale o ricostruzioni 3D di Z-stack può fornire solo informazioni spaziali sulla posizione di celle all&#39;interno di discrete fette fisica o digitale 3D e non visualizzare la posizione cellulare nella sfera intatta. Qui, per ribadire la topografia della cultura neurosfere e permettere analisi spaziale di espressione della proteina durante l&#39;intera cultura, vi presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento, espansione e sezionamento seriale di neurosfere dell&#39;ippocampo post-natale adatto per immunolocalizzazione epifluorescente confocale o delle proteine ​​bersaglio. Connexin29 (Cx29) è analizzato come un esempio. Successivamente, utilizzando un ibrido di editing grafico e di modellazione 3D software applicati rigorosamente per mantenere dettaglio biologico, ci descrivono come rimontare il posizionamento 3D strutturale di queste immagini e la mappa digitale cellule marcate all&#39;interno della neurosfere completo. Questa metodologia permette la visualizzazione e l&#39;analisi della posizione del cellulare di proteine ​​bersaglio e cellule in tutta la topografia intera cultura 3D e faciliterà un&#39;analisi più dettagliata delle relazioni spaziali tra le cellule nel corso della neurogenesi e gliogenesis in vitro. Sia Imbeault e Valenzuela contribuito in maniera uguale e dovrebbe essere considerato comune primi autori.

Qui, descriviamo come produrre, espandere e immunolabel postnatale cellule dell&#39;ippocampo progenitrici neurali (NPC) in tre dimensioni (3D) della cultura. Successivamente, utilizzando le tecnologie di visualizzazione ibrida, che dimostrano come le immagini digitali di criosezioni immunolabelled può essere usata per ricostruire e mappare la posizione spaziale delle cellule immunopositive tutto il neurosfere 3D intero.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

L'importanza della topografia tridimensionale (3D) nell'influenzare il fenotipo delle cellule staminali e progenitrici neurali (NPC) è ampiamente riconosciuta, tuttavia risulta difficile...

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Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

Questo video mostra lo sviluppo e la differenziazione delle cellule staminali neurali umane all'interno di un'impalcatura tridimensionale. Un rivestimento di laminina sull'impalcatura favorisce l'adesione cellulare, mentre un mezzo neurale privo di fattore di crescita induce la differenziazione cellulare in cellule progenitrici neurali, che estendono i loro processi all'interno di un'architettura porosa in più direzioni, formando una coltura...

Differenziazione delle cellule staminali neuronali umane in colture 3D utilizzando un'impalcatura porosa

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Imaging in tempo reale seguito da tracciamento di singole cellule per monitorare la biologia cellulare e la progressione del lignaggio di più popolazioni neurali. J. Vis. Exp. (2017) Il Il video mostra il processo di preparazione, imaging e monitoraggio delle cellule staminali neurali adulte in tempo reale per studiare i comportamenti cellulari, tra cui la divisione e la differenziazione.

 Imaging in tempo reale e tracciamento di singole cellule per monitorare il lignaggio neurale nelle cellule staminali neurali adulte

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

La pipeline descritta è progettata per la segmentazione di set di dati di microscopia elettronica più grandi di gigabyte, per estrarre morfologie intere celle. Una volta che le celle sono state ricostruite in 3D, software personalizzato progettato intorno alle esigenze individuali può essere utilizzato per eseguire un'analisi qualitativa e quantitativa direttamente in 3D, utilizzando anche la realtà virtuale per superare vista occlusione.

Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali

Il metodo qui presentato utilizza il micromodellamento insieme all'imaging quantitativo per rivelare l'organizzazione spaziale all'interno delle culture dei mammiferi. La tecnica è facile da stabilire in un laboratorio di biologia cellulare standard e offre un sistema trattabile per studiare patterning in vitro.

Mappatura dell'Emergente Organizzazione Spaziale delle Cellule Mammarie utilizzando Micropatterns e Quantitative Imaging

Qui presentiamo un saggio di co-coltura facile da usare per analizzare la migrazione del glioblastoma (GBM) sui neuroni modellati. Abbiamo sviluppato una macro nel software FiJi per una facile quantificazione della migrazione cellulare GBM sui neuroni, e abbiamo osservato che i neuroni modificano la capacità invasiva delle cellule GBM.

Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Scopri la localizzazione proteica in neurosfere 3D di cellule staminali neurali ippocampali postnatali. Questo metodo combina immunomarcatura e ricostruzione tridimensionale per studiare l'organizzazione spaziale delle proteine.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

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