Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

Quando coltivate in sospensione, le cellule progenitrici neurali isolate da nicchie neurogeniche del cervello proliferano formando neurosfere. In questo studio mostriamo l'isolamento e la sezione seriale di neurosfere derivate dall'ippocampo postnatale in libera sospensione, al fine di localizzare l'espressione proteica all'interno della neurosfera tridimensionale. Eseguiremo una immunoistochimica per una proteina di interesse, in questo caso Conexion 29, seguita dall'assemblaggio e dalla ricostruzione tridimensionale di immagini microscopiche bidimensionali della neurosfera.

La visualizzazione delle proteine nel contesto delle loro strutture tridimensionali native, come una neurosfera libera o un tessuto, permette una migliore comprensione della funzione proteica in base alla localizzazione all'interno di queste strutture e consente anche di dedurre possibili regole per proteine con localizzazione nota ma funzione sconosciuta. Ciao, sono Sophia Ambo del Laboratorio di Rigenerazione Neurale dell'Università di Ottawa. E io sono Nicholas Valenzuela del Carlton Immersive Media Studio della Carleton University di Ottawa.

Oggi dimostreremo come isolare, espandere e sezionare in serie cellule progenitrici neurali postnatali derivate dall'ippocampo sotto forma di sfere neurali. Al fine di localizzare l'espressione proteica mediante immunoistochimica, utilizzeremo successivamente immagini bidimensionali dei tagli in serie delle sfere neurali ottenuti dopo l'immunomarcatura per illustrare un metodo di ricostruzione della localizzazione cellulare e proteica nella struttura tridimensionale, valutando così l'organizzazione spaziale dell'espressione proteica all'interno delle sfere neurali. Cominciamo dunque.

Dopo aver raccolto i cervelli, preparateli per posizionarli sul mandrino creando una superficie piana in modo che i cervelli possano appoggiare correttamente. Questa operazione è chiamata bloccaggio. Bloccate il cervelletto utilizzando una lametta e pinzette.

Successivamente, mettere una goccia di colla cianoacrilica sul mandrino e fissare il primo cervello su di essa, con il lato anteriore rivolto verso l'alto e il lato dorsale rivolto verso di voi. Procedere allo stesso modo con gli altri cervelli; per l'ultimo cervello, è prudente posizionare il lato dorsale lontano da voi, poiché il taglio a volte risulta incompleto in questa direzione. Se dovesse verificarsi un taglio incompleto, utilizzare un bisturi per sezionare ulteriormente e raccogliere il campione.

La velocità è essenziale nel passaggio di incollaggio, poiché i cervelli non possono essere esposti all'aria per troppo tempo. Una volta incollati tutti i cervelli, il mandrino viene posizionato nel vibratome e il supporto viene riempito con liquido cefalorachidiano freddo di ghiaccio.

Impostare il vibratomo su una frequenza di 8,5 e una velocità compresa tra 3,5 e 4,5. Portare la lama a contatto con il CSF e impostare il taglio automatico. Ora procederemo a tagliare sezioni di 500 micron.

Mantenere le fette che contengono l'ippocampo. Posizionarle in una piastra riempita con A CSF ghiacciato e scartare le restanti fette. Una volta raccolte tutte le fette, procedere alla dissezione dell'ippocampo.

Utilizzando un microscopio stereoscopico, si preleva esclusivamente l'ippocampo dorsale approssimativamente tra bgma meno 1,65 millimetri e meno 2,10 millimetri. Posizionare gli ippocampi in una piastra vuota e fredda. Quando tutti gli ippocampi sono stati raccolti dalle sezioni, è il momento di trasferirli nell'incubatore a flusso laminare per la dissociazione meccanica.

Utilizzando un bisturi, spruzzare sulla lama il 70% di etanolo e passarla alla fiamma per sterilizzarla. Tagliare il tessuto con il bisturi fino a quando non appare liquido. A questo punto, utilizzando un mezzo di dissociazione già contenente peptasi DNAasi e proteasi neurale, raccogliere il tessuto mediante pipetta e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri.

Per la dissezione enzimatica, posizionare il tubo in un forno rotante impostato a 37 gradi e lasciare procedere la digestione per 45 minuti fino a un'ora. Al termine della digestione, aggiungere 10 millilitri di PBS sterile per colture cellulari per arrestare la reazione enzimatica e centrifugare le cellule a 300 ×g per cinque minuti. Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet.

In cinque millilitri di PBS, utilizzare una pipetta Pasteur e agitare il campione per dissociare ulteriormente il tessuto. Continuare ad agitare finché i frammenti di tessuto non smettono di ridursi di dimensioni. A questo punto, centrifugare nuovamente le cellule per formare il pellet.

Rimuovere il PBS e risospendere il pellet in tre millilitri di mezzo di mantenimento. Una volta che si è ben tritato il campione, prelevare un’aliquota di 15 microlitri e mescolarla con un volume uguale di trian blu.

Prelevare due campioni da 10 microlitri e caricare un emocitometro per il conteggio cellulare. Contare le cellule in tre campi per ogni sezione, per un totale di sei campi. Calcolare la media dei valori per determinare la densità cellulare.

Tenere presente che il campione è diluito. Nella piastra con blu di trian, seminare le cellule in piatti a bassa adesività a una densità di 2,5 × 10⁵ cellule per piatto in un volume finale di 5 mL di mezzo di mantenimento. Se i piatti a bassa adesività non sono disponibili, è possibile utilizzare piatti di Petri.

In questo caso, sarà necessario agitare delicatamente le neurosfere al mattino e al pomeriggio ogni giorno per i primi sei giorni, in modo che le neurosfere non aderiscano al fondo della piastra. Aggiungere EG, F e FGF prima di posizionare le piastre nell'incubatore. Questi fattori di crescita dovranno essere rinnovati ogni due giorni per tutta la durata della coltura. Al giorno 14 in vitro, fissare le neurosfere utilizzando formaldeide fino a una concentrazione finale di circa il 4%, aggiungendola direttamente alla coltura e incubando a temperatura ambiente per 20 minuti.

Centrifugare le cellule a 300 ×g per cinque minuti per ottenere un pellet. Lavare le cellule due volte con PBS e risospendere in una soluzione di saccarosio al 15-20% preparata in un tampone fosfato 10 millimolare. Lasciare in crioprotezione a quattro gradi per almeno 24 ore prima della sezione su criostato.

Rimuovere le neurosfere protette con crioprotettore dal frigorifero e posizionarle in una piastra da 60 millimetri. Per il sezionamento seriale, in cui è fondamentale raccogliere ogni singolo taglio, ho trovato più efficace selezionare neurosfere di buone dimensioni e forma utilizzando un microscopio stereoscopico; quindi, mediante pipetta, posizionare una neurosfera in uno stampo criogenico riempito con composto OCT. Contrassegnare la posizione in cui si trova la neurosfera sullo stampo criogenico.

Questo passaggio aiuterà a individuare la neurosfera durante il sezionamento. Una volta posizionate rapidamente cinque-dieci sfere nello stampo, congelarle utilizzando CO2. Utilizzando le indicazioni presenti sullo stampo criogenico, segnare direttamente sul blocco di OTC congelato la posizione delle neurosfere.

Rimuovere il blocco di OCT dallo stampo e posizionarlo sul mandrino del criostato. Fissare lo stampo al mandrino utilizzando CO2 e inserirlo nel criostato. Lasciare equilibrare i campioni per almeno 30 minuti.

Una volta terminato, tagliare rapidamente lungo i segni effettuati sullo stampo, quindi iniziare a raccogliere ogni sezione a partire da quel punto. Verificare al microscopio ottico dove iniziano le sezioni del neurosfera. Al termine del taglio, conservare i vetrini in un congelatore fino al momento di eseguire l'immunochimica. Per questo passaggio, prelevare i vetrini contenenti una delle neurosfere tagliate in serie e includere i vetrini con le cinque sezioni precedenti e le cinque successive.

Questo garantisce che si immagini l'intera neurosfera. L'uso di un colorante contro il nucleo sarà essenziale per individuare tutte le sezioni della neurosfera. Tienilo presente quando pianifichi la tua colorazione immunoistochimica mentre prepari i vetrini applicando PBS e lasciandoli riscaldare a temperatura ambiente per almeno cinque minuti; utilizziamo un buffer per gli anticorpi che contiene 0,3% di Triton X-100 per la permeabilizzazione e 3% di albumina sierica bovina per il bloccaggio.

Diluire l'anticorpo primario in modo appropriato in questo buffer e incubare nella camera umana tutta la notte a quattro gradi. Utilizzare PBS per far galleggiare il paraformaldeide dai neurosfere e rimuoverlo con cura usando pinzette. Questo è il primo di quattro lavaggi con PBS di cinque minuti ciascuno.

Applicare l'anticorpo secondario sui vetrini e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Come in precedenza, far galleggiare il paraformaldeide dal vetrino utilizzando PBS ed eliminarlo con pinzette. Ancora una volta, questo è il primo di quattro lavaggi con PBS di cinque minuti ciascuno.

Nel terzo lavaggio, includiamo HOS 3 3 2, 5 8 come colorante di contrasto nucleare, diluito a 0,5 microgrammi per millilitro. In PBS, segue un ulteriore lavaggio di cinque minuti dopo il lavaggio con hos. Una volta completati tutti i lavaggi, applicare una quantità generosa di mezzo di montaggio sulla parte inferiore del vetrino e coprire con un coprioggetto di vetro.

Fissare gli angoli con lo smalto per unghie. Una volta che tutti i vetrini sono stati coperti con il coprioggetti, fissare i restanti bordi del coprioggetti. Acquisire l'immagine del vetrino immediatamente oppure conservarli a meno 20 gradi fino al momento dell'utilizzo.

Durante l'acquisizione delle immagini, individuare le cellule sul vetrino è la parte più difficile; sarà facile rilevare le cellule appartenenti alla sfera se le si cerca utilizzando la controcolorazione nucleare. Una volta individuato l'inizio della neurosfera, che potrebbe comprendere solo poche cellule, acquisire immagini di ogni sezione a partire da quel punto. Scattare immagini della colorazione nucleare, della proteina o delle proteine di interesse e un'immagine a contrasto di fase.

Questa immagine a contrasto di fase sarà molto importante nelle fasi di modellazione. Le immagini con barre di scala residenti di 10 micrometri e 50 micrometri, create con il software Open Lab 3.56, vengono importate in Photoshop CS4 utilizzando una dimensione standard della tela di 3.300 per 2.550 pixel.

Tutte le immagini delle sezioni seriali vengono salvate come file TIFF mantenendo la dimensione standard del canvas. Aprire le immagini di contrasto della prima e della seconda fase delle sezioni seriali dei neurosfere. Aumentare la trasparenza della seconda sezione sotto la scheda immagine, aprire la rotazione dell'immagine e scegliere arbitrario.

Ruotare la seconda sezione finché non si riescono a identificare punti di continuità geometrica e strutturale tra le immagini. Ripetere per tutte le sezioni seriali, salvando ogni sezione come un livello separato. Assicurarsi che ogni livello dell'immagine corrispondente alla fase e all'espressione proteica sia collegato in modo che tutte le rotazioni per ogni canale vengano eseguite contemporaneamente.

Crea un piano in Maya con le stesse proporzioni del file Photoshop, utilizzando la riga di stato dell'interfaccia utente di Maya. Cambia la barra dei menu dall'impostazione predefinita di animazione a superfici. Utilizza una sfera di suddivisione primitiva per creare il corpo cellulare con la sfera selezionata.

Iniziare a manipolare i suoi vertici facendo clic con il tasto destro del mouse sull'oggetto e selezionando vertice dal menu contestuale. In seguito, elaborare la superficie della sfera modificando il livello di visualizzazione dal menu contestuale, nella scheda superfici di suddivisione del menu principale. Aprire la finestra delle opzioni di compressione gerarchica e impostare il numero di livelli a due.

Comprimi la sfera. Cambia la barra del menu da superfici a poligoni con la sfera selezionata. Apri lo strumento di modellazione geometrica dalla scheda mesh del menu principale.

Perfezionare la superficie della cellula fino alla sua forma finale. Utilizzare il set di strumenti per la modellazione geometrica presente nella scheda delle impostazioni degli strumenti. Ripetere questo processo per ogni cellula della propria tipologia per simulare la varietà di cellule progenitrici presenti negli neurosfere.

In questa dimostrazione, 10 diversi tipi di cellule progenitrici costituiranno la base della neurosfera. Selezionare la tipologia cellulare e congelare le trasformazioni con le cellule della propria tipologia. Verranno progettati due shader di superficie per rappresentare sia le cellule che esprimono la proteina collegata al 29 sia le cellule in cui la proteina è assente.

Aprire la finestra hyper shade dalla scheda dell'editor di rendering delle finestre del menu principale. Scegliere uno shader ramp dalla scheda dei materiali superficiali. Aprire l'editor degli attributi e impostare gli attributi del colore dello shader, del colore ambiente incandescente, della mappa di rilievo e del colore speculare.

Assegna una texture 3D di tipo Browniano al nodo del colore ambiente e una texture frattale 2D al nodo di mappatura in rilievo. Seleziona le connessioni di input e output dello shader risultante ed esporta la rete selezionata. Seleziona la tipologia cellulare e apri la finestra delle opzioni di esportazione della selezione.

Scegliere il tipo di file Maya A-S-C-I-I e deselezionare la casella di controllo "includi questi input" per l'esportazione della selezione. Aprire il file delle sezioni seriali allineate in Adobe Photoshop. Stabilire una chiave di tratti a matita per indicare la posizione di ogni cellula progenitrice nelle sezioni seriali.

In questa dimostrazione, una chiave composta da tre tratti. Un quadrato pieno, un quadrato con una linea tratteggiata e un quadrato con una croce verranno utilizzati per indicare se una cellula si trova in una, due o tre sezioni.

Questa chiave di tratti è ulteriormente definita dal colore rosso che rappresenta le cellule che esprimono la connexina 29 e dal bianco che rappresenta le cellule che non esprimono la connexina 29. Attivare il livello della fase e iniziare a segnare il centro di ogni cellula progenitrice con un tratto di matita bianca. Utilizzare un livello separato all'interno della cartella della sezione per creare le mappe.

Passare da una sezione all'altra per individuare la posizione della cellula, assicurandosi di indicare correttamente le cellule presenti in più di una sezione. Con il layer CX 29 attivato, selezionare le cellule che si trovano nelle regioni in cui CX 29 è espressa positivamente.

Scegliere il comando di riempimento dalla scheda Modifica della barra del menu principale di Photoshop e cambiare le tracce bianche in rosso con le mappe completate. Salvare ogni sezione come immagine JPEG separata nella cartella delle immagini sorgenti del progetto Maya. A tal fine, sarà necessario innanzitutto creare un nuovo progetto Maya dalla riga di stato dell'interfaccia utente di Maya.

Modificare la barra del menu dall'impostazione di animazione predefinita ai poligoni importando i piani. Importare i file ma e la barra di scala. File ma dalla cartella progetti visualizzata con il piano selezionato.

Assegnare uno shader Lambert facendo clic con il tasto destro del mouse sull'oggetto e aprendo la scheda "assegna nuovo materiale" nell'editor degli attributi. Fare clic sulla casella a scacchi a destra dell'attributo colore del materiale nel menu a comparsa. Scegliere "file" nella sezione "texture 2D" sotto la sezione attributi file nell'editor degli attributi.

Fare clic sull'icona del file a destra dell'attributo del nome dell'immagine. Scegliere la prima sezione dalla cartella delle immagini sorgenti. Passare la telecamera della finestra dell'area di lavoro dalla vista prospettica alla vista superiore ortografica predefinita aprendo la scheda di quel pannello.

Selezionare lo strumento crea poligono dalla scheda mesh del menu principale e tracciare il contorno della sezione. Scegliere la prima mappa dalla cartella delle immagini sorgenti e assegnarla al piano poligonale appena creato. Dopo aver seguito i passaggi stabiliti per creare il piano poligonale con l'oggetto selezionato, scegliere UV dal menu di marcatura facendo clic con il tasto destro del mouse sul piano.

Selezionare tutti i punti UV dei piani e aprire l'editor della texture UV dalla scheda finestre del menu principale, quindi ridimensionare proporzionalmente le UV in modo da adattarle al piano della sezione. Ripetere questo procedimento per ogni sezione della neurosfera, assicurandosi che gli spazi tra ciascuna sezione corrispondano all'altezza della barra di scala presente nella riga di stato dell'interfaccia utente di Maya. Passare la barra dei menu dall'impostazione predefinita di animazione a dinamica, lasciando visibile soltanto la prima sezione della neurosfera.

Nascondere tutte le altre sezioni modificando le impostazioni di visualizzazione dalla scheda display del menu principale con la finestra delle opzioni delle curve CV aperta, selezionare una lineare nelle impostazioni della curva CV. Osservando la scena dalla telecamera in vista dall'alto, iniziare ad assegnare punti alle mappe cellulari creando una curva per le cellule CX 29 negative e una per le cellule CX 29 positive. Le curve risultanti risultano piatte quando osservate dalla telecamera in vista laterale.

Approssimare lo spessore delle sezioni spostando i punti della curva lungo l'asse Y, utilizzando la barra della scala come riferimento. Ripetere questo procedimento per ogni sezione della neurosfera.

Importare la tipologia di cellula. file ma dalla cartella scenes del progetto e duplicare la tipologia di cellula sia per i progenitori CX 29 negativi che per i CX 29 positivi. Aprire la finestra hyper shade dalla scheda editor di rendering di windows nel menu principale.

Importare gli shader precedentemente creati assegnandoli alle celle della tipologia dalla finestra dell'outliner. Rimuovere il nome del file dall'inizio degli oggetti importati. Questo risulterà importante nelle fasi successive del processo di modellazione.

Selezionare la scheda "particelle" dal menu principale e creare un emettitore di particelle per la prima curva CV. Aprire la scheda forma particella uno e, nella sezione attributi di emissione, modificare il conteggio massimo da meno uno al numero di punti presenti sulla prima curva. Nella scheda attributi di rendering, cambiare il tipo di rendering delle particelle in superficie blobby.

Fare clic sulla casella del tipo di rendering corrente qui sotto e modificare il raggio delle particelle a 0,01. Collegare le particelle ai vertici della curva selezionando prima le particelle, quindi tenendo premuto Maiusc, selezionare la curva.

Aprire le opzioni dell'obiettivo dalla scheda delle particelle nel menu principale e impostare il peso dell'obiettivo a uno. Fare clic su crea. Selezionare le celle dalla numero uno alla 10 in ordine nella finestra dell'outliner e aprire la casella delle opzioni di sostituzione istantanea dalla scheda delle particelle nel menu principale.

Nella casella degli oggetti istanza, tutte e 10 le celle devono essere elencate in ordine. Scegliere il nome corretto della forma della particella dall'elenco a discesa della scheda oggetto particella da istanziare. Fare clic su crea. Per impostazione predefinita, solo la prima cella selezionata sostituirà le particelle lungo la curva; per far apparire tutte e 10 le celle e farle ciclare in modo casuale tra le particelle, è necessaria un'espressione.

Una seconda espressione garantirà che le cellule emettano in modo casuale nello stesso modo ogni volta. Il cursore dell'intervallo viene riposizionato con l'emettitore selezionato. Aprire l'editor degli attributi nella scheda forma delle particelle, quindi aggiungere un attributo dinamico.

Fare clic sulla casella generale sotto il nome lungo. Digitare random_underscore_index nel tipo di attributo, passare da scalare a array per particella e premere aggiungi nella scheda attributi array per particella. Una casella random_underscore_index è stata aggiunta.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo spazio vuoto e selezionare crea espressione dalla casella a discesa. Digitare il testo seguente nella casella dell'espressione per completarla. Aprire la scheda di sostituzione rapida della geometria nella finestra dell'editor degli attributi e nell'indice dell'oggetto delle opzioni generali.

Selezionare un indice casuale con trattino basso dall'elenco a discesa. Portare il cursore temporale al primo fotogramma e premere riproduci. I tipi cellulari sono ora distribuiti casualmente tra le particelle.

Ripetere questo processo per ogni sezione della neurosfera. Assicurarsi che ogni nuova istanza di emettitore e ogni indice casuale siano differenziati per nome e opportunamente organizzati nella finestra dell'outliner nel rendering. Nella sezione della finestra delle impostazioni di rendering, modificare il rendering da Maya Software a Mental Ray.

Aprire la scheda qualità e, nella sezione ray tracing, impostare il valore di riflessione su zero. Aprire la scheda buffer del frame e modificare il ritaglio del colore da raw ad alpha, quindi deselezionare l'opzione Pre moltiplica.

Aprire l'editor del canale della scatola e modificare le impostazioni dell'editor del layer da visualizzazione a rendering. Selezionare le celle importate della tipologia e fare clic sull'icona crea nuovo livello e assegna oggetti selezionati. Rinominare il livello "ambient occlusion".

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul livello appena creato, quindi selezionare gli attributi dal menu a destra della casella del livello di rendering. Fare clic sul pulsante preimpostazioni e selezionare occlusione dall'elenco a discesa. Selezionare la scheda MIB underscore AMB underscore occlusion one e modificare i campioni da 16 a 2 56.

Riaprire l'editor del livello della casella del canale e, nella scheda opzioni, aprire la finestra delle opzioni di rendering di tutti i livelli, selezionare composito e mantenere i livelli con il livello di oclusione ambientale selezionato. Cambiare da normale a moltiplica tramite la casella a discesa appena sopra l'elenco dei livelli, eseguire due passaggi di rendering della neurosfera, una volta con il livello di oclusione ambientale attivato e una volta con il livello principale attivato. Salvare le immagini come file IFF nella cartella immagini del progetto.

Aprire entrambe le immagini in Adobe Photoshop. Posizionare il livello di oclusione ambientale sopra il livello principale e impostarlo su moltiplica. Creare uno sfondo e appiattire l'immagine.

Abbiamo appena mostrato come coltivare cellule neurogeniche derivate dall'ippocampo sotto forma di neurosfere, come effettuare sezioni seriali delle colture di neurosfere utilizzando un criostato e come eseguire una immunoistochimica per una proteina di interesse. Abbiamo inoltre mostrato come modellare la localizzazione spaziale dell'espressione di tale proteina in tre dimensioni, combinando la registrazione della coltura cellulare con un software di modellazione tridimensionale.

Speriamo che questo ti sia utile e buona fortuna nei tuoi esperimenti.