Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Sono Troy Gasai. Parleremo di un saggio su fetta organotipica che è stato perfezionato nel mio laboratorio negli ultimi anni. Ben Jacket, del mio laboratorio, vi mostrerà come viene eseguito questo saggio.

L'assay con fette organotipiche del cervello postnatale è un metodo potente per testare diversi fattori e il loro ruolo nella migrazione neuronale nel cervello postnatale e nel flusso migratorio TRO. Ciao, sono Ben Jakay. Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del dottor Troy GGE presso la Facoltà di Medicina Veterinaria della North Carolina State University, e oggi sono qui per mostrarvi come eseguiamo il trapianto incrociato di tessuti tra fette organotipiche di cervello di topo al fine di visualizzare i neuroblasti in migrazione nel cervello postnatale.

Tutte le tecniche descritte in questo video devono essere eseguite in un ambiente sterile, preferibilmente all'interno di una cappa a flusso laminare utilizzando strumenti sterilizzati. Una goccia di 150 microlitri di mezzo per sezioni è posizionata al centro della parte inferiore in vetro della piastra, utilizzando una siringa monouso dotata di ago da 23 gauge. Diversi punti di colla sono applicati all'esterno del vetrino circolare della piastra, lasciando un lato non incollato per consentire lo scambio di fluidi. Una membrana dei pori nucleari è quindi delicatamente posizionata sopra il mezzo utilizzando pinzette microchirurgiche, assicurandosi che non vengano intrappolate bolle d'aria al di sotto della membrana.

Le pinze curve vengono quindi utilizzate per appiattire le gocce di colla e fissare la membrana in posizione. Un millilitro di mezzo per sezioni viene aggiunto sopra la membrana e, infine, le piastre vengono collocate in un incubatore fino al momento dell'uso. I migliori risultati si ottengono quando le sezioni sono preparate da topi postnatali giovani, da P uno a P dieci; in primo luogo, la testa viene stabilizzata tenendo il muso con pinze microchirurgiche.

La pelle viene escissa longitudinalmente dal collo fino al muso. Il cuoio capelluto viene staccato per esporre l'osso e il cranio viene tagliato longitudinalmente e anteriormente a partire dalla spina dorsale, effettuando un taglio mediano e due tagli laterali, uno per lato. È necessario prestare attenzione a minimizzare il contatto con il tessuto corticale sottostante.

Man mano che le falde craniche vengono rimosse dal cervello per migliorare la stabilità del tessuto. Durante il sezionamento con vibram, le parti più laterali e caudali del cervello vengono asportate con una lametta. I due emisferi vengono accuratamente prelevati dalla scatola cranica e posizionati con la superficie mediale rivolta verso il basso in uno stampo per inclusione.

Vengono immediatamente ricoperti con gel di AGA roses al 3% di grado DNA sciolto in tampone per la preparazione dei tessuti, mantenuto a 37 gradi Celsius. Dopo due minuti di stabilizzazione su una superficie orizzontale piana, per garantire un indurimento uniforme dell'AGA roses, gli stampi vengono posizionati sul ghiaccio per completare la solidificazione.

Una volta che il gel contenente gli emisferi si è solidificato, viene rimosso dallo stampo e rifinito attorno al tessuto cerebrale. Il tessuto inclusi nel gel viene quindi montato sul disco del campione del vibratomo con la superficie mediale rivolta verso l'alto e fissato con adesivo a base di cianoacrilato. Il disco viene poi installato nel vassoio del vibratomo riempito con mezzo di preparazione per tessuti ghiacciato, e il cervello viene sezionato in fette di 150 micrometri di spessore.

Una volta che le fette contenenti la RMS sono rilasciate dalla lama, vengono accuratamente prelevate con una spatola piatta di piccole dimensioni e posizionate al centro delle piastre di coltura. È fondamentale ridurre al minimo la manipolazione delle fette poiché il tessuto è molto fragile. La quantità di mezzo nelle piastre di coltura viene regolata a un livello sufficiente a coprire le sezioni cerebrali, evitando che si spostino.

I piatti vengono etichettati e trasferiti in un incubatore. I cervelli del donatore sono preparati in modo simile a quello dei cervelli riceventi, con la differenza che le sezioni sono tagliate a uno spessore di 250 µm e le fette vengono raccolte in ghiaccio.

Preparazione del tessuto freddo. Le sezioni di buffer vengono immediatamente posizionate sotto un microscopio stereoscopico con capacità di fluorescenza in epifluorescenza. La RMS è visibile come una struttura a forma di U di colore grigio che si estende dalla zona subependimale al bulbo olfattivo.

Il RMS viene delicatamente microdissecato utilizzando pinzette microchirurgiche. Una pinzetta viene usata per stabilizzare la sezione mentre l'altra viene impiegata per effettuare piccoli tagli intorno al RMS finché non viene rilasciato dalla sezione. Il RMS escisso viene quindi tagliato in piccoli espianti di circa 200-500 micrometri di diametro.

In questo esempio, gli espianti di melanzana sono preparati da topi che esprimono la proteina fluorescente rossa TD-tomato. Le piastre inferiori contenenti fette di tessuto ospite vengono rimosse dall'incubatore e posizionate sotto il microscopio stereoscopico utilizzando luce visibile. Viene praticata una piccola incisione nel segmento iniziale della RMS e, mediante una pipetta dotata di punta da 20 microlitri, un singolo espianto di RMS del donatore viene trasferito nel sito inciso della RMS dell'ospite.

L'espianto viene delicatamente inserito nell'incisione per stabilire il contatto tra i due tessuti. Per garantire che questo contatto sia stabile, gli espianti vengono spinti leggermente tra la sezione e la membrana povera di nuclei. Le piastre vengono quindi riportate nell'incubatore per almeno un'ora, in modo da permettere alle sezioni di aderire stabilmente alla membrana.

Neuroblasti dovrebbero iniziare a migrare dall'espianto nella RMS dell'ospite dopo circa una o due ore. La migrazione cellulare è meglio visualizzata utilizzando obiettivi da 20 ingrandimenti con distanza lavorativa particolarmente lunga. I tessuti coltivati in coltura sono trasferiti dall'incubatrice a una camera riscaldata montata sul microscopio.

Neuroblasti fluorescenti possono essere analizzati con intervalli che vanno da zero a 10 minuti, a seconda del tipo di analisi desiderata. Il nostro protocollo organotipico di coltura di tessuto in slice è stato ampiamente testato e ottimizzato negli ultimi anni per garantire coerenza nei modelli di migrazione e nell'orientamento nella RMS. In questo esempio, l'analisi delle cellule che migrano da una espianata, ottenuta da topi in cui la TD-tomato è espressa sotto il promotore di nestina, rivela una migrazione altamente orientata e rapida verso la RMS dell'ospite.

Ingrandimento elevato. L'analisi in time-lapse mostra un'eccellente risoluzione dell'intera lunghezza di un neuroblasto in migrazione durante una sessione di acquisizione immagini della durata di 20 minuti. Al termine dell'acquisizione, le sezioni possono essere fissate con paraformaldeide al 4%, appena preparata e fredda, e successivamente immunomarcate per diversi componenti del flusso migratorio.

In questo caso, gli astrociti positivi per la GFAP in blu e i vasi sanguigni positivi per il CD31 in verde vengono rivelati mediante immunofluorescenza istochimica; l'analisi ad alta magnificazione di sezioni colorate per le proteine citoscheletriche actina in blu e tubulina in verde rivela un'espressione non uniforme di questi componenti da parte della cellula in fase di migrazione. Il nostro protocollo presenta alcune difficoltà che richiedono pazienza, pratica e un impegno di tempo sia nella preparazione che nell'analisi dei risultati.

Ecco quindi alcuni suggerimenti utili che vi aiuteranno a ottenere i migliori risultati dai vostri esperimenti. Secondo la nostra esperienza, i topi nell'intervallo di età da P uno a P 10 forniscono i migliori risultati. Anche l'abbinamento per età tra cervelli donatori e riceventi migliora la riproducibilità degli esperimenti.

Poiché la maggior parte dei reagenti e delle piastre di coltura deve essere preparata fresca, il nostro saggio su sezioni richiede diverse ore di preparazione e acquisizione di immagini ininterrotte in un singolo giorno. Una volta prelevati i cervelli, i passaggi successivi devono essere eseguiti nel minor tempo possibile. Tra decapitazione e preparazione delle sezioni, tutti i passaggi devono essere effettuati utilizzando ghiaccio e reagenti freddi, e la manipolazione del tessuto deve essere ridotta al minimo per evitare alterazioni anatomiche.

Gli strumenti utilizzati per queste dissezioni devono essere sterili e riservati esclusivamente alle manipolazioni di tessuti vivi. Non utilizzare mai strumenti che siano entrati in contatto con fissativi come il formaldeide. Le sezioni sono generalmente vitali fino a 36 ore, con un evidente declino della migrazione, velocità e orientamento tra le 24 e le 36 ore.

Prestare attenzione a questa limitazione quando si pianificano esperimenti e analisi.