Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Sono Troy Gasai. Parleremo di un saggio di fetta organotipico che è stato perfezionato nel mio laboratorio negli ultimi anni. Ben Jacket nel mio laboratorio ti dimostrerà come viene eseguito questo test.

Il test della fetta organotipica del cervello postnatale è un metodo potente per testare vari fattori e il ruolo sulla migrazione neuronale nel cervello postnatale e nel flusso migratorio TRO. Ciao, sono Ben Jakay. Sono un borsista post-dottorato presso il laboratorio del Dr.Troy gge presso il College of Veterinary Medicine della North Carolina State University, e sono qui oggi per mostrarvi come eseguiamo il trapianto incrociato di tessuti tra fette di cervello di topo organotipiche al fine di visualizzare la migrazione dei neuroblasti nel cervello postnatale.

Tutte le tecniche descritte in questo video devono essere eseguite in un ambiente sterile, preferibilmente una cappa a flusso laminare utilizzando strumenti sterilizzati. Una goccia da 150 microlitri di terreno per fette viene posta al centro del bicchiere, parte inferiore del piatto con una siringa monouso dotata di ago calibro 23. Diversi punti di colla vengono posizionati all'esterno del vetrino di copertura circolare inferiore, lasciando un lato non incollato per lo scambio di fluidi. Una membrana a pori nucleari viene quindi posizionata delicatamente sopra il fluido utilizzando micro pinze, assicurando che le bolle d'aria non rimangano intrappolate sotto la membrana.

Le pinze curve vengono quindi utilizzate per appiattire i punti di colla e fissare la membrana in posizione. Un millilitro di terreno a fette viene aggiunto sopra la membrana e, infine, i piatti vengono posti in un'incubatrice fino al momento dell'uso. I migliori risultati si ottengono quando le fette vengono preparate da giovani topi postnatali, da P uno a P dieci, la testa viene stabilizzata tenendo il muso con una micro pinza.

La pelle viene asportata longitudinalmente dal collo al muso. Il cuoio capelluto viene staccato per esporre l'osso e il cranio viene tagliato longitudinalmente e anteriormente a partire dallo sterno magna effettuando un taglio mediale e due laterali, uno su ciascun lato. Bisogna fare attenzione a ridurre al minimo il contatto con il tessuto corticale sottostante.

Poiché i lembi cranici vengono rimossi dal cervello per migliorare la stabilità del tessuto. Durante il sezionamento vibram, la maggior parte laterale e gli aspetti codal del cervello vengono rimossi con una lama di rasoio. I due emisferi vengono accuratamente estratti dal cranio e posizionati sulla superficie mediale in uno stampo da inclusione.

Vengono immediatamente ricoperti con gel di rose AGA fuso al 3% di DNA disciolto in un tampone di preparazione tissutale che viene mantenuto a 37 gradi Celsius. Dopo due minuti di stabilizzazione su una superficie piana orizzontale. Per garantire un indurimento uniforme delle rose aga, gli stampi vengono posizionati sul ghiaccio per completare l'incastonatura.

Una volta che il gel contenente gli emisferi è indurito, viene rimosso dallo stampo e tagliato attorno al tessuto cerebrale. Il tessuto incorporato nel gel viene quindi montato sul disco del campione del tono vibrante con una superficie mediale rivolta verso l'alto e fissato con adesivo cianoacrilato. Il disco viene quindi installato nel vassoio del campione di vibrazione riempito con un terreno di preparazione del tessuto ghiacciato e il cervello viene sezionato a uno spessore di 150 micrometri.

Una volta che le fette contenenti RMS vengono rilasciate dalla lama, vengono accuratamente estratte utilizzando una piccola spatola a testa piatta e posizionate in piano al centro dei piatti di coltura. È fondamentale che la manipolazione delle fette sia ridotta al minimo poiché il tessuto è molto fragile. La quantità di terreno nelle piastre di coltura viene regolata a un livello sufficiente a coprire le sezioni del cervello impedendo loro di muoversi.

Le piastre vengono etichettate e trasferite in un'incubatrice. I cervelli dei donatori sono preparati in modo simile a quello dei cervelli dei riceventi, tranne per il fatto che le sezioni sono tagliate a 250. Lo spessore micrometrico e le fette vengono raccolte nel ghiaccio.

Preparazione dei tessuti a freddo. Le fette tampone vengono immediatamente poste sotto un microscopio da dissezione con capacità di epifluorescenza. L'RMS è visibile come una struttura grigia a forma di U che si estende dalla zona subependimmale al bulbo olfattivo.

L'RMS viene delicatamente microsezionato utilizzando una micro pinza. Una pinza viene utilizzata per stabilizzare la fetta mentre l'altra viene utilizzata per eseguire piccoli tagli attorno all'RMS fino a quando non viene rilasciato dalla fetta. L'RMS asportato viene quindi tagliato in una piccola x di circa 200-500 micrometri di diametro.

In questo esempio, le melanzane sono preparate da topi che esprimono la proteina fluorescente rossa, TD tomato glass. Le piastre inferiori contenenti fette di ospite vengono rimosse dall'incubatore e poste sotto il microscopio da dissezione utilizzando la luce visibile. Viene praticata una piccola incisione nel segmento iniziale dell'RMS e utilizzando un pipettatore dotato di una punta da 20 microlitri, un singolo donatore RMS Explan viene trasferito nel sito inciso nell'RMS ospite.

L'explan viene spinto delicatamente nell'incisione per stabilire il contatto tra i due tessuti. Per garantire che questo contatto sia stabile, gli explan vengono spinti leggermente tra la fetta e la membrana povera nucleare. Le piastre vengono poi riposte nell'incubatrice per almeno un'ora per permettere alle sezioni di depositarsi sulla membrana.

I neuroblasti dovrebbero iniziare a migrare dall'explan all'RMS dell'ospite dopo circa una o due ore. La migrazione delle celle viene visualizzata al meglio utilizzando una distanza di lavoro extra lunga di 20 obiettivi di potenza. I prodotti tissutali in coltura vengono trasferiti dall'incubatore a una camera incubata al microscopio.

I neuroblasti fluorescenti possono essere visualizzati a intervalli che vanno da zero a 10 minuti a seconda del tipo di analisi desiderata. Il nostro protocollo di coltura di fette tipiche organiche è stato accuratamente testato e ottimizzato negli ultimi anni per garantire la coerenza del modello di migrazione e l'orientamento nell'RMS. In questo esempio, l'analisi delle cellule immigrate da explan, ottenuta da topi in cui il pomodoro TD è espresso sotto il nido nel promotore, rivela una migrazione altamente orientata e rapida nel RMS ospite.

Alto ingrandimento. L'analisi time lapse mostra un'eccellente risoluzione dell'intera lunghezza di un neuroblasto in migrazione durante una sessione di imaging di 20 minuti. Una volta completato l'imaging, le fette di pelle devono essere fissate con ghiaccio, freddo e appena preparato, paraforma al 4%, aldeide e immunocolorazione per i diversi componenti del flusso di migrazione.

In questo caso, gli astrociti GFAP positivi in blu e i vasi sanguigni CD 31 positivi in verde vengono rivelati utilizzando l'immunoistochimica fluorescente, l'analisi ad alto ingrandimento di fette colorate per le proteine del citoscheletro actina in blu e la tubulina in verde rivelano l'espressione non uniforme di questi componenti da parte di una cellula. Nel bel mezzo della migrazione. Il nostro protocollo presenta alcune sfide che richiedono pazienza, pratica e tempo dedicato sia alla preparazione che all'analisi dei risultati.

Ecco quindi alcuni suggerimenti utili che ti aiuteranno a ottenere i migliori risultati dai tuoi esperimenti. Nella nostra esperienza, i topi nella fascia di età da P 1 a P 10 forniscono i migliori risultati. La corrispondenza dell'età tra il cervello del donatore e quello del ricevente migliora anche la riproducibilità degli esperimenti.

Poiché la maggior parte dei reagenti e delle piastre di coltura devono essere preparati al momento, il nostro saggio di fetta richiede diverse ore di preparazione e imaging ininterrotti in un solo giorno. Una volta che i cervelli sono stati raccolti, i passaggi successivi devono essere compiuti il più velocemente possibile. Tra la decapitazione e la preparazione delle fette, tutti i passaggi devono essere eseguiti utilizzando ghiaccio, reagenti freddi e la manipolazione dei tessuti deve essere ridotta al minimo per evitare interruzioni anatomiche.

Gli strumenti utilizzati per queste dissezioni devono essere sterili e riservati solo alle manipolazioni di tessuti vivi. Non utilizzare mai strumenti che sono mai stati a contatto con fissativi come la formaldeide. Le fette sono generalmente vitali per un massimo di 36 ore con un calo visibile della migrazione, della velocità e dell'orientamento tra le 24 e le 36 ore.

Fai attenzione a questa limitazione quando pianifichi i tuoi esperimenti e le tue analisi.