Name: Tecnica Heterokaryon per lanalisi di cellule tipo-specifica localizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri la tecnica dell'eterocarione per analizzare la localizzazione proteica specifica per tipo cellulare e il trasporto nucleocitoplasmatico mediante fusione cellulare con polietilenglicole e microscopia a fluorescenza.

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Vorremmo ringraziare il Worcester Polytechnic Institute Dipartimento di Chimica e Biochimica per il finanziamento.

1. Trasfezione di linee cellulari Transfection Metodo 1 (Nucleofection Lonza per una maggiore efficienza di trasfezione delle cellule primarie) <ol><li> Le cellule devono essere di passaggio recente e in crescita log fase prima di trasfezione. Lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e le cellule raccolta da tripsinizzazione. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 5 minuti. </li><li> Aggiungi scivola copertura sterile per un 6-pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata. Luogo 1,5 mL di terreni di coltura (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)) in ciascun pozzetto ed equilibrare i media nell'incubatrice. </li><li> Raccogliere le cellule tripsinizzazione e risospendere in un volume minimo di tampone fosfato (PBS). </li><li> Contare le celle e centrifugare la giusta quantità di risospensione di fornire ~ 5x10 5 cellule per campione. </li><li> Risospendere le cellule con cura in 100 ul soluzione Nucleofector temperatura ambiente per campione. </li><li> Combina 100 l di sospensione cellulare con 5 mg di DNA plasmidico e trasferimento del campione ad un Cuvette Nucleofector facendo attenzione a non includere bolle d'aria. </li><li> Selezionare il programma appropriato Nucleofector (questo potrebbe richiedere test precedenti di stabilire l'efficienza ottimale di trasfezione con mortalità minima). </li><li> Inserire la cuvetta contenente la cella / DNA sospensione nella portacuvette Nucleofector e avviare il programma selezionato. </li><li> Al termine, rimuovere la cuvetta e aggiungere circa 500 ml di pre-equilibrato terreni di coltura ad esso (tratto dal 6 pozzetti). </li><li> Trasferire immediatamente il campione in 6 pozzetti con volume finale di 1,5 mL per pozzetto. Le cellule devono essere placcato in entrambe le popolazioni miste o separatamente, per i controlli. </li></ol> Trasfezione Metodo 2 (Qiagen trasfezione Effectene per linee cellulari) <ol><li> Preparare complessi trasfezione utilizzando il reagente Qiagen Effectene in primo luogo l'aggiunta di 0,8 mg di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di buffer CE. </li><li> Aggiungere 6,4 microlitri di reagente enhancer a ciascun campione, miscelare brevemente muovendo il tubo, e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 microlitri di reagente Effectene ad ogni mix campione, muovendo il tubo, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante questa incubazione, preparare le due linee cellulari di interesse per la trasfezione. Lavare le cellule recentemente diversi passaggi (&lt;80% confluenza), una volta in tampone fosfato (PBS). Aggiungi nuovo mezzo fresco 1,5 ml di crescita equilibrata e riscaldato (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)). </li><li> Una volta che i complessi trasfezione hanno incubato per 15 minuti, trasferire 1,2 ml di media per ogni campione. Mescolare pipettando, e trasferire immediatamente ~ 700 ml di complessi a ciascuno dei due pozzi nel 6 pozzetti. Aggiungere goccia a goccia, e mescolare delicatamente facendo roteare il piatto. Consentono alle cellule di trasfezione per almeno 3 ore (può variare con il tipo di cellula). </li><li> Aggiungi scivola copertura sterilizzati ad un nuovo cambio a 6 pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata. </li><li> Dopo che le cellule sono transfettate, lavare le cellule due volte con PBS e raccogliere le cellule trysinization minimo con l'aggiunta di circa 100 microlitri soluzione tripsina in ogni pozzetto, agitare brevemente la piastra a cappotto completamente ogni bene, e subito aspirando la tripsina. Una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere 1,5 mL di mezzi freschi. </li><li> A questo punto, le cellule devono essere placcato in popolazioni mista o separata (per i controlli) sul coprioggetto sterili. </li><li> Consentono alle cellule di recuperare per 12 ore. </li></ol> 2. Fusione cellulare <ol><li> Togliere terreni di coltura dalle cellule e lavare due volte con PBS. </li><li> A questo punto, si consiglia di trattare le cellule con cicloesimide (100 mg / ml) per inibire la sintesi proteica. Consentire alle cellule di incubare per 2 ore e poi lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Cellule fusibile esponendoli ad una soluzione del 50% polietilenglicole 1000 (PEG 1000) in DMEM senza siero per 125 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS per rimuovere la soluzione di PEG 1000, e aggiungere 2 mL appena scaldato e media equilibrata. </li><li> Consentono alle cellule ad incubare per 18 - 24 ore. </li></ol> Microscopia a fluorescenza <ol><li> Rimuovere i terreni di coltura, e lavare le cellule due volte in PBS. </li><li> Fissare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente per 15 minuti. </li><li> Lavare le cellule fissate due volte in PBS. </li><li> Rimuovere con cautela il coperchio scivola dalla piastra, stoppino in eccesso PBS. Inverti sul microscopio diapositive caricato con una goccia di mezzo di montaggio (90% glicerolo, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-ottano) contenente DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindolo). </li><li> Rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio di diapositive, e sigillare cover scivola con smalto. </li><li> Visualizzare le cellule mediante microscopia confocale o epifluorescenza. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati La Figura 2 mostra un esperimento heterokaryon esempio utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule cellule di carcinoma del polmone. La proteina di interesse in questo esperimento (Anemia di pollo Virus-VP3) mostra la localizzazione citoplasmatica principalmente in tipi di cellule primarie e di localizzazione nucleare in tipi di cellule trasformate come visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza. La proteina è espressa come fusione di due GFP (pEGFP-N1 vettore, Clontech) nei fibroblasti prepuzio primaria (PFF) o DsRed (DsRed-N1 vettore, Clontech) nelle cellule H1299. Campioni di controllo che coinvolge auto-fusioni (prime due righe) Display cellule multinucleate con nessun cambiamento nella steady-state modelli di localizzazione. Tali cambiamenti potrebbero altrimenti verificarsi a causa di sensibilità alle condizioni fusione o la formazione di sincizi. Fusioni Heterokaryon (riga in basso) dimostrano ingresso nucleare della GFP-fuso primario derivati ​​dalle cellule e proteine ​​colocalizzazione con la DsRed-proteina fusa in risposta alla introduzione di materiale cellula trasformata. L'esempio mostrato è una fusione heterokaryon relativamente rara risultante da due sole cellule, uno di ogni tipo, come dimostra la presenza di entrambi i segnali fluoroprotein. Oltre a rilevare questi tipi di transizioni di localizzazione, nucleocytoplasmic attività spola possono essere facilmente individuati dalla presenza di un fluoroforo in questi due nuclei. Questo tipo di dosaggio è chiaro in sede di esame 01:01 la fusione di cellule e dipenderà dalla inibizione della traduzione. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso del metodo heterokaryon utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule di carcinoma. Il gene di interesse viene clonato per produrre un telaio in fusione di uno dei due geni delle proteine ​​fluorescenti. Linee cellulari sono poi transitoriamente trasfettate sia con il permesso di costruire e recuperare. Formazione Heterokaryon è indotta dal trattamento breve con polietilene glicole (PEG), seguita da incubazione ulteriormente. Infine, la localizzazione sub-cellulare della proteina di interesse viene osservata utilizzando varie forme di microscopia a fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Traffico Nucleocytoplasmic e spola attività della proteina di pollo Anemia Virus VP3 visualizzati da fusione heterokaryon. Riga superiore: immagini rappresentative di auto-H1299 fuso cellule che esprimono DsRed-VP3 fila Oriente:.. Rappresentante immagini epifluorescenza di cellule primarie di fibroblasti prepuzio (PFF) che esprime GFP-VP3 dopo la fusione PEG fila in basso: la fusione Heterokaryon di TFP e H1299 cellule. Giallo indica colocalizzazione di GFP e segnali DsRed. Le cellule sono state ripreso usando una Leica AF6000E microscopio a fluorescenza Leica e software di imaging.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
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<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo heterokaryon qui presentato fornisce un metodo efficiente e di facile interpretazione per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici comportamenti di localizzazione e nucleocytoplasmic attività spola. Questo metodo sfrutta la sensibilità di analisi di fluorescenza e la capacità di cellule immagine dal vivo e di eseguire studi di dinamica delle proteine. La tecnica si adatta facilmente a molti tipi di cellule diverse, ed è suscettibile di produrre immagini di cellule in vivo e fissati. Per esempio, invertito microscopia a fluorescenza può essere utilizzato per l&#39;imaging dal vivo e lapse video in tempo. Al contrario, le cellule montate possono essere utilizzate sia in epifluorescenza per la determinazione dello stato stazionario localizzazioni o più dettagliate di imaging confocale di localizzazioni discreti. Inoltre, le tecniche come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), o la perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) può essere utilizzato nella determinazione della cinetica di localizzazione 1. L&#39;incorporazione di fluorofori si alternano nel protocollo permetterebbe di esperimenti di interazione di proteine ​​come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) da svolgere in concerto 2. Vari inibitori del traffico di cellulari come B leptomycin o dominante negativo costruisce GTPasi Ran può essere utilizzato per stabilire la dipendenza da particolari importazioni o esportazioni percorsi 5,6,9. <ul><li> In certi esperimenti che coinvolgono la spola attività, bisogna fare attenzione per evitare gli effetti di localizzazione grazie alla sintesi di nuove proteine. In questi casi, gli inibitori della traduzione o punti di tempo limitato deve essere utilizzato. Tuttavia, artefatti a causa dell&#39;inibizione traslazionale rimanere una possibilità. La fusione di cellule contenenti una di ogni tipo cellulare sono più ambite per una chiara interpretazione della spola e del comportamento di localizzazione. Ottimizzazione del numero di cellule e le condizioni di fusione (tempi e concentrazione) può essere necessario per promuovere tale favorevole eventi di fusione 1:1. </li><li> E &#39;importante notare che l&#39;ottimizzazione di alcune fasi del protocollo sarà necessario a seconda delle particolari tipi di cellule usate. Aspetti della procedura sperimentale come l&#39;efficienza di fusione, l&#39;efficienza di trasfezione e vitalità dopo la fusione può variare notevolmente tra i tipi di cellule. In particolare, i tipi di cellule primarie può essere difficile da gestire a causa delle condizioni cultura complessa e bassa efficienza di trasfezione. Utilizzo di tecnologie come il dispositivo Lonza Nucleofector può permettere per l&#39;elaborazione rapida delle cellule così come l&#39;efficienza di transfezione aumentato drammaticamente. Inoltre, i metodi di elettroporazione consente un facile trasferimento di cellule in sospensione ai passi fusione che seguono. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>reagente Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle&amp;rsquo;mezzo s (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Glucosio elevato</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Siero Hyclone (bovino fetale)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Falcon a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene glicole 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector HDF</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

tecnica heterokaryon per l&#39;analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Un numero significativo di proteine ​​sono regolate dal traffico subcellulare o nucleocytolasmic spola. Queste proteine ​​visualizzare una gamma diversificata di funzioni cellulari incluse l&#39;importazione nucleare / esportazione di RNA e proteine, regolazione trascrizionale, e l&#39;apoptosi. È interessante notare che importanti riorganizzazioni cellulari tra cui la divisione cellulare, differenziamento e trasformazione, spesso comportano tali attività 3,4,8,10. Lo studio dettagliato di queste proteine ​​e rispettivi meccanismi normativi può essere impegnativo come la stimolazione di questi cambiamenti di localizzazione possono essere sfuggente, ei movimenti si può essere molto dinamici e difficili da monitorare. Studi che hanno coinvolto oncogenesi cellulare, ad esempio, continueranno a beneficiare di percorsi di comprensione e di attività delle proteine ​​che differiscono tra normali cellule primarie e cellule trasformate 6,7,11,12. Come molte proteine ​​mostrano la localizzazione alterato durante la trasformazione o come risultato della trasformazione, dei metodi per caratterizzare in modo efficiente queste proteine ​​e le vie a cui partecipano stand per migliorare la comprensione di oncogenesi e aprire nuovi settori di drug targeting. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;analisi del traffico di proteine ​​e attività spola tra le cellule di mammifero primarie e trasformate. Questo metodo combina la generazione di fusioni heterokaryon con microscopia a fluorescenza per fornire un protocollo flessibile che può essere utilizzato per rilevare localizzazioni proteine ​​allo stato stazionario o dinamico. Come mostrato nella Figura 1, due tipi di cellule separate sono transitoriamente transfettate con costrutti plasmide recante il gene fluoroprotein collegato al gene di interesse. Dopo l&#39;espressione, le cellule si fondono con glicole polietilenico, e localizzazioni delle proteine ​​possono poi essere ripreso con una varietà di metodi. Il protocollo presentato qui è un approccio fondamentale in cui le tecniche speciali, può essere aggiunto.

Un metodo flessibile ed efficiente per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici di localizzazione di proteine ​​e nucleocytoplasmic spola è descritto. Questo approccio heterokaryon utilizza proteine ​​di fusione fluorescenza-etichettati in modo da localizzazioni proteina immagine dopo la fusione cellulare. Il protocollo è suscettibile di steady-state localizzazioni o più determinazioni dinamici basati sull&#39;imaging cellule vive.

Tecnica Heterokaryon per l&#39;analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

Un numero significativo di proteine è regolato dal traffico subcellulare o dal shuttle nucleocitoplasmatico. Queste proteine presentano una gamma diversificata di...

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire il movimento delle proteine esprimendone una singola che porta due diversi fluorocromi in due linee cellulari distinte e fondendo successivamente queste linee cellulari. Ciò si ottiene innanzitutto trasfettando plasmidi contenenti il gene d'interesse fuso a uno dei due geni di proteine fluorescenti in due tipi cellulari separati. Il secondo passaggio della procedura consiste nel mescolare le cellule insieme e permettere a ciascun tipo cellulare di accumulare la proteina.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'inibire la sintesi proteica, quindi fondere le cellule utilizzando polietilene glicole. L'ultimo passaggio della procedura è visualizzare la localizzazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano alterazioni della localizzazione proteica o del comportamento di traffico attraverso la microscopia a fluorescenza.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, ad esempio in che modo le funzioni e il comportamento delle proteine cambiano in modo distinto durante la trasformazione cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cambiamenti specifici delle cellule trasformate, può essere applicato anche ad altri ambiti di studio, come la differenziazione cellulare, la biologia dello sviluppo e la segnalazione cellulare.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché sarà necessaria l'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione e di fusione per ogni diverso tipo cellulare. Il primo metodo illustrato in questo protocollo per l'introduzione del DNA plasmidico nelle cellule è il metodo NU Nuclear Affection, che utilizza la soluzione effettore nucleare lonza per avviare il lavaggio delle cellule recentemente passaggiate e in crescita logaritmica con soluzione salina tamponata al fosfato PBS e per raccoglierle mediante izzazione. Una volta che le cellule hanno perso l'adesività, neutralizzare la tripsina aggiungendo un mezzo contenente siero e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1500 G per cinque minuti mentre le cellule vengono centrifugate.Aggiungere coprioggetti sterilizzati in una piastra a sei pozzetti nell'ambiente asettico, quindi pipettare 1,5 millilitri di terreno di coltura completo in ciascun pozzetto. Coprire la piastra e trasferirla nell'incubatrice per colture cellulari per l'equilibrazione.Dopo la centrifugazione, trasferire le provette nella cappa, aspirare il soprannatante e risospendere i pellet cellulari in un volume minimo di PBS. Successivamente, contare le cellule e aliquotare il volume di sospensione cellulare in provette sterili per microcentrifuga. Questo fornirà circa cinque volte 10 alla quinta cellule per campione; centrifugare nuovamente a 1500 ×g per cinque minuti.Al termine della centrifugazione, posizionare i tubi nell'incubatore per colture cellulari, aspirare l'SNA e risospendere delicatamente. Sospendere le cellule in ciascun tubo con 100 microlitri di soluzione nucleare effettore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere cinque microgrammi di DNA plasmidico a ciascun campione e trasferire il campione in un vial Q per effettore nucleare e coprire.Si presti attenzione ad evitare bolle d'aria. Inserire la provetta del campione nel portaprovette Q vet. Selezionare il programma dell'effettore nucleare appropriato e avviarlo.La selezione del programma più appropriato potrebbe richiedere test preliminari per stabilire un'efficienza di trasfezione ottimale con una mortalità minima. Successivamente, seminare le cellule in una piastra a sei pozzetti, sia in popolazioni miste sia separatamente come controlli. Riporre la piastra nell'incubatore e lasciare che le cellule si riprendano per 12 ore.Il secondo metodo dimostrato per l'espressione transitoria di plasmidi è la trasfezione con reagente kagen. Per iniziare, aggiungere 0,8 microgrammi di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di tampone EC in un tubo fuge sterile. Quindi aggiungere 6,4 microlitri di reagente potenziatore a ciascun campione.Mescolare brevemente agitando il tubo e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Al termine di questa breve incubazione, aggiungere 20 microlitri di reagente attivatore a ciascun campione. Mescolare ogni tubo agitandolo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Durante l'incubazione, preparare le due linee cellulari da utilizzare nell'esperimento. Per la trasfezione, le cellule devono essere state recentemente passaggiate e trovarsi in fase di crescita logaritmica a una confluenza di circa l'80%. Lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere nuovamente 1,5 millilitri di DMEM fresco contenente il 10% di FBS.Ora che i reagenti per la trasfezione del DNA hanno incubato per 15 minuti, aggiungere 1,2 millilitri di mezzo DMEM più FBS al 10% a ciascun campione, mescolando con una pipetta, e trasferire immediatamente circa 700 microlitri dei complessi in ciascuna delle due pozzette. Nella piastra a sei pozzette, mescolare agitando delicatamente la piastra. Lasciare che le cellule vengano trasfettate per almeno tre ore nell'incubatore all'interno della cappa a flusso laminare; se necessario, posizionare un'ansa sterile per pozzetta in una piastra a sei pozzette.Le lamelle rivestite possono essere utilizzate per migliorare l'adesione cellulare. Successivamente, lavare le cellule trasfettate due volte in PBS ed isolare le cellule mediante una minima azione della tripsina. Questo passaggio viene effettuato aggiungendo 100 microlitri di soluzione di tripsina in ogni pozzetto, agitando la piastra per assicurare una copertura completa.Quindi aspirare immediatamente la tripsina residua. Neutralizzare la tripsina rimanente risospendendo le cellule in 1,5 millilitri di DMEM fresco con il 10% di FBS, quindi piastrare le cellule in popolazioni miste o separatamente come controlli. Nella piastra a sei pozzetti contenente coprivetrini, lasciare che le cellule si riprendano per 12 ore nell'incubatrice per colture cellulari.Indipendentemente dal metodo di trasfezione, la procedura per la generazione di infusioni di eterocarioti è la stessa. Dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo di coltura dalle pozzette e lavare le cellule due volte con PBS. Successivamente, si raccomanda di trattare le cellule con cicloeside per inibire la sintesi proteica ulteriore.Aggiungere cyclo heide a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro nel mezzo di coltura in modo da coprire le cellule e incubare per due ore nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due ore, rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule due volte con PBS. Per avviare la fusione, coprire le cellule con una soluzione di polietilene glicole 1000 al 50% in DMEM privo di siero e incubare per 125 secondi.A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di PEG e lavare le cellule con PBS per eliminare il residuo di peg. Quindi aggiungere due millilitri di DMEM contenente FBS al 10%, preriscaldato a 37 gradi Celsius. Incubare le cellule da 18 a 24 ore nell'incubatrice per colture cellulari.Dopo l'incubazione di 18-24 ore, prelevare la piastra dall'incubatore e lavare le cellule due volte con PBS. Successivamente, pipettare un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS in ogni pozzetto e agitare delicatamente per 15 minuti.Durante l'incubazione, preparare i vetrini aggiungendo una singola goccia di mezzo di montaggio contenente dpi. Quindi lavare le cellule fissate due volte con PBS ed eliminare con attenzione ogni coprioggetto utilizzando pinzette piccole. Asportare con un pezzo di carta da filtro il PBS residuo prima di posizionare il coprioggetto con le cellule rivolte verso il basso su un vetrino contenente mezzo di montaggio più tappi.Rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso dal vetrino con carta da filtro e sigillare i bordi dei coprioggetti. Con lo smalto per unghie, le cellule possono ora essere visualizzate mediante microscopia confocale o a fluorescenza in epifluorescenza. In questo diagramma di flusso, il metodo etero per l'analisi della localizzazione specifica del tipo cellulare delle proteine è mostrato in tre passaggi fondamentali.Trasfezione del plasmide che esprime una proteina marcata con un fluorocromo e fusione cellulare con polietilene glicole 1000, seguita da acquisizione di immagini mediante microscopia fluorescente, come mostrato in queste immagini di fluorescenza episcopica. Nei fibroblasti primari del prepuzio, i controlli autofusi che esprimono la proteina VP3 del virus dell'anoxia del pollo marcata con GFP mostrano una localizzazione prevalentemente citoplasmatica della proteina nella linea di carcinoma polmonare a cellule non piccole H 1299. I controlli autofusi con la stessa proteina VP3 marcata con DS.RED mostrano invece una localizzazione prevalentemente nucleare. La fusione eterocariotica tra fibroblasti primari del prepuzio e cellule H 1299 comporta l'introduzione di materiale cellulare trasformato nei fibroblasti primari e induce un cambiamento nella localizzazione della proteina VP3 derivata dalla cellula primaria e marcata con GFP, che si sposta verso il nucleo.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il successo dipenderà fortemente dall'efficienza di trasfezione nei tipi cellulari specifici utilizzati, nonché dall'ottimizzazione delle condizioni di fusione per queste particolari cellule. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come flip e frap per rispondere a ulteriori domande relative all'analisi in tempo reale della dinamica di localizzazione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare le localizzazioni proteiche specifiche per tipo cellulare introducendo proteine marcate con fluorocromi e generando fusioni cellulari.

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Il video mostra un metodo per isolare nuclei intatti da cellule gliali e staminali nel giro dentato (DG) dell'ippocampo di topo. Il tessuto DG viene dissociato meccanicamente in un tampone di omogeneizzazione freddo per rilasciare i nuclei. I detriti tissutali e gli altri organelli rilasciati vengono scartati e i nuclei vengono colorati con una colorazione del DNA e un anticorpo coniugato con fluorofori specifico per l'antigene nucleare neuronale (NeuN). Lo smistamento dei nuclei attivati dalla...

Una tecnica per isolare nuclei da cellule non neuronali nel giro dentato dell'ippocampo

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la tecnica di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare tipi specifici di cellule neurali per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dei marcatori epigenetici e/o dell'espressione proteica.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Presentiamo un protocollo di colorazione e analisi per la microscopia di localizzazione a singola molecola della cromatina a tre colori (SMLM) che consente la mappatura riproducibile di eucromatina, eterocromatina e RNAP II per l'analisi spaziale. Questo protocollo consente un'efficiente marcatura multicolore in ambienti nucleari densi, inclusi bersagli associati alla cromatina, consentendo una rilevazione simultanea affidabile.

Un protocollo di microscopia a localizzazione di molecole singole multimarcatore per l'indagine della cromatina nell'ambiente nucleare denso

Riportiamo un protocollo di diffusione della metafase DNA-FISH che rileva visivamente il numero di copie e la posizione del locus all'interno del genoma. Questo approccio consente la risoluzione a singola cellula degli stati di amplificazione, in particolare nelle linee cellulari tumorali contenenti DNA extracromosomico e regioni di colorazione omogenea.

La metafase DNA-FISH si diffonde per distinguere il DNA extracromosomico dalle regioni di colorazione omogenea nelle linee cellulari tumorali umane

Scopri la tecnica dell'eterocarione per analizzare la localizzazione proteica specifica per tipo cellulare e il trasporto nucleocitoplasmatico mediante fusione cellulare con polietilenglicole e microscopia a fluorescenza.

Tecnica Heterokaryon per l'analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

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