Tecnica Heterokaryon per l'analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire il movimento delle proteine esprimendone una singola che porta due diversi fluorocromi in due linee cellulari distinte e fondendo successivamente queste linee cellulari. Ciò si ottiene innanzitutto trasfettando plasmidi contenenti il gene d'interesse fuso a uno dei due geni di proteine fluorescenti in due tipi cellulari separati. Il secondo passaggio della procedura consiste nel mescolare le cellule insieme e permettere a ciascun tipo cellulare di accumulare la proteina.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'inibire la sintesi proteica, quindi fondere le cellule utilizzando polietilene glicole. L'ultimo passaggio della procedura è visualizzare la localizzazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano alterazioni della localizzazione proteica o del comportamento di traffico attraverso la microscopia a fluorescenza.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, ad esempio in che modo le funzioni e il comportamento delle proteine cambiano in modo distinto durante la trasformazione cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cambiamenti specifici delle cellule trasformate, può essere applicato anche ad altri ambiti di studio, come la differenziazione cellulare, la biologia dello sviluppo e la segnalazione cellulare.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché sarà necessaria l'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione e di fusione per ogni diverso tipo cellulare. Il primo metodo illustrato in questo protocollo per l'introduzione del DNA plasmidico nelle cellule è il metodo NU Nuclear Affection, che utilizza la soluzione effettore nucleare lonza per avviare il lavaggio delle cellule recentemente passaggiate e in crescita logaritmica con soluzione salina tamponata al fosfato PBS e per raccoglierle mediante izzazione. Una volta che le cellule hanno perso l'adesività, neutralizzare la tripsina aggiungendo un mezzo contenente siero e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1500 G per cinque minuti mentre le cellule vengono centrifugate.

Aggiungere coprioggetti sterilizzati in una piastra a sei pozzetti nell'ambiente asettico, quindi pipettare 1,5 millilitri di terreno di coltura completo in ciascun pozzetto. Coprire la piastra e trasferirla nell'incubatrice per colture cellulari per l'equilibrazione.

Dopo la centrifugazione, trasferire le provette nella cappa, aspirare il soprannatante e risospendere i pellet cellulari in un volume minimo di PBS. Successivamente, contare le cellule e aliquotare il volume di sospensione cellulare in provette sterili per microcentrifuga. Questo fornirà circa cinque volte 10 alla quinta cellule per campione; centrifugare nuovamente a 1500 ×g per cinque minuti.

Al termine della centrifugazione, posizionare i tubi nell'incubatore per colture cellulari, aspirare l'SNA e risospendere delicatamente. Sospendere le cellule in ciascun tubo con 100 microlitri di soluzione nucleare effettore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere cinque microgrammi di DNA plasmidico a ciascun campione e trasferire il campione in un vial Q per effettore nucleare e coprire.

Si presti attenzione ad evitare bolle d'aria. Inserire la provetta del campione nel portaprovette Q vet. Selezionare il programma dell'effettore nucleare appropriato e avviarlo.

La selezione del programma più appropriato potrebbe richiedere test preliminari per stabilire un'efficienza di trasfezione ottimale con una mortalità minima. Successivamente, seminare le cellule in una piastra a sei pozzetti, sia in popolazioni miste sia separatamente come controlli. Riporre la piastra nell'incubatore e lasciare che le cellule si riprendano per 12 ore.

Il secondo metodo dimostrato per l'espressione transitoria di plasmidi è la trasfezione con reagente kagen. Per iniziare, aggiungere 0,8 microgrammi di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di tampone EC in un tubo fuge sterile. Quindi aggiungere 6,4 microlitri di reagente potenziatore a ciascun campione.

Mescolare brevemente agitando il tubo e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Al termine di questa breve incubazione, aggiungere 20 microlitri di reagente attivatore a ciascun campione. Mescolare ogni tubo agitandolo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Durante l'incubazione, preparare le due linee cellulari da utilizzare nell'esperimento. Per la trasfezione, le cellule devono essere state recentemente passaggiate e trovarsi in fase di crescita logaritmica a una confluenza di circa l'80%. Lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere nuovamente 1,5 millilitri di DMEM fresco contenente il 10% di FBS.

Ora che i reagenti per la trasfezione del DNA hanno incubato per 15 minuti, aggiungere 1,2 millilitri di mezzo DMEM più FBS al 10% a ciascun campione, mescolando con una pipetta, e trasferire immediatamente circa 700 microlitri dei complessi in ciascuna delle due pozzette. Nella piastra a sei pozzette, mescolare agitando delicatamente la piastra. Lasciare che le cellule vengano trasfettate per almeno tre ore nell'incubatore all'interno della cappa a flusso laminare; se necessario, posizionare un'ansa sterile per pozzetta in una piastra a sei pozzette.

Le lamelle rivestite possono essere utilizzate per migliorare l'adesione cellulare. Successivamente, lavare le cellule trasfettate due volte in PBS ed isolare le cellule mediante una minima azione della tripsina. Questo passaggio viene effettuato aggiungendo 100 microlitri di soluzione di tripsina in ogni pozzetto, agitando la piastra per assicurare una copertura completa.

Quindi aspirare immediatamente la tripsina residua. Neutralizzare la tripsina rimanente risospendendo le cellule in 1,5 millilitri di DMEM fresco con il 10% di FBS, quindi piastrare le cellule in popolazioni miste o separatamente come controlli. Nella piastra a sei pozzetti contenente coprivetrini, lasciare che le cellule si riprendano per 12 ore nell'incubatrice per colture cellulari.

Indipendentemente dal metodo di trasfezione, la procedura per la generazione di infusioni di eterocarioti è la stessa. Dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo di coltura dalle pozzette e lavare le cellule due volte con PBS. Successivamente, si raccomanda di trattare le cellule con cicloeside per inibire la sintesi proteica ulteriore.

Aggiungere cyclo heide a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro nel mezzo di coltura in modo da coprire le cellule e incubare per due ore nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due ore, rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule due volte con PBS. Per avviare la fusione, coprire le cellule con una soluzione di polietilene glicole 1000 al 50% in DMEM privo di siero e incubare per 125 secondi.

A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di PEG e lavare le cellule con PBS per eliminare il residuo di peg. Quindi aggiungere due millilitri di DMEM contenente FBS al 10%, preriscaldato a 37 gradi Celsius. Incubare le cellule da 18 a 24 ore nell'incubatrice per colture cellulari.

Dopo l'incubazione di 18-24 ore, prelevare la piastra dall'incubatore e lavare le cellule due volte con PBS. Successivamente, pipettare un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS in ogni pozzetto e agitare delicatamente per 15 minuti.

Durante l'incubazione, preparare i vetrini aggiungendo una singola goccia di mezzo di montaggio contenente dpi. Quindi lavare le cellule fissate due volte con PBS ed eliminare con attenzione ogni coprioggetto utilizzando pinzette piccole. Asportare con un pezzo di carta da filtro il PBS residuo prima di posizionare il coprioggetto con le cellule rivolte verso il basso su un vetrino contenente mezzo di montaggio più tappi.

Rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso dal vetrino con carta da filtro e sigillare i bordi dei coprioggetti. Con lo smalto per unghie, le cellule possono ora essere visualizzate mediante microscopia confocale o a fluorescenza in epifluorescenza. In questo diagramma di flusso, il metodo etero per l'analisi della localizzazione specifica del tipo cellulare delle proteine è mostrato in tre passaggi fondamentali.

Trasfezione del plasmide che esprime una proteina marcata con un fluorocromo e fusione cellulare con polietilene glicole 1000, seguita da acquisizione di immagini mediante microscopia fluorescente, come mostrato in queste immagini di fluorescenza episcopica. Nei fibroblasti primari del prepuzio, i controlli autofusi che esprimono la proteina VP3 del virus dell'anoxia del pollo marcata con GFP mostrano una localizzazione prevalentemente citoplasmatica della proteina nella linea di carcinoma polmonare a cellule non piccole H 1299. I controlli autofusi con la stessa proteina VP3 marcata con DS.RED mostrano invece una localizzazione prevalentemente nucleare. La fusione eterocariotica tra fibroblasti primari del prepuzio e cellule H 1299 comporta l'introduzione di materiale cellulare trasformato nei fibroblasti primari e induce un cambiamento nella localizzazione della proteina VP3 derivata dalla cellula primaria e marcata con GFP, che si sposta verso il nucleo.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il successo dipenderà fortemente dall'efficienza di trasfezione nei tipi cellulari specifici utilizzati, nonché dall'ottimizzazione delle condizioni di fusione per queste particolari cellule. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come flip e frap per rispondere a ulteriori domande relative all'analisi in tempo reale della dinamica di localizzazione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare le localizzazioni proteiche specifiche per tipo cellulare introducendo proteine marcate con fluorocromi e generando fusioni cellulari.