Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth
29 marzo 2011
Sistemi olfattivi degli insetti offrono opportunità uniche per la registrazione di odorizzante-indotto risposte nelle forme di electroantennograms (EAG) e le registrazioni sensillum singolo (SSR), che vengono sommati risposte da tutti i neuroni olfattivi (ORNs) situato sulla antenna e da quelli alloggiati in singole sensilli, rispettivamente.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare la facilità con cui è possibile registrare risposte olfattive dal sistema nervoso degli insetti. Questo risultato si ottiene immobilizzando una falena viva e collegando degli elettrodi all'antenna o a un singolo neurone per registrare le risposte indotte da odori. Come primo passo, un elettrodo di vetro riempito di soluzione salina viene inserito nell'occhio come riferimento di massa; come secondo passo, una delle falene immobilizzate viene inserita in un elettrodo di vetro riempito di soluzione salina, il che permette di registrare risposte elettriche sotto forma di elettroantennogramma oppure di registrare risposte di unità singole da un neurone recettoriale olfattivo.
L'elettrodo di registrazione viene introdotto alla base di un sole. Successivamente, il segnale dell'antenna viene amplificato e inviato a un convertitore analogico-digitale per registrare e salvare i segnali. I risultati ottenuti mostrano risposte indotte dall'odorante e dipendenti dalla dose, basate sul segnale elettrico registrato sotto forma di segnale EAG o di potenziale d'azione.
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per registrare l'enterogramma dal lepidottero adulto immobilizzato di *Naval orange one*. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la preparazione rimane funzionale per un lungo periodo e lo stesso lepidottero può essere utilizzato più volte per registrare diverse risposte; lo stesso insetto può inoltre essere impiegato per registrare risposte di unità singole da un singolo sensore dell'antenna. Ci siamo concentrati su *Naval orange one* perché rappresenta un'importante specie agricola in California.
Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato anche per altri insetti fitomizi, non solo per affrontare domande fondamentali sulla funzione olfattiva, ma anche per lo sviluppo di nuovi attrattivi. Questo studio del sistema olfattivo delle falene utilizza il verme arancione navale. Ullo Ella.
La colonia di insetti viene mantenuta con una dieta a base di crusca di grano in camere ambientali a circa 28 gradi Celsius, circa il 75% di umidità relativa e sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Preparare contenitori per le falene appena emerse posizionando fino a 10 strati di salviette di carta inumidite in una scatola di plastica. Raccogliere e determinare il sesso delle falene in via di emergenza quotidianamente, quindi trasferirle nella scatola di plastica. Coprire la scatola con un coperchio forato per consentire la circolazione dell'aria, in preparazione delle registrazioni elettrofisiologiche.
Per prima cosa, preparare un supporto per la farfalla tagliando la punta di una pipetta da 200 microlitri in modo da ottenere un diametro della punta di circa due millimetri. Per EAG o SSR, selezionare una farfalla di due-quattro giorni dopo l'emergenza. Inserire la farfalla nella pipetta dall'estremità opposta alla punta utilizzando un pezzetto di carta assorbente umidificata, quindi spingere delicatamente la farfalla verso la punta della pipetta.
Continuare a spingere la falena finché le antenne e una parte della testa sporgono dalla punta; immobilizzare la testa esposta coprendola con argilla non essiccante, lasciando esposta una piccola parte di un occhio e le due antenne. Posizionare il preparato della falena sulla piattaforma del micromanipolatore per elettrogramma tra i due supporti per elettrodi, utilizzando elettrodi di vetro con diametro della punta inferiore a un micron. Riempire gli elettrodi posteriormente con ringer per arti centum.
Attraverso il microscopio, impalare l'area esposta dell'occhio con un elettrodo. Questo funge da elettrodo di riferimento. Il passo successivo consiste nel posizionare gli elettrodi di registrazione sulle antenne.
L'antenna del maschio della tignola arancione della noce è multisegmentata e ogni segmento è ornato da un gran numero di strutture simili a peli. L'illa, nell'inserito, è una microfotografia al microscopio elettronico a scansione che mostra i dettagli dell'illa per facilitare la registrazione dalle antenne. Tagliare l'uno o due segmenti tenali distali.
Successivamente, inserire entrambe le antenne nell'elettrodo di registrazione. In alternativa, per registrazioni da un singolo sensillo, inserire l'elettrodo di registrazione alla base di un sensillo. I potenziali d'azione provenienti dal sensillo vengono amplificati da un preamplificatore ad alta impedenza e inviati a un convertitore analogico-digitale intelligente USB per essere analizzati in modalità offline mediante il software autos spike.
Il passo successivo consiste nel preparare lo stimolo chimico utilizzando ZZ 1113 HEXA deca Now, un componente principale della miscela di feromoni femminili del verme dell'arancia navale; diluire il composto con esano per ottenere diluizioni DIC. Caricare un'eloqua da 10 microlitri di soluzione stimolante su una carta filtrante Watman. Rimuovere il solvente evaporandolo delicatamente agitando per 10 secondi.
Sotto cappa, posizionare la striscia in una siringa di polipropilene da cinque millilitri, esano puro e una siringa vuota come controllo per la preparazione. L'EAG o l'SSR vengono mantenuti in una corrente d'aria umidificata erogata dal controllore dello stimolo alla velocità di 20 millilitri al secondo. Collegare la siringa contenente lo stimolo chimico al controllore della corrente d'aria.
Registrare due secondi di segnali elettrici di base. Successivamente, aggiungere un impulso stimolante di quattro millilitri al secondo alla corrente d'aria per 500 millisecondi. Continuare la registrazione dei segnali elettrici per altri otto secondi.
Attendere almeno un minuto tra una stimolazione e l'altra. Questa figura mostra una risposta robusta, dipendente dalla dose, proveniente dalle antenne di una falena maschio immobilizzata. Stimolata con il componente del feromone femminile, CZ 1113 hexaco.
La risposta all'esano. Il controllo del veicolo è mostrato dalla linea blu in successione. Dosi maggiori del feromone producono registrazioni elettrografiche progressivamente più elevate.
Questa figura mostra le registrazioni extracellulari di singola unità da un tric andum in risposta alla stimolazione con un componente del feromone femminile. Queste registrazioni mostrano una risposta eccitatoria dipendente dalla dose. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio d'ore se effettuata correttamente.
Quando si utilizza questo metodo, assicurarsi di evitare contaminazioni e di usare sostanze chimiche il più pure possibile.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrato il processo di registrazione delle risposte olfattive dal sistema nervoso degli insetti, utilizzando specificamente le falene. La metodologia prevede l'immobilizzazione di una falena viva e l'utilizzo di elettrodi per catturare le risposte indotte da sostanze odorose.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Sistemi olfattivi
Sfondo
- Gli insetti possiedono sistemi olfattivi complessi.
- Il potenziale elettroantennografico (EAG) e le registrazioni da singolo sensillo (SSR) sono tecniche fondamentali.
- Questi metodi permettono lo studio dei neuroni recettori degli odoranti (ORNs).
- Comprendere l'olfatto negli insetti può fornire informazioni sui processi sensoriali.
Scopo dello studio
- Illustrare la facilità di registrazione delle risposte olfattive negli insetti.
- Dimostrare l'uso di elettrodi per acquisire segnali elettrici.
- Analizzare le risposte dipendenti dalla dose a diversi odoranti.
Metodi Utilizzati
- Trattenere un esemplare vivente di farfalla per l'esperimento.
- Utilizzare elettrodi di vetro riempiti con soluzione salina per la registrazione.
- Piazzare un elettrodo nell'occhio a scopo di messa a terra.
- Amplificare i segnali delle antenne e convertirli per l'analisi.
Risultati principali
- Registrazioni riuscite di risposte elettriche provenienti dai neuroni olfattivi (ORN).
- Dimostrazione di risposte dose-dipendenti agli odoranti.
- Registrazione di segnali sotto forma di risposte EAG e potenziali d'azione.
Conclusioni
- La metodologia è efficace per lo studio delle risposte olfattive.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'elaborazione olfattiva negli insetti.
- Ulteriori ricerche possono ampliare queste scoperte.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le misurazioni elettrofisiologiche provenienti dai sistemi olfattivi degli insetti consentono una rilevazione ad alta fedeltà delle risposte neurali indotte da odoranti, supportando la validazione degli obiettivi nel controllo dei parassiti e nella scoperta di agrochimici. L'approccio fornisce letture quantitative e dipendenti dalla dose che facilitano l'eliminazione dei rischi meccanicistici nei percorsi sensoriali e una maggiore affidabilità predittiva nella selezione dei composti promettenti. Questo metodo migliora la continuità traslazionale collegando l'interazione con la molecola bersaglio agli output comportamentali funzionali in specie di rilevanza agricola.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione dei neuroni recettori degli odori per convalidare i bersagli molecolari coinvolti nella trasduzione del segnale chemiosensoriale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico confermando l'interazione con il bersaglio mediante letture elettrofisiologiche dirette.
- Valore predittivo: Le risposte dose-dipendenti permettono la valutazione della relazione struttura-attività e la selezione dei composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi olfattivi validati per lo screening riproducibile ed ad alta sensibilità di librerie di odoranti.
- Output quantitativo: Genera segnali di elettroantennogramma (EAG) e di registrazione da singolo sensillo (SSR) come parametri misurabili per la valutazione dei composti.
- Scalabilità: Consente l'uso ripetuto di singole preparazioni, supportando campagne di screening longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Sistema Rilevante per la Malattia: Utilizza il verme arancione navale, un parassita agricolo chiave, per modellare comportamenti guidati dalla chemosensibilità rilevanti per l'efficacia sul campo.
- Allineamento del Biomarcatore Translazionale: Collega le risposte elettrofisiologiche a esiti comportamentali come attrazione o repellenza.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla validazione funzionale di bersagli sensoriali in contesti ecologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una validazione funzionale dei bersagli olfattivi prima dello screening dei composti e dell'ottimizzazione del composto promettente.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui meccanismi dei recettori degli odoranti e la chiarificazione dei percorsi nella chemosensibilità degli insetti.
- Screening: Fornisce output elettrofisiologici standardizzati e riproducibili per lo screening di librerie di composti su sistemi sensoriali nativi.
- Analisi: Permette il confronto quantitativo delle relazioni dose-risposta per supportare l'identificazione dei composti promettenti e la classificazione della potenza.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attività neuronale ai fenotipi comportamentali, sostenendo la validazione preclinica di strategie di controllo dei parassiti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening trasversale a diversi progetti di semiochimici e modulatori del comportamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sul rilevamento degli odoranti, riducendo l'ambiguità nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione del saggio e la durata della preparazione, consentendo registrazioni su più giorni e in diverse condizioni a partire da singoli campioni.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza nella selezione degli obiettivi, riducendo l'abbandono in fase avanzata dello sviluppo di agrochimici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sui dati dei composti in base alle risposte sensoriali funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, microchirurgia e manipolazione di insetti.
- È dipendente da amplificatori ad alta impedenza, convertitori analogico-digitali e sistemi di somministrazione degli stimoli.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione degli stimoli e l'evaporazione dei solventi per evitare variabili confondenti.
- L'adattamento tra specie richiede aggiustamenti nella posizione degli elettrodi e nei parametri degli stimoli in base alla morfologia delle antenne.
- I limiti pratici includono la stabilità della preparazione nel tempo e la suscettibilità al rumore ambientale durante la registrazione.
