Name: Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri lo sviluppo di immunoassay personalizzati con la piattaforma ViBE per risultati sensibili e riproducibili. Questo metodo automatizzato riduce il tempo di manipolazione e migliora l'efficienza nella ricerca oncologica.

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1. Microparticelle di preparazione <ol><li> Anticorpi etichette con Biotina NHS Chimica </li><li> Determinazione del grado di biotinilazione </li><li> Perle streptavidina coniugato con anticorpo biotinilato <ol><li> Risospendere le sfere nel flacone originale con il vortex per 1-2 minuti </li><li> Aliquota il volume desiderato di perline in una provetta </li><li> Lavare le perle 3 volte con PBST: <ol><li> Collocare la provetta contenente le perline sul magnete per 2 minuti </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione con il tubo sul magnete. Fare attenzione a non disturbare le perline </li><li> Togliere la provetta dal magnete e aggiungere 1 ml PBST </li><li> Vortex per 20 secondi per risospendere le sfere </li><li> Centrifugare per 5 secondi per rimuovere le perle dal tappo </li><li> Ripetere altre due volte 2.3.1-2.3.5 </li></ol></li><li> Dopo il terzo lavaggio posto il tubo sul magnete e aspirare il PBST </li><li> Aggiungi anticorpo biotinilato ai talloni, risospendere </li><li> Se necessario, portare il volume delle anticorpo biotinilato fino a 300 ml con PBS. Se il volume anticorpo è già superiore a 300 ml non aggiungere alcun PBS </li><li> Incubare la sospensione tallone / anticorpo per 30 minuti a temperatura ambiente mediante l'agitatore vortex o rotatori tubo </li><li> Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3. </li><li> Blocco con perline biotinilato BSA <ol><li> Dopo il terzo lavaggio aggiungere 10 mg / mg biotinilato BSA, regolare il volume a 300 ml con PBS, se necessario, e incubare con agitazione per 30 minuti </li></ol></li><li> Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3 </li><li> Risospendere le sfere in 100 ml di PBS/0.05% BSA. Azoturo di sodio possono essere aggiunti per la conservazione a lungo termine </li></ol></li><li> Utilizzando protocolli standard di NHS fluorescina, fluoresceinate l'anticorpo rivelatore </li><li> Determinare il grado di Fluorescination </li></ol> 2. HCP - Sviluppo <ol><li> Preparare le soluzioni di lavoro: <ol><li> Anticorpo marcato con fluoresceina (Fl-Ab): La maggior parte CHO-HCP saggi uso Fl-Ab ad una concentrazione finale di 400 ng / ml. Il Fl-Ab è aggiunto come ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è di 1,6 mg / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino Flab con BioScale Bead / flab diluente. </li><li> Perle: la maggior parte CHO-HCP saggi uso perline ad una concentrazione finale di 2x10 5 pedine / ml. Il reagente tallone costituisce ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è 8x10 5 pedine / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino tallone con BioScale Bead / flab diluente. Vortex lo stock tallone bene per assicurarsi che tutte le perle sono in sospensione prima di rimuovere una frazione. </li><li> Esecuzione di buffer: La composizione del tampone di corsa può essere ottimizzata per gli anticorpi utilizzati per sviluppare il test, tuttavia diversi CHO-HCP test sono stati sviluppati utilizzando 10 mM tampone HEPES, 1% di Tween, pH 7.5. BioScale ha sviluppato un additivo per il tampone di corsa (in dotazione con il kit di sviluppo) che si aggiunge al buffer ad una concentrazione di 1% prima dell'uso. </li></ol></li><li> Diluire calibratori e campioni con diluente campione BioScale. </li></ol> 3. ViBE di configurazione del sistema <ol><li> Girare la workstation ViBE su </li><li> Collegare l'alimentazione del sistema e dei rifiuti </li><li> Il primo sistema </li><li> Inserire una cartuccia ViBE </li><li> Far passare il tubo </li><li> Preparare modello di analisi compilando il foglio denominato "Setup campione". BioScale offre la possibilità di avere un modello di analisi per ogni dosaggio Workstation ViBE. Questo permette all'utente di modificare e salvare note specifiche nella scheda "Note" del modello di saggi diversi tenere un registro completo dell'esperimento. </li><li> Modello di analisi configurazione iniziale: Inizia compilando il tavolo (angolo in alto a sinistra) del range di concentrazione degli standard nel saggio in "Setup campione" foglio. </li><li> Successivamente, inserire ulteriori informazioni nella tabella a destra degli standard (impostazione della colonna semplici Per saperne, One Aggiungi reagenti e due configurazioni reagente Aggiungi) per indicare la workstation ViBE come campioni lunghi bisogno di incubare, come è il volume di reagente deve essere trasferita , per quanto tempo l'accumulo campione deve essere, e se condizionamento del sensore e la decontaminazione di sonde e cartucce sono necessari, ecc </li><li> Compila il layout del pannello. </li><li> Carico del campione / i reagenti in piastre. Il ViBE fornirà i volumi necessari per la piastra reagente. Volume del campione può variare, ma a metà di un volume dosaggio totale di 120 microlitri è un buon punto di partenza. </li><li> Applicare copertine piatto. Caricare le piastre sul ponte workstation. </li><li> Eseguire il test di avvio procedura guidata, passare attraverso procedura guidata e avviare test. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: immunodosaggio a sandwich AMMP Su una workstation ViBE, un saggio AMMP misura la concentrazione di antigene. Il segnale è misurato quando il tallone-antigene-anticorpo aptene si lega al sensore tramite l'aptene / anti-aptene interazione. Rigenerazione porta il sensore torna allo stato all'inizio rimuovendo il immunocomplessi. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: CHO-HCP curva di calibrazione Assay AMMP Figura 2 è un esempio di una curva di calibrazione CHO HCP saggio AMMP. Analisi può essere effettuata in campioni provenienti da tutto il flusso di purificazione compreso il reattore con alta precisione e riproducibilità. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Proteina A AMMP curva di calibrazione di analisi Figura 3 è una curva di calibrazione per una proteina residua un test AMMP, eseguita con una proteina VIBE residua un kit di analisi. Lo stesso kit può essere utilizzato per un test veloce con un periodo di incubazione di 30 minuti, o per risultati più sensibili e più ampia gamma dinamica, con un periodo di incubazione più lungo, senza perdita di precisione o accuratezza, entrambi i quali sono in genere migliori di equivalente ELISA nel utenti ' mani <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Prodotto titolo AMMP Assay La stazione di lavoro ViBE può essere utilizzato anche per un saggio titolo del prodotto, i risultati mostrati in figura 4. Eseguita in modo diverso rispetto saggi AMMP, questo test non richiede trattamento del campione diverso da semplice diluizione o perline, e quantificazione è stata verificata in "no rotazione" campioni contenenti oltre 10 milioni di cellule in un ampio intervallo di Viabilità. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 biomarker test Mostrata in Figura 5 è una curva standard di segnale ottenuto dal Bioanalyzer ViBE (Pannello A) o utilizzando la tecnologia AlphaScreen ricombinante GST-Gadd34. Risultati su piattaforma ViBE sono stati circa un registro più sensibili utilizzando gli stessi anticorpi. AMMP sfrutta la misura di un minor numero di particelle più grandi ma ancora beneficia soluzione di acquisizione e complessa fase di formazione di rilevamento. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 a campione del tumore Nella Figura 6, l'induzione di Gadd34 da CWR22 xenotrapianti è stato testato in presenza o in assenza di un inibitore del proteasoma boronate come analizzato sia dal ViBE Bioanalyzer (Pannello A) o AlphaScreen (Pannello B). La piattaforma ViBE è stato in grado di produrre sensibili, risultati riproducibili in xenotrapianti tumorali in vivo, mentre il segnale è stato spento con AlphaScreen mcg maggiore di proteine. Questo esempio mostra la potenza della tecnologia AMMP in campioni molto complessi. Grazie al chip di rilevamento sensibili e ad alta efficienza del magnete vicino al chip, basso numero di microparticelle magnetiche possono pulire in modo efficace e riproducibile per target bassa abbondanza tra la complessità del lisato cellulare (compresi i reagenti lisi) e detriti sangue.

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Bioscale, Inc che produce alcuni degli strumenti e dei reagenti utilizzati in questo articolo.

Gli esempi precedenti dimostrano AMMP I risultati altamente sensibile quantitativa in campioni complessi. Questa performance, al momento della consegna con la facilità e il controllo della formattazione dei reagenti nel sistema è abilitante per una varietà di applicazioni. Tali domande possono essere specifici per un target, come in Gadd34 nel tumore, o generico per uno spettro di obiettivi, come nella rilevazione delle proteine ​​della cellula ospite e la quantificazione in campioni che attraversano il torrente purificazione. La bassa piattaforma ViBE testa combinata con AMMP altamente flessibile fornisce un potente strumento per la distribuzione di saggi critici.

<table><tbody><tr><td>NHS-biotina cromogenica o kit di etichettatura con NHS-biotina cromogenica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Se l’NHS-biotina cromogenica viene acquistata come reagente, saranno necessari i seguenti materiali aggiuntivi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solvente organico miscibile con l’acqua, come dimetilsulfossido (DMSO) o dimetilformammide (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) o altro tampone privo di ammine (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne desalatrici o unità per dialisi per lo scambio del tampone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro in grado di misurare a 354 e 280 nm &amp;#8211; per la misurazione delle concentrazioni di proteina e biotina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo biotinilato (2-5 biotine/Ab)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsferette magnetiche di streptavidina</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>(10 mg/mL) ~10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; microsferette/mg</td></tr><tr><td>Magnete per provette da microcentrifuga</td><td>New England Biolabs</td><td>cat # S1510S</td><td></td></tr><tr><td>BSA biotinilata per il bloccaggio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS con 0,1% di Tween 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaprovette per vortex o rotatore per provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo o proteina da etichettare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-fluoresceina o kit di etichettatura con NHS-fluoresceina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Se l’NHS-fluoresceina viene acquistata come reagente, saranno necessari i seguenti materiali aggiuntivi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solvente organico miscibile con l’acqua, come dimetilsulfossido (DMSO) o dimetilformammide (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM borato, pH 8,5 o altro tampone privo di ammine (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne desalatrici o unità per dialisi per lo scambio del tampone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>La misurazione delle concentrazioni di proteina e fluoresceina richiede uno spettrofotometro in grado di misurare a 493 e 280 nm.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diluente</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>per diluire le microsferette e l’anticorpo fluorescente</td></tr><tr><td>Diluente per campioni</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>per diluire campioni e calibratori</td></tr><tr><td>Additivo per tampone di corsa</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia acoustic microparticelle di membrana

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Test personalizzati per specifiche proteine ​​sono spesso limitati a rilevamento manuale che richiede tempo e le tecniche di quantificazione, quali ELISA o Western blot a causa della complessità dello sviluppo su piattaforme alternative. BioScale proprietaria membrana acustica microparticelle (AMMP), la tecnologia permette immunologici panino di essere facilmente sviluppati per l&#39;uso sulla piattaforma ViBE, fornendo una migliore sensibilità, la riproducibilità e il funzionamento automatico. Fornito come esempio, questo protocollo delinea le procedure per lo sviluppo di una consuetudine ovariche di criceto cinese-Host proteina cellulare (CHO-HCP) test. I principi generali descritti qui possono essere seguiti per lo sviluppo di una grande varietà di saggi immunologici. Un AMMP antigene concentrazione saggio misura misurando i cambiamenti nella frequenza di oscillazione causata dal legame di microparticelle alla superficie del sensore da calcolare. È composto da quattro componenti principali: (1) una cartuccia che contiene un funzionalizzato otto chip del sensore (2) anticorpo marcato microparticelle magnetiche, (3) anticorpo aptene tag che si lega alla superficie del chip funzionalizzati (4) campioni contenenti l&#39;antigene di interesse. BioScale biosensore è un dispositivo di risonanza che contiene otto membrane individuale con percorsi separati fluidica. Le membrane cambiare frequenza di oscillazione in risposta ad accumulare massa in superficie e questo cambiamento di frequenza è utilizzato per quantificare la quantità di massa aggiunto. Per facilitare l&#39;uso in una vasta gamma di immunodosaggi è funzionalizzati il ​​sensore con un anticorpo anti-aptene. Anticorpi specifici test vengono modificati attraverso la coniugazione covalente di un tag aptene di un anticorpo e biotina all&#39;altro. L&#39;etichetta biotina viene utilizzato per associare l&#39;anticorpo di streptavidina accoppiata sfere magnetiche che, in combinazione con l&#39;aptene-anticorpo tag, vengono utilizzati per catturare l&#39;analita in un panino. Il complesso si lega al chip attraverso l&#39;interazione anti-hapten/hapten. Alla fine di ogni test eseguire i sensori sono pulite con un acido diluito che permette l&#39;analisi sequenziale di colonne da una piastra da 96 pozzetti. Qui vi presentiamo il metodo per lo sviluppo di una consuetudine CHO-HCP test AMMP per lo sviluppo dei bioprocessi. Lo sviluppo di test AMMP o modificare i test esistenti in saggi AMMP in grado di fornire prestazioni migliori (riproducibilità, sensibilità) in campioni complessi e tempi operatore ridotto. Il protocollo viene illustrata la procedura per lo sviluppo e la sezione di discussione su risultati rappresentativi. Per una spiegazione più approfondita analisi e di ottimizzazione dei parametri di personalizzazione contatto BioScale. Questo kit offre generico test di sviluppo bioprocessi come proteina residua A, titolo del prodotto, e CHO-HCP.

Sviluppo di saggi di costume sulla piattaforma ViBE per più sensibili, riproducibili, i risultati automatizzati in matrici complesse è descritto. La cartuccia universale consente di test per essere facilmente adattati per essere utilizzati con test personalizzati. Questa versatilità consente un rapido sviluppo e validazione di test romanzo o versioni automatizzate di test manuali esistenti, esemplificata in questo video.

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

I saggi personalizzati per proteine uniche sono spesso limitati a tecniche di rilevamento e quantificazione manuali e laboriose, come l'ELISA o il Western blot, a causa di...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un saggio immunitario personalizzato e robusto, in grado di fornire risultati riproducibili con un tempo minimo di manipolazione manuale. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i componenti appropriati del saggio. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'ottimizzare il saggio sulla base dei suoi parametri.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'impostare il saggio sulla piattaforma Vibe caricando semplicemente le piastre dei campioni e dei reagenti e definendo la procedura del saggio. Con il software Vibe, l'ultimo passaggio della procedura è avviare il dispositivo mediante la procedura guidata di avvio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano dati di saggio immunoistochimico sensibili e riproducibili, utilizzando anticorpi personalizzati e con un limitato intervento manuale grazie all'uso della piattaforma Vibe.Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti come Eli's è che la Vibe Workstation consente operazioni senza intervento continuo e fornisce dati più riproducibili secondo i protocolli standard. Utilizzando NHS cromogenico, biotina Bio atin, l'anticorpo di cattura per fissare l'anticorpo biotinilato a strep to avid e alle perle magnetiche, iniziare vortexando il flacone di stripp to avid e perle magnetiche per uno o due minuti per risospendere; pipettare il volume desiderato di perle in un tubo da centrifuga e rimuovere il surnatante con l'aiuto di un separatore magnetico. Lavare le perle tre volte con PBST, utilizzando la separazione magnetica per recuperare le perle secondo il protocollo scritto.Dopo aver rimosso il PBST dall'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione dell'anticorpo biotinilato alle perle e risospendere le perle mediante pipettaggio. Assicurarsi che il volume dell'anticorpo sia di almeno 300 microlitri. Se inferiore, aggiustare con PBS.Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Quindi lavare le perle con PBST come in precedenza. Aggiungere BSA biotinilata seguendo lo stesso procedimento eseguito in precedenza.Quando si utilizza un anticorpo biotinilato, eseguire dei lavaggi prima e risospendere le perle in 100 microlitri di BSA 0,05% in PBS per la conservazione a lungo termine; in questo caso, l'azide di sodio può essere aggiunta seguendo i protocolli standard. Fluoresceinare l'anticorpo rivelatore utilizzando NHS. Per iniziare lo sviluppo del saggio delle proteine cellulari ospiti di ovary cinese del criceto.Per prima cosa, preparare le soluzioni di lavoro. L'anticorpo marcato con l'EMIVITELLO o HAB viene preparato come soluzione di lavoro 4x di 1,6 microgrammi per millilitro, diluita con diluente per HAB con perline Bio Scale; ruotare la soluzione per almeno cinque minuti. Successivamente, preparare la soluzione di perline.Vortexare bene la sospensione delle perle in bile. Per assicurare che tutte le perle siano in sospensione, prelevare un’aliquota per preparare una miscela lavorativa 4x di otto volte 10 alla quinta perle per millilitro, diluite con diluente per perle bio scale HAB. Ruotare la soluzione per almeno cinque minuti.Quindi preparare il buffer di corsa. Sono stati sviluppati diversi saggi per le HCP di CHO utilizzando un buffer al 1% di Tween 10 millimolari a pH 7,5.Tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare il buffer in base agli anticorpi utilizzati per sviluppare il saggio. Si raccomanda di preparare un modello di saggio per ciascun saggio su cinque postazioni di lavoro. Il modello di saggio comprende sette fogli, denominati istruzioni, note per l'allestimento del campione, calcoli dei dati grezzi, grafico di calibrazione e risultati.Per iniziare la configurazione del modello, selezionare il foglio di impostazione del campione e compilare l'intervallo di concentrazione degli standard nella tabella. Nell'angolo in alto a sinistra del foglio, inserire informazioni aggiuntive nella tabella a destra degli standard per indicare alla workstation vibe per quanto tempo i campioni devono incubare, quale volume di reagente deve essere trasferito, la durata dell'accumulo del campione e se sono necessarie la condizionatura del sensore e la decontaminazione delle sonde e della cartuccia. Successivamente, compilare il layout della piastra, diluire i calibratori e i campioni con diluente per campioni su scala biologica e caricare i campioni nelle piastre.Caricare i reagenti nella terza piastra a 96 pozzetti. Sigillare le piastre. Posizionare le piastre sugli agitatori del deck della workstation e configurare il sistema con tampone di lavaggio e soluzione di rigenerazione.Accendere la workstation vibe e collegare l'alimentazione del sistema e lo scarico. Iniziare a preparare il sistema. Inserire la cartuccia vibe.Infine, eseguire la procedura guidata di avvio del saggio. Seguire le istruzioni visualizzate a schermo e iniziare. Il segnale del saggio viene misurato mediante la tecnologia A MMP. Quando l'anticorpo HAPTEN-antigene su microsfera si lega al sensore attraverso l'interazione aptene-anti-aptene, la rigenerazione riporta il sensore allo stato iniziale rimuovendo i complessi immunitari, come mostrato.Di seguito è riportato un esempio di saggio CHO H-C-P-A-M-M-P. L'analisi della curva di calibrazione può essere eseguita su campioni di biorreattore ottenendo risultati riproducibili. Questa curva di calibrazione riguarda una proteina residua.Il saggio A-A-M-M-P eseguito con una proteina residua Vibe, un kit per saggi. Lo stesso kit può essere utilizzato per un saggio più rapido con un periodo di incubazione di 30 minuti o per risultati più sensibili e un intervallo dinamico più ampio con un periodo di incubazione più lungo. La Workstation Vibe può inoltre essere utilizzata per un saggio del titolo del prodotto eseguito in modo diverso rispetto ad altri saggi A MMP.Questo saggio non richiede trattamento del campione né l'uso di microsfere e la quantificazione è stata verificata in campioni senza centrifugazione contenenti oltre 10 milioni di cellule. Qui viene mostrata una curva standard del segnale ottenuto mediante il Bioanalizzatore Vibe o la tecnologia Alpha Screen utilizzando risultati di GST GAD 34 ricombinante sulla piattaforma Vibe. Era un ordine di grandezza più sensibile in questo caso.L'induzione di GAD 34 da xenotrapianti CWR 22 è stata testata in presenza o assenza di un inibitore del proteasoma bate, come analizzato mediante Vibe, bioanalizzatore o saggio Alpha. La piattaforma Vibe è stata in grado di produrre risultati sensibili e riproducibili negli xenotrapianti tumorali in vivo, mentre il segnale del saggio Alpha è stato attenuato con l'aumento dei microgrammi di proteina dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci oncologici per esplorare l'inibizione farmacologica in campioni tumorali, consentendo operazioni più efficienti nelle applicazioni di bioprocessazione.

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Questo video mostra un test per la purificazione degli anticorpi monoclonali dal fluido di coltura cellulare raccolto da cellule ovariche di criceto cinese. Impiega una resina di vetro porosa con proteina A immobilizzata, che si lega alla regione Fc degli anticorpi nel campione, separandoli efficacemente dai contaminanti. L'uso di un tampone di eluizione a basso pH indebolisce l'interazione, facilitando il recupero degli anticorpi purificati.

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Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).

Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.

Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l'impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

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Analisi delle proteine delle cellule ospiti utilizzando perle di arricchimento accoppiate a digestione limitata

Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la verifica funzionale di cellule T sensibili al recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T sensibili all'ipossia. Questo protocollo presenta la generazione di cellule CAR-T sensibili all'ipossia basate su lentivirus e la loro caratterizzazione, inclusa la convalida dell'espressione CAR ipossia-dipendente e della citotossicità selettiva.

Generazione e verifica funzionale di cellule T del recettore dell'antigene chimerico sensibili all'ipossia

Gli esosomi possiedono un potenziale clinico significativo, ma la loro applicazione pratica è limitata a causa della facile clearance in vivo e della scarsa stabilità. I microaghi presentano una soluzione che consente la somministrazione localizzata perforando le barriere fisiologiche e la conservazione dello stato secco, affrontando così i limiti della somministrazione di esosomi e ampliando la loro utilità clinica.

Fabbricazione e caratterizzazione di cerotti con microaghi per il caricamento e la somministrazione di esosomi

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