Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un saggio immunitario personalizzato e robusto, in grado di fornire risultati riproducibili con un tempo minimo di manipolazione manuale. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i componenti appropriati del saggio. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'ottimizzare il saggio sulla base dei suoi parametri.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'impostare il saggio sulla piattaforma Vibe caricando semplicemente le piastre dei campioni e dei reagenti e definendo la procedura del saggio. Con il software Vibe, l'ultimo passaggio della procedura è avviare il dispositivo mediante la procedura guidata di avvio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano dati di saggio immunoistochimico sensibili e riproducibili, utilizzando anticorpi personalizzati e con un limitato intervento manuale grazie all'uso della piattaforma Vibe.

Il principale vantaggio di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti come Eli's è che la Vibe Workstation consente operazioni senza intervento continuo e fornisce dati più riproducibili secondo i protocolli standard. Utilizzando NHS cromogenico, biotina Bio atin, l'anticorpo di cattura per fissare l'anticorpo biotinilato a strep to avid e alle perle magnetiche, iniziare vortexando il flacone di stripp to avid e perle magnetiche per uno o due minuti per risospendere; pipettare il volume desiderato di perle in un tubo da centrifuga e rimuovere il surnatante con l'aiuto di un separatore magnetico. Lavare le perle tre volte con PBST, utilizzando la separazione magnetica per recuperare le perle secondo il protocollo scritto.

Dopo aver rimosso il PBST dall'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione dell'anticorpo biotinilato alle perle e risospendere le perle mediante pipettaggio. Assicurarsi che il volume dell'anticorpo sia di almeno 300 microlitri. Se inferiore, aggiustare con PBS.

Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Quindi lavare le perle con PBST come in precedenza. Aggiungere BSA biotinilata seguendo lo stesso procedimento eseguito in precedenza.

Quando si utilizza un anticorpo biotinilato, eseguire dei lavaggi prima e risospendere le perle in 100 microlitri di BSA 0,05% in PBS per la conservazione a lungo termine; in questo caso, l'azide di sodio può essere aggiunta seguendo i protocolli standard. Fluoresceinare l'anticorpo rivelatore utilizzando NHS. Per iniziare lo sviluppo del saggio delle proteine cellulari ospiti di ovary cinese del criceto.

Per prima cosa, preparare le soluzioni di lavoro. L'anticorpo marcato con l'EMIVITELLO o HAB viene preparato come soluzione di lavoro 4x di 1,6 microgrammi per millilitro, diluita con diluente per HAB con perline Bio Scale; ruotare la soluzione per almeno cinque minuti. Successivamente, preparare la soluzione di perline.

Vortexare bene la sospensione delle perle in bile. Per assicurare che tutte le perle siano in sospensione, prelevare un’aliquota per preparare una miscela lavorativa 4x di otto volte 10 alla quinta perle per millilitro, diluite con diluente per perle bio scale HAB. Ruotare la soluzione per almeno cinque minuti.

Quindi preparare il buffer di corsa. Sono stati sviluppati diversi saggi per le HCP di CHO utilizzando un buffer al 1% di Tween 10 millimolari a pH 7,5.

Tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare il buffer in base agli anticorpi utilizzati per sviluppare il saggio. Si raccomanda di preparare un modello di saggio per ciascun saggio su cinque postazioni di lavoro. Il modello di saggio comprende sette fogli, denominati istruzioni, note per l'allestimento del campione, calcoli dei dati grezzi, grafico di calibrazione e risultati.

Per iniziare la configurazione del modello, selezionare il foglio di impostazione del campione e compilare l'intervallo di concentrazione degli standard nella tabella. Nell'angolo in alto a sinistra del foglio, inserire informazioni aggiuntive nella tabella a destra degli standard per indicare alla workstation vibe per quanto tempo i campioni devono incubare, quale volume di reagente deve essere trasferito, la durata dell'accumulo del campione e se sono necessarie la condizionatura del sensore e la decontaminazione delle sonde e della cartuccia. Successivamente, compilare il layout della piastra, diluire i calibratori e i campioni con diluente per campioni su scala biologica e caricare i campioni nelle piastre.

Caricare i reagenti nella terza piastra a 96 pozzetti. Sigillare le piastre. Posizionare le piastre sugli agitatori del deck della workstation e configurare il sistema con tampone di lavaggio e soluzione di rigenerazione.

Accendere la workstation vibe e collegare l'alimentazione del sistema e lo scarico. Iniziare a preparare il sistema. Inserire la cartuccia vibe.

Infine, eseguire la procedura guidata di avvio del saggio. Seguire le istruzioni visualizzate a schermo e iniziare. Il segnale del saggio viene misurato mediante la tecnologia A MMP. Quando l'anticorpo HAPTEN-antigene su microsfera si lega al sensore attraverso l'interazione aptene-anti-aptene, la rigenerazione riporta il sensore allo stato iniziale rimuovendo i complessi immunitari, come mostrato.

Di seguito è riportato un esempio di saggio CHO H-C-P-A-M-M-P. L'analisi della curva di calibrazione può essere eseguita su campioni di biorreattore ottenendo risultati riproducibili. Questa curva di calibrazione riguarda una proteina residua.

Il saggio A-A-M-M-P eseguito con una proteina residua Vibe, un kit per saggi. Lo stesso kit può essere utilizzato per un saggio più rapido con un periodo di incubazione di 30 minuti o per risultati più sensibili e un intervallo dinamico più ampio con un periodo di incubazione più lungo. La Workstation Vibe può inoltre essere utilizzata per un saggio del titolo del prodotto eseguito in modo diverso rispetto ad altri saggi A MMP.

Questo saggio non richiede trattamento del campione né l'uso di microsfere e la quantificazione è stata verificata in campioni senza centrifugazione contenenti oltre 10 milioni di cellule. Qui viene mostrata una curva standard del segnale ottenuto mediante il Bioanalizzatore Vibe o la tecnologia Alpha Screen utilizzando risultati di GST GAD 34 ricombinante sulla piattaforma Vibe. Era un ordine di grandezza più sensibile in questo caso.

L'induzione di GAD 34 da xenotrapianti CWR 22 è stata testata in presenza o assenza di un inibitore del proteasoma bate, come analizzato mediante Vibe, bioanalizzatore o saggio Alpha. La piattaforma Vibe è stata in grado di produrre risultati sensibili e riproducibili negli xenotrapianti tumorali in vivo, mentre il segnale del saggio Alpha è stato attenuato con l'aumento dei microgrammi di proteina dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci oncologici per esplorare l'inibizione farmacologica in campioni tumorali, consentendo operazioni più efficienti nelle applicazioni di bioprocessazione.