Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la durata della vita di vermi marini del genere *Elgan* trattati con farmaci di interesse. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando l'OP 50, un ceppo batterico utilizzato per nutrire i vermi. Successivamente, viene generata una popolazione di vermi sincronizzata per età e seminata in piastre a 96 pozzetti insieme ai batteri nutrizionali OP 50.

Nel corso dei due giorni successivi, i vermi crescono fino allo stadio larvale L4 e viene aggiunto il farmaco FUDR per prevenire la riproduzione. Il giorno seguente, i vermi raggiungono l'età adulta e i farmaci di interesse vengono aggiunti nei singoli pozzetti. Da questo momento in poi, il numero di vermi vivi e morti viene determinato ogni due o tre giorni, fino a quando tutti i vermi non sono deceduti.

L'osservazione viene effettuata utilizzando un microscopio invertito e il numero di vermi morti e vivi viene registrato in ogni sessione. Ciao, sono Greg Solis. Sono nel laboratorio di Petro presso il Dipartimento di Fisiologia Chimica dell'Istituto di Ricerche Scripps.

Oggi vi mostrerò come sincronizzare i vermi e distribuirli in piastre microtitolazione a 96 pozzetti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente l'identificazione rapida di molecole che prolungano la durata della vita e C. elegans. Cominciamo dunque.

Per preparare i batteri per l'alimentazione di C. elegans, iniziare sette giorni prima inoculando cinque millilitri di TB contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e 0,1 microgrammi per millilitro di tetraciclina con una singola colonia OP50, e incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius in un agitatore per batteri. La mattina seguente, diluire la coltura notturna di OP50 in un rapporto di 1:2000 in 300 millilitri di TB contenenti 50 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare la coltura in un agitatore per batteri da otto a dodici ore a 37 gradi Celsius, fino al raggiungimento della saturazione. Non permettere alla coltura di crescere per più di 14 ore.

Trasferire l'OP 50 in un tubo sterile per centrifugazione pre-pesato. Pellettare l'OP 50 mediante centrifugazione per 10 minuti a 3.500 giri/min o a 2.200 ×g in una centrifuga da banco. Scartare il soprannatante S, risospendere il pellet di OP 50 in acqua distillata e ripetere la centrifugazione per ottenere il pellet. Eseguire questo lavaggio due volte, dopo il secondo lavaggio.

Lavare accuratamente ed eliminare completamente tutta l'acqua rimanente. Pesare il tubo da centrifuga contenente il pellet e sottrarre il peso del tubo da centrifuga vuoto per determinare il peso del pellet. Successivamente, risospendere completamente il pellet in S Complete fino a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

Non devono rimanere grumi. La concentrazione di 100 milligrammi per millilitro di OP 50 dovrebbe corrispondere a due volte 10 alla 10 batteri per millilitro. Utilizzare lo spettrofotometro per determinare il numero di batteri per millilitro se è nota la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per millilitro.

Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione nutritiva OP 50 a due volte 10 alla 10 batteri per millilitro. Infine, conservare la soluzione OP 50 a quattro gradi Celsius fino al suo utilizzo per la coltura dei vermi, al fine di generare una popolazione di vermi sincronizzata per età. Iniziare nel tardo pomeriggio del giorno meno sei con una piastra NGM di cinque-dieci giorni, sulla quale la popolazione di vermi consiste principalmente di larve L1 in stato di stenti.

Sterilizzare un'ansa metallica riscaldandola brevemente su una fiamma di bunsen. Lasciarla raffreddare. Successivamente, utilizzare l'ansa fredda per prelevare frammenti di agar dalla piastra contenente i vermi in stato di digiuno.

Trasferire alcuni di questi frammenti su una nuova piastra NGM da 10 centimetri seminata con OP50. Incubare i vermi per circa 65 ore a 20 gradi Celsius fino a quando la maggior parte della popolazione di vermi non sia costituita da adulti fully grown. Il tempo necessario perché gli animali L1 privati di cibo crescano fino a diventare adulti fully grown può variare da ceppo a ceppo.

Dopo l'incubazione, raccogliere i vermi dalla piastra da 10 centimetri lavandoli via con cinque-dieci millilitri di acqua sterile. Trasferire la soluzione di vermi in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i vermi centrifugando per due minuti in una centrifuga da banco a 1.200 giri al minuto o 280 volte G. Eliminare il soprannatante e aggiungere 10 millilitri di acqua.

Ripetere il passaggio di lavaggio, rimuovere il sopranatante e aggiungere cinque millilitri di soluzione di ipoclorito appena preparata. Incubare con soluzione di idrossido di sodio per cinque minuti a temperatura ambiente fino a quando i vermi si aprono. Assicurarsi di vortexare delicatamente ogni minuto.

Monitorare l'andamento della reazione al microscopio stereoscopico non appena tutti gli adulti si saranno sciolti. Aggiungere cinque millilitri di tampone M nine per neutralizzare la reazione. Lavare le uova tre volte con 10 millilitri di tampone M nine centrifugando per due minuti a 2.500 giri al minuto o a 1.100 × g. Successivamente, lavare le uova una volta con 10 millilitri di S completo centrifugando per due minuti a 2.500 giri al minuto o a 1.100 × g. Rimuovere il surnatante.

Aggiungere 10 millilitri di S completo e trasferire la soluzione in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 30 millilitri di S completo per ottenere un volume finale di 40 millilitri. Agitare delicatamente il tubo tutta la notte a temperatura ambiente su un mutatore o dispositivo simile per seminare le piastre per animali il giorno successivo verso mezzogiorno.

Sotto una lente stereoscopica, verificare se i vermi sono schiusi durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione S completa contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando una lente stereoscopica, contare almeno 10 gocce per ogni campione.Resus.

Sospendere i vermi a una concentrazione di 80-100 vermi per millilitro. Nel mezzo S completo, aggiungere carbenicillina fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro e anfotericina B fino a una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per millilitro. Agitare su un mutatore.

Se si preparano quantità maggiori di vermi, utilizzare un flacone non clon da 600 millilitri con tappo filtrante. Alle 14:30 aggiungere l'OP 50 preparato nella prima parte a una concentrazione finale di sei milligrammi per millilitro. Riporre nuovamente l'OP 50 a quattro gradi Celsius. Trasferire 120 microlitri della soluzione di vermi con OP 50 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente.

Assicurarsi di mantenere i vermi e la sospensione mentre si pipetta; sigillare la piastra utilizzando un sigillante adesivo per evitare contaminazioni ed evaporazione. Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per due minuti e incubare per due giorni a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. Successivamente, per sterilizzare gli animali, aggiungere 30 microlitri di una soluzione madre di FUDR 0,6 millimolare in ogni pozzetto.

Questo passaggio porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP 50 da sei milligrammi per millilitro a cinque milligrammi per millilitro. Sigillare la piastra utilizzando sigillanti adesivi e agitare per due o tre minuti su un agitatore per micropiastre. Se l'OP 50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno meno due, è importante aggiungere il FUDR prima di mezzogiorno e riconsegnare le piastre all'incubatrice a 20 gradi Celsius entro le 9:00 del giorno successivo.

La maggior parte degli animali dovrebbe essere adulta e contenere diverse uova. Aggiungere a ciascun campione i farmaci di cui si vuole testare l'effetto sulla durata della vita alla concentrazione desiderata. Se si sciolgono i farmaci in DMSO, la concentrazione finale di DMSO non dovrebbe superare lo 0,6%, poiché concentrazioni di DMSO superiori allo 0,6% accorciano la durata della vita di *C. elegans* dopo l'aggiunta del farmaco.

Sigillare le piastre con un sigillante adesivo e agitarle per due o tre minuti su un agitatore per piastre microlitro. Riporre le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius. L'aggiunta dei farmaci può occasionalmente causare la morte di alcuni animali per piastra, specialmente se si utilizza un solvente diverso dall'acqua.

Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza di animali morti. In genere, dovrebbero esserci meno di 10 animali morti per ogni piastra da 96 pozzetti. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius per due giorni, in modo da permettere all'ossigeno fresco di entrare in coltura. Rimuovere il sigillante.

Attendere un minuto e sigillare nuovamente la piastra. Agitare la piastra per due o tre minuti su un agitatore per piastre microtitolazione, ripetere una volta ogni settimana al quinto giorno della vita adulta, aggiungere cinque microlitri della soluzione OP50 a 100 milligrammi per millilitro preparata in precedenza in ciascuno dei 96 pozzetti per prevenire la morte per fame. I vermi vengono valutati per la durata della vita in base al loro movimento tre volte a settimana dall'inizio dell'esperimento fino alla loro morte.

Utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo 2x o 2,5x per osservare i vermi in piastre a 96 pozzetti al giorno zero, all'inizio dell'esperimento. Contare il numero totale di vermi in ciascun pozzetto.

Pozzetti del sensore che contengono più di 18 animali dall'analisi, poiché in questi pozzetti non ci sarà abbastanza OP 50 e si manifesteranno effetti di restrizione dietetica in ogni sessione di conteggio. Registrare la data e il numero di animali che si muovono come animali vivi. Il movimento e il liquido sono molto più facili rispetto ai mezzi solidi e possono essere indotti da luci intense.

L'utilizzo di un ingrandimento maggiore può aiutare a individuare movimenti molto sottili, come quelli alla punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso gli unici osservati negli animali molto anziani. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius.

Ripetere le sessioni di conteggio ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali non saranno morti. Questa è la progettazione di un foglio Excel per registrare i dati di durata della vita per ciascun pozzetto. Nelle coordinate della piastra vengono registrate la linea, la concentrazione del farmaco, e il numero totale di animali vivi al giorno zero, all'inizio dell'esperimento.

Registrare la data e il numero di animali vivi e morti tre volte alla settimana per monitorare la sopravvivenza delle diverse popolazioni in ogni pozzetto. Questa figura mostra i risultati relativi a *C. elegans*, curve di longevità registrate a 20 gradi Celsius e 25 gradi Celsius. Il saggio di longevità basato su microtiter riproduce accuratamente le variazioni della longevità dipendenti dalla temperatura.

In modo analogo, come mostrato qui, il saggio in piastra microtitolata riproduce le variazioni di durata della vita di mutanti descritti come aventi una longevità differente rispetto ai due animali di tipo selvatico N. Questa figura illustra come dosi crescenti di mirtazapina influenzino la durata media della vita di sea elegance. I dati ottenuti mediante il saggio in piastra microtitolata sono sufficientemente quantitativi da permettere di determinare relazioni dose-risposta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per esaminare ampie librerie chimiche alla ricerca di molecole che prolunghino la durata della vita e see elegance.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.