Name: Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Scopri come misurare la durata della vita di Caenorhabditis elegans in piastre a 96 pozzetti per screening ad alto rendimento. Questo protocollo consente di identificare rapidamente composti che estendono la longevità.

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Questo protocollo è stato originariamente sviluppato presso Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle da Xiaolan Ye e Michael Petrascheck presso il Laboratorio di Linda Buck. La versione di cui sopra è stato preparato per rendere l&#39;intera procedura a disposizione della comunità più ampia. Ringraziamo Carol Taylor, Sarah LeBoeuf e Andy Tomacelli per leggere criticamente il protocollo. Si tratta di manoscritto # 2866 da The Scripps Research Institute. Il laboratorio Petrascheck è finanziato dal programma Novartis ADI.

Descrizione: Il protocollo è diviso in quattro parti. Parte 1 descrive come preparare i batteri alimentazione. Parte 2 descrive come preparare la cultura worm. Parte 3 descrive come punteggio la durata della vita. Parte 4 mostra alcuni risultati rappresentativi, e parte 5 descrive come preparare le soluzioni richieste. Esperimenti di durata richiedere diverse settimane per essere completato. Per ogni passo della settimana protocollo, giorno e ora del giorno è incluso per facilitare la pianificazione. La fase L4 (giorno 0) viene utilizzata come punto di riferimento per l'intero protocollo. 1. Preparazione di batteri alimentazione Questa sezione descrive la preparazione dei batteri alimentazione. Le specifiche E. coli ceppo usato per alimentare C.elegans si chiama OP50. Prima di questo protocollo, per evitare la contaminazione incrociata della cultura verme con altri batteri, il ceppo OP50 è stato fatto Carbenicillin / ampicillina resistenti 21. Preparare la OP50 4-5 giorni di anticipo. Tutti i materiali a contatto con OP50 devono essere sterili. Giorno -7: Giovedi (settimana 1): Seminare 5 ml di TB contenente 100 mg / ml Ampicillina e 0,1 mg / ml amfotericina B con un unico OP50 colonia e incubare per una notte a 37 ° C in un agitatore batterica. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1). Mattina 8:30. Seminare presto per lasciare il tempo sufficiente per la cultura di raggiungere la saturazione <ol><li> Diluire la cultura durante la notte di OP50 1:2000 in 300 TB ml contenente 50 mg / mL di ampicillina. Incubare la coltura batterica in uno shaker per 8-12 ore a 37 ° C fino a saturazione. Non permettere che la cultura di crescere più di 14 ore. </li><li> Trasferire il OP50 in una sterile, pre-ponderato tubo di centrifugazione. Agglomerare le OP50 tramite centrifugazione per 10 min a 3500 rpm (2200 xg) in una centrifuga da tavolo. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet OP50 in acqua sterile e ri-pellet per centrifugazione. Ripetere questa lavare due volte. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con attenzione tutta l'acqua residua. L'acqua non dovrebbe essere lasciato nel tubo. Pesare il tubo di centrifugazione che contiene il pellet e sottrarre il peso del tubo di centrifugazione vuoto al fine di determinare il peso del pellet. </li><li> Accuratamente risospendere il pellet in S-completo ad una concentrazione di 100 mg / ml. Senza grumi dovrebbe essere lasciato. </li><li> La concentrazione di 100 mg / mL OP50 dovrebbe corrispondere a 2 x 10 10 batteri / ml. Utilizzare uno spettrometro foto per determinare il numero di batteri per ml se la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per mL è noto. Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione di alimentazione OP50 a 2 x 10 10 batteri / ml. </li><li> Conservare il OP50solution a 4 ° C fino a quando non viene utilizzato per la cultura worm. </li></ol> 2. Preparazione di una cultura Worm sincrono Questa sezione descrive la preparazione della cultura worm. Il suo obiettivo è quello di generare un età sincrono popolazione di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento con candeggina al punto 5 devono essere sterili. Le piastre sono mantenuta a 20 ° C, salvo diversamente indicato. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1), 16:00: trasferimento degli animali ad un piatto fresco <ol><li> Prendete un piatto 5-10 NGM vecchio giorno in cui la maggioranza della popolazione è composto da larve di vermi L1 fame. </li><li> Sterilizzare una spatola metallica da poco che il riscaldamento nel corso di un becco Bunsen. Lasciate raffreddare. Utilizzare la spatola raffreddato a tagliare pezzi di agar dalla piastra contenente i vermi affamati. Trasferire alcuni di questi pezzi su un piatto fresco 10 teste di serie centimetri NGM con OP50. Incubare per ca. 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggioranza della popolazione è costituito da vermi adulti gravido. Il tempo necessario per gli animali L1 fame di crescere e diventare adulti gravido può variare da ceppo a ceppo. </li></ol> -3 Giorni: Lunedi (settimana 2) 10:00: Stabilire una popolazione sincrona <ol start="3"><li> Raccogliere i vermi dalla piastra 10 cm per lavarli via il piatto con 5-10 ml di acqua sterile. Trasferire il worm / soluzione di acqua in un tubo da 15 ml. </li><li> Lavare i vermi per centrifugazione 2 minuti in una centrifuga da tavolo a 1200 rpm (280 xg). Gettare il surnatante e aggiungere 10 ml di acqua. Ripeti. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di candeggina appena preparato / soluzione di NaOH (2,5 candeggina mL, 1 mL 10N NaOH, 6.5 mL H 2 O). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando il worm rompere. Assicurati di vortice delicatamente ogni minuto. Monitorare l'andamento della reazione sotto il microscopio da dissezione. </li><li> Non appena tutti gli adulti sciogliere, aggiungere 5 ml di M9 tampone per neutralizzare la reazione. </li><li> Lavare le uova tre volte con 10 mL di tampone M9 per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavare le uova una volta con 10 mL S-completo per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL S-completo e trasferire la soluzione di un nuovo tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di S-completo per un volume finale di 40 ml. Agitare delicatamente il tubo durante la notte a temperatura ambiente su un nutator o dispositivo simile. </li></ol> -2 ° giorno: Martedì (settimana 2), ore 12:00: Seed gli animali in piastre <ol start="10"><li> Nell'ambito di applicazione dissezione, verificare se i vermi nati durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella S-soluzione completa contando il numero di worm in 10 microlitri gocce utilizzando un ambito dissezione. Contare almeno 10 gocce per ogni campione. </li><li> Risospendere i vermi ad una concentrazione di 80-100 worm / mL in S-completo. Aggiungi Carbenicillin (stock 100 mg / mL) a una concentrazione finale di 50 mg / ml e amfotericina B (stock 250 mcg / mL) ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml. Agitare su un nutator. Se la preparazione di grandi quantità di worm, utilizza una nunclon 600 mL recipiente con coperchio del filtro. </li><li> Alle 2:30 pm aggiungere il OP50 preparato nella parte 1 ad una concentrazione finale di 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 batteri / mL). Riportare la OP50 a 4 ° C. </li><li> Trasferire 120 microlitri della soluzione del worm/OP50 in ciascun pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti. Usa Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente. Assicurarsi di mantenere i vermi in sospensione durante il pipettaggio. </li><li> Sigillare la piastra con un nastro sigillante per evitare la contaminazione e l'evaporazione. Agitare la piastra su micropiastra shaker per 2 minuti e incubare per 2 giorni a 20 ° C fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. </li></ol> Day 0: Giovedi (settimana 2) prima di mezzogiorno: Sterilizzare gli animali con l'aggiunta di Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Per sterilizzare gli animali aggiungere 30 ml di una soluzione 0,6 mM magazzino FUDR in ciascun pozzetto. Questo passo porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP50 da 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 9 batteri / mL). Sigillare la piastra con sigillanti a nastro e agitare per 2-3 minuti su una piastra di microtitolazione shaker. Se l'OP50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno -2, è importante che il FUDR si aggiunge prima di mezzogiorno. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li></ol> Giorno 1: Venerdì (settimana 2): Aggiungi farmaci per la cultura <ol start="16"><li> Entro le ore 9:00 la maggior parte degli animali devono essere gravide e le uova contengono diversi ciascuno. Aggiungere i farmaci il cui effetto sulla durata di vita è da verificare presso la concentrazione desiderata. Se sciogliere la droga in DMSO le concentrazioni finali di DMSO non deve superare lo 0,6%, come DMSO concentrazioni superiori allo 0,6% C.elegans accorciare la durata della vita. Dopo l'aggiunta del farmaco, sigillare le piastre con nastro isolante e agitare per 2-3 minuti su una micropiastra shaker. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> L'aggiunta di questi farmaci può occasionalmente uccidere alcuni animali per piastra, specialmente se si usa un altro solvente che l'acqua. Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza degli animali morti. In generale, ci dovrebbe essere inferiore a 10 animali morti per 96 pozzetti. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore. </li></ol> 4 ° giorno: Lunedi (settimana 3): Modifica sigillanti <ol start="18"><li> Per consentire ossigeno fresco per entrare nella cultura rimuovere il sigillante, attendere 1 minuto e richiudere il piatto. Agitare la piastra per 2-3 minuti su un agitatore micropiastra. Ripetere una volta alla settimana. </li></ol> 5 ° giorno: Martedì (settimana 3): Aggiungi OP50 nuovo per evitare la fame <ol start="19"><li> Aggiungere 5 ml di mg / ml 100 OP50 soluzione che è stata preparata in parte 1 a ciascuno dei 96 pozzetti per evitare la fame. </li></ol> 3. Punteggio di vita. Questa sezione descrive come la sopravvivenza della popolazione verme sincronizzata della parte 2 viene monitorata fino a quando gli animali sono morti. Per osservare gli animali nel Piastre a 96 pozzetti, utilizzare un microscopio rovesciato con un obiettivo 2x o 2.5x. Record di dati di sopravvivenza per tre volte alla settimana; Lunedi, Mercoledì e Venerdì. Utilizzare il movimento per stabilire se gli animali sono vivi o morti. Forte luce, la luce blu soprattutto, induce gli animali a muoversi. Non rimuovere gli animali morti dal test. Occasionalmente, gli animali che non si muoveva e sono stati determinati morti nel conteggio precedente potrebbe passare più tardi. <ol><li> Al giorno 0, all'inizio dell'esperimento contare il numero totale di vermi in ogni pozzetto. Censore pozzi che contengono più di 18 animali l'analisi come animali in questi pozzi non avrà abbastanza OP50 e mostrerà effetti della restrizione dietetica. </li><li> Al fine di aumentare la possibilità che gli animali muovono scuotere il 96 pozzetti su una micropiastra shaker per 2 minuti. prima del conteggio. </li><li> In ogni conteggio data di registrazione della sessione, e il numero di animali chesi muovono come animali vivi. Movimento nel liquido è molto più facile che su terreni solidi e può essere indotta da luci forti. L'utilizzo di un ingrandimento superiore può aiutare a posto movimenti molto sottili come quelli della punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso l'unico movimento osservato negli animali molto vecchi. </li><li> Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> Ripetere il passo 2-4 ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali sono morti. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati. Questa sezione mostra un esempio di come tenere registri relativi ai dati durata generate da questo test e alcuni risultati rappresentativi. La figura 1A mostra un esempio di come registrare i dati vita durante questo test. Un foglio Excel viene utilizzato per tenere traccia della sopravvivenza delle popolazioni di ogni bene. Per ogni bene è coordinare nel piatto, ceppo, droga, la concentrazione del farmaco e il numero totale di animali vivi il giorno 0 (X0) è registrato all'inizio dell'esperimento. Registrare la data, così come il numero di vivere e di animali morti tre volte la settimana per seguire la sopravvivenza delle popolazioni diverse in ciascun pozzetto. Per tracciare il grafico dei risultati, calcolare la frazione di animali vivi per ogni giorno e la trama come una funzione del tempo in giorni. P-valori devono essere calcolati utilizzando pacchetti statistici come STATA o software simili. La durata media di C.elegans dipende dalla temperatura. Figura 1B mostra che le variazioni di temperatura dipendenti in vita sono accuratamente riprodotti dal microtitolazione base durata del test 22. Allo stesso modo, il test micropiastra riproduce cambiamenti nella vita da mutanti segnalato per durata della vita che si differenziano dagli animali selvatici N2 tipo 23-24 25 (Fig. 1C). Il test può anche essere usato per fare dichiarazioni più quantitativa. In media Fig1D durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine 7. Ogni punto di dati rappresenta la durata media di 7-12 popolazione, ognuno vive in un altro bene. Anche se il numero di animali per bene è relativamente bassa (5-15 animali) il ben-to-bene variazione è relativamente piccolo come si può vedere dalle barre di errore. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La micropiastra basato durata saggio riproduce accuratamente cambiamenti nella vita riportati in letteratura. (A) Esempio di dati raccolti in un foglio di calcolo excel. Durante ogni sessione di conteggio data, coordinate del bene e del numero di animali vivi e morti è stato registrato. All'inizio dell'esperimento, il numero totale di animali in ciascun pozzetto è stata determinata. (B) Curva di sopravvivenza di tipo selvatico (N2) gli animali cresciuti a 20 ° C e 25 ° C. (C) Le curve di sopravvivenza dei ceppi portatori di mutazioni che influenzano la durata della vita. Tutti e quattro i ceppi sono stati analizzati in parallelo a 20 ° C. (D), curva dose-risposta Mirtazepine N2 animali trattati. Media durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine. Barre di errore indicano la SEM di 8 pozzi per condizione. 5. Materiali. M9 tampone, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g di KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6.0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 900 ml </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Metalli in tracce soluzione <ul><li> 1,86 g di Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g di CuSO 4 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave e conservare al buio. </li></ul> S-basale medio, 1000 ml <ul><li> 5,9 g di NaCl </li><li> 50 ml di fosfato di potassio 1M, pH 6.0 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Lasciar raffreddare la soluzione e si aggiunge 1 ml di colesterolo 5 mg / ml (sciolto in Et-OH). </li></ul> Citrato di potassio 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g tripotassico citrato </li><li> 26,3 acido citrico monoidrato </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-completo di media, 1000 ml <ul><li> 977 mL S-basale </li><li> 10 ml 1M citrato di potassio pH 6 (sterile) </li><li> 10 ml Trace metalli soluzione (sterile) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 3 ml 1M MgSO 4 (sterile) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 NaCl </li><li> 2.5g peptone(A partire dalla caseina, pancreas digerire) </li><li> Agar 17g </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 975 ml e un bar mescolando </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> 0,5 mL di 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 1 mL di Colesterolo 5 mg / ml in etanolo </li><li> 1 mL di 1M MgSO 4 (sterile) </li><li> Potassiumphosphate 25 mL di tampone, pH 6,0 (sterile) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Triptone </li><li> 24 g Estratto di lievito </li><li> 4 mL di glicerolo </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> aggiungere 100 ml di 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mm Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Sciogliere in 670 mL sterili S-completo, fanno 10 ml o 45 ml aliquote. </li><li> Conservare a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 ml di acqua sterile deionizzata </li><li> Sterile filtrato e aliquota </li><li> Conservare a -20 ° C. </li><li> Utilizzare ad una concentrazione finale di 50 mg / ml </li></ul> 250ug / ml di amfotericina B, 4 mL <ul><li> 1mg amfotericina B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Conservare a -20 ° C </li><li> L'uso ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml </li></ul>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato permette di misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Come mostrato nella sezione risultati rappresentativi si replica modo affidabile i risultati precedenti e fornisce informazioni quantitative. Da questo test siamo riusciti a screening oltre 89.000 molecole per il loro effetto sulla durata della vita C.elegans. Ai fini della droga di screening, che misura la durata della vita in un formato da 96 pozzetti micropiastra ha diversi vantaggi rispetto al classico saggio solido media. Si riduce il lavoro necessario per la preparazione dei media, la quantità di spazio di incubazione e la quantità di farmaco richiesto. Il formato a 96 pozzetti e la configurazione microscopia permettono l&#39;automazione del test per intero proiezioni elevato throughput. Durante lo sviluppo del test più valori per ogni variabile e loro combinazioni sono stati testati per i loro effetti sulla durata della vita C.elegans. Questi test inclusi diversi concentrazione OP50 variano da 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), diverso numero di vermi per pozzetto vanno da 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worm / pozzetto), i volumi di cultura diversa che vanno dal 40-150 microlitri per bene (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e cambiamenti nella composizione del buffer. Se alimentato con un Carbenicillin resistente OP50, né Carbenicillin né amfotericina B in concentrazioni indicate sono risultate influenzare C.elegans durata. Agitazione continua dolce delle lastre, come spesso consigliato nella cultura C.elegans liquido, è stato trovato dispensabile per piccoli volumi utilizzati in questo test. Agitando delicatamente ma è necessario se micropiastre con i più grandi pozzi devono essere utilizzati. I valori indicati in questo protocollo sono stati accuratamente selezionati sulla base di confronto statistico delle diverse condizioni testate. La caratteristica più sorprendente di questo saggio è probabilmente il fatto che C.elegans possono essere tenuti in piastre a 96 pozzetti che sono sigillati con nastro adesivo. Side-by-side paragoni non hanno evidenziato alcuna differenza nella durata della vita degli animali coltivate in piastre non sigillati, in piatti sigillati con un sigillante di plastica, o in lastre sigillate con sigillanti che permettono lo scambio d&#39;aria. In tutte e tre le condizioni, gli animali hanno sviluppato molto omogeneo da L1 agli adulti gravide entro 65 ore e ha mostrato durata della vita molto simili. Gli animali cresciuti in parallelo su NGM sviluppato leggermente più veloce, ma questa differenza era indipendente dalla presenza o meno di un sigillante. Il protocollo presentato è basato su batteri vivi, ma può essere adattato per i batteri morti. Tuttavia, in un test di liquido un batterio singolo sopravvissuti possono rapidamente si moltiplicano e ripopolare la cultura. Nelle nostre mani, l&#39;unico modo affidabile per uccidere i batteri nella misura in cui essi possono essere utilizzati per la coltura liquida è per trattamento prolungato dei batteri con raggi gamma. Un punto importante da considerare nella progettazione di un esperimento di vita è il potere di rilevazione. Dipende dalla dimensione dell&#39;effetto, l&#39;effetto del farmaco di interesse deve essere testato in pozzi multipli. In un saggio tipico di 4 farmaci trattati e 4 pozzetti di controllo, che corrisponde approssimativamente a 40-50 animali ciascuno, dovrebbe essere sufficiente per rilevare un aumento del 30% nel ciclo di vita in più del 95% degli esperimenti. Aumenta del 14% vengono rilevati solo nel 60% dei casi e richiedono pertanto pozzi più replicare. La ricchezza di dati di durata generati da questo test può essere usato per sviluppare o sperimentare ceppo specifico Gompertz modelli parametrici 1. Questi modelli Gompertz sono utili per determinare la potenza di rilevazione e di stimare il numero di falsi positivi e negativi per i grandi schermi. Abbiamo verificato le previsioni di questi modelli in esperimenti non vedenti e li ha usati per stimare il numero di falsi negativi in ​​schermi di grandi dimensioni (risultati non pubblicati). In sintesi, possiamo anticipare che il test presentati saranno di grande utilità per identificare piccole molecole che estendono la durata della vita di C.elegans e di studiare i meccanismi alla base.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Chiamata anche Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>Il FUDR viene inattivato dal calore; scongelare in acqua fredda</td></tr><tr><td>Mianserina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Utilizzare come controllo positivo a una concentrazione finale di 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Ciproheptadina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Controllo positivo alternativo a una concentrazione finale di 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Nastro sigillante</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>In poliestere, non sterile</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Non trattata, trasparente, confezionata singolarmente, in polistirene sterile</td></tr><tr><td>Flacone Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>Utilizzato per volumi elevati</td></tr></tbody></table>

misura caenorhabditis elegans life span in 96 piastre per microtitolazione bene

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Durata della vita è un processo biologico regolato da diversi percorsi genetici. Una strategia per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento è quello di studiare gli animali che le mutazioni in porto i componenti di età-regolamentazione percorsi. Se queste mutazioni turbare la funzione del tempo regolamentare percorso e quindi modificare la durata di tutto l&#39;organismo, forniscono importanti intuizioni meccanicistica 1-3. Un&#39;altra strategia per studiare la regolazione della durata della vita è quella di utilizzare piccole molecole per perturbare età regolamentazione percorsi. Fino ad oggi, un certo numero di molecole sono conosciuti per prolungare la durata della vita nei vari organismi modello e sono utilizzati come strumenti per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento 4-16. Il numero di molecole individuate finora è piccola rispetto alla genetica &quot;toolset&quot; che è disponibile a studiare la biologia dell&#39;invecchiamento. Caenorhabditis elegans è uno dei modelli di principio utilizzati per studiare l&#39;invecchiamento grazie alla sua ottima genetica e la durata breve di tre settimane. Più recentemente, C.elegans è emerso come organismo modello per schermi fenotipo farmaco a base 5,7,16-20 a causa delle sue ridotte dimensioni e la sua capacità di crescere nelle piastre di microtitolazione. Presentiamo qui un test per misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Il test è stato sviluppato e utilizzato con successo per lo screening grandi biblioteche per le molecole che si estendono C.elegans durata 7. L&#39;affidabilità del test è stata valutata in prove multiple: in primo luogo, misurando la durata di vita di animali di tipo selvatico cresciuto a diverse temperature, in secondo luogo, misurando la durata di mutanti con durata di vita alterati, in terzo luogo, misurando i cambiamenti nella durata della vita in risposta a diverse concentrazioni del Mirtazepine antidepressivo. Mirtazepine ha già dimostrato di prolungare la durata della vita in C.elegans 7. I risultati di questi test mostrano che il saggio è in grado di replicare i risultati precedenti da altri test ed è quantitativa. Il formato micropiastra rende questo saggio durata compatibile con i sistemi automatizzati di gestione dei liquidi e consente l&#39;integrazione in piattaforme automatizzate.

In questo protocollo vi presentiamo un metodo per misurare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Durata della vita in 96 piastre microtitolazione bene.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

La durata della vita è un processo biologico regolato da diverse vie genetiche. Una strategia per indagare la biologia dell'invecchiamento consiste nello studiare animali che presentano...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la durata della vita di vermi marini del genere *Elgan* trattati con farmaci di interesse. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando l'OP 50, un ceppo batterico utilizzato per nutrire i vermi. Successivamente, viene generata una popolazione di vermi sincronizzata per età e seminata in piastre a 96 pozzetti insieme ai batteri nutrizionali OP 50.Nel corso dei due giorni successivi, i vermi crescono fino allo stadio larvale L4 e viene aggiunto il farmaco FUDR per prevenire la riproduzione. Il giorno seguente, i vermi raggiungono l'età adulta e i farmaci di interesse vengono aggiunti nei singoli pozzetti. Da questo momento in poi, il numero di vermi vivi e morti viene determinato ogni due o tre giorni, fino a quando tutti i vermi non sono deceduti.L'osservazione viene effettuata utilizzando un microscopio invertito e il numero di vermi morti e vivi viene registrato in ogni sessione. Ciao, sono Greg Solis. Sono nel laboratorio di Petro presso il Dipartimento di Fisiologia Chimica dell'Istituto di Ricerche Scripps.Oggi vi mostrerò come sincronizzare i vermi e distribuirli in piastre microtitolazione a 96 pozzetti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente l'identificazione rapida di molecole che prolungano la durata della vita e C. elegans. Cominciamo dunque.Per preparare i batteri per l'alimentazione di C. elegans, iniziare sette giorni prima inoculando cinque millilitri di TB contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e 0,1 microgrammi per millilitro di tetraciclina con una singola colonia OP50, e incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius in un agitatore per batteri. La mattina seguente, diluire la coltura notturna di OP50 in un rapporto di 1:2000 in 300 millilitri di TB contenenti 50 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare la coltura in un agitatore per batteri da otto a dodici ore a 37 gradi Celsius, fino al raggiungimento della saturazione. Non permettere alla coltura di crescere per più di 14 ore.Trasferire l'OP 50 in un tubo sterile per centrifugazione pre-pesato. Pellettare l'OP 50 mediante centrifugazione per 10 minuti a 3.500 giri/min o a 2.200 ×g in una centrifuga da banco. Scartare il soprannatante S, risospendere il pellet di OP 50 in acqua distillata e ripetere la centrifugazione per ottenere il pellet. Eseguire questo lavaggio due volte, dopo il secondo lavaggio.Lavare accuratamente ed eliminare completamente tutta l'acqua rimanente. Pesare il tubo da centrifuga contenente il pellet e sottrarre il peso del tubo da centrifuga vuoto per determinare il peso del pellet. Successivamente, risospendere completamente il pellet in S Complete fino a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.Non devono rimanere grumi. La concentrazione di 100 milligrammi per millilitro di OP 50 dovrebbe corrispondere a due volte 10 alla 10 batteri per millilitro. Utilizzare lo spettrofotometro per determinare il numero di batteri per millilitro se è nota la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per millilitro.Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione nutritiva OP 50 a due volte 10 alla 10 batteri per millilitro. Infine, conservare la soluzione OP 50 a quattro gradi Celsius fino al suo utilizzo per la coltura dei vermi, al fine di generare una popolazione di vermi sincronizzata per età. Iniziare nel tardo pomeriggio del giorno meno sei con una piastra NGM di cinque-dieci giorni, sulla quale la popolazione di vermi consiste principalmente di larve L1 in stato di stenti.Sterilizzare un'ansa metallica riscaldandola brevemente su una fiamma di bunsen. Lasciarla raffreddare. Successivamente, utilizzare l'ansa fredda per prelevare frammenti di agar dalla piastra contenente i vermi in stato di digiuno.Trasferire alcuni di questi frammenti su una nuova piastra NGM da 10 centimetri seminata con OP50. Incubare i vermi per circa 65 ore a 20 gradi Celsius fino a quando la maggior parte della popolazione di vermi non sia costituita da adulti fully grown. Il tempo necessario perché gli animali L1 privati di cibo crescano fino a diventare adulti fully grown può variare da ceppo a ceppo.Dopo l'incubazione, raccogliere i vermi dalla piastra da 10 centimetri lavandoli via con cinque-dieci millilitri di acqua sterile. Trasferire la soluzione di vermi in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i vermi centrifugando per due minuti in una centrifuga da banco a 1.200 giri al minuto o 280 volte G. Eliminare il soprannatante e aggiungere 10 millilitri di acqua.Ripetere il passaggio di lavaggio, rimuovere il sopranatante e aggiungere cinque millilitri di soluzione di ipoclorito appena preparata. Incubare con soluzione di idrossido di sodio per cinque minuti a temperatura ambiente fino a quando i vermi si aprono. Assicurarsi di vortexare delicatamente ogni minuto.Monitorare l'andamento della reazione al microscopio stereoscopico non appena tutti gli adulti si saranno sciolti. Aggiungere cinque millilitri di tampone M nine per neutralizzare la reazione. Lavare le uova tre volte con 10 millilitri di tampone M nine centrifugando per due minuti a 2.500 giri al minuto o a 1.100 × g. Successivamente, lavare le uova una volta con 10 millilitri di S completo centrifugando per due minuti a 2.500 giri al minuto o a 1.100 × g. Rimuovere il surnatante.Aggiungere 10 millilitri di S completo e trasferire la soluzione in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 30 millilitri di S completo per ottenere un volume finale di 40 millilitri. Agitare delicatamente il tubo tutta la notte a temperatura ambiente su un mutatore o dispositivo simile per seminare le piastre per animali il giorno successivo verso mezzogiorno.Sotto una lente stereoscopica, verificare se i vermi sono schiusi durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella soluzione S completa contando il numero di vermi in gocce da 10 microlitri. Utilizzando una lente stereoscopica, contare almeno 10 gocce per ogni campione.Resus.Sospendere i vermi a una concentrazione di 80-100 vermi per millilitro. Nel mezzo S completo, aggiungere carbenicillina fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro e anfotericina B fino a una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per millilitro. Agitare su un mutatore.Se si preparano quantità maggiori di vermi, utilizzare un flacone non clon da 600 millilitri con tappo filtrante. Alle 14:30 aggiungere l'OP 50 preparato nella prima parte a una concentrazione finale di sei milligrammi per millilitro. Riporre nuovamente l'OP 50 a quattro gradi Celsius. Trasferire 120 microlitri della soluzione di vermi con OP 50 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente.Assicurarsi di mantenere i vermi e la sospensione mentre si pipetta; sigillare la piastra utilizzando un sigillante adesivo per evitare contaminazioni ed evaporazione. Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per due minuti e incubare per due giorni a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. Successivamente, per sterilizzare gli animali, aggiungere 30 microlitri di una soluzione madre di FUDR 0,6 millimolare in ogni pozzetto.Questo passaggio porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP 50 da sei milligrammi per millilitro a cinque milligrammi per millilitro. Sigillare la piastra utilizzando sigillanti adesivi e agitare per due o tre minuti su un agitatore per micropiastre. Se l'OP 50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno meno due, è importante aggiungere il FUDR prima di mezzogiorno e riconsegnare le piastre all'incubatrice a 20 gradi Celsius entro le 9:00 del giorno successivo.La maggior parte degli animali dovrebbe essere adulta e contenere diverse uova. Aggiungere a ciascun campione i farmaci di cui si vuole testare l'effetto sulla durata della vita alla concentrazione desiderata. Se si sciolgono i farmaci in DMSO, la concentrazione finale di DMSO non dovrebbe superare lo 0,6%, poiché concentrazioni di DMSO superiori allo 0,6% accorciano la durata della vita di *C. elegans* dopo l'aggiunta del farmaco.Sigillare le piastre con un sigillante adesivo e agitarle per due o tre minuti su un agitatore per piastre microlitro. Riporre le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius. L'aggiunta dei farmaci può occasionalmente causare la morte di alcuni animali per piastra, specialmente se si utilizza un solvente diverso dall'acqua.Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza di animali morti. In genere, dovrebbero esserci meno di 10 animali morti per ogni piastra da 96 pozzetti. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius per due giorni, in modo da permettere all'ossigeno fresco di entrare in coltura. Rimuovere il sigillante.Attendere un minuto e sigillare nuovamente la piastra. Agitare la piastra per due o tre minuti su un agitatore per piastre microtitolazione, ripetere una volta ogni settimana al quinto giorno della vita adulta, aggiungere cinque microlitri della soluzione OP50 a 100 milligrammi per millilitro preparata in precedenza in ciascuno dei 96 pozzetti per prevenire la morte per fame. I vermi vengono valutati per la durata della vita in base al loro movimento tre volte a settimana dall'inizio dell'esperimento fino alla loro morte.Utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo 2x o 2,5x per osservare i vermi in piastre a 96 pozzetti al giorno zero, all'inizio dell'esperimento. Contare il numero totale di vermi in ciascun pozzetto.Pozzetti del sensore che contengono più di 18 animali dall'analisi, poiché in questi pozzetti non ci sarà abbastanza OP 50 e si manifesteranno effetti di restrizione dietetica in ogni sessione di conteggio. Registrare la data e il numero di animali che si muovono come animali vivi. Il movimento e il liquido sono molto più facili rispetto ai mezzi solidi e possono essere indotti da luci intense.L'utilizzo di un ingrandimento maggiore può aiutare a individuare movimenti molto sottili, come quelli alla punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso gli unici osservati negli animali molto anziani. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius.Ripetere le sessioni di conteggio ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali non saranno morti. Questa è la progettazione di un foglio Excel per registrare i dati di durata della vita per ciascun pozzetto. Nelle coordinate della piastra vengono registrate la linea, la concentrazione del farmaco, e il numero totale di animali vivi al giorno zero, all'inizio dell'esperimento.Registrare la data e il numero di animali vivi e morti tre volte alla settimana per monitorare la sopravvivenza delle diverse popolazioni in ogni pozzetto. Questa figura mostra i risultati relativi a *C. elegans*, curve di longevità registrate a 20 gradi Celsius e 25 gradi Celsius. Il saggio di longevità basato su microtiter riproduce accuratamente le variazioni della longevità dipendenti dalla temperatura.In modo analogo, come mostrato qui, il saggio in piastra microtitolata riproduce le variazioni di durata della vita di mutanti descritti come aventi una longevità differente rispetto ai due animali di tipo selvatico N. Questa figura illustra come dosi crescenti di mirtazapina influenzino la durata media della vita di sea elegance. I dati ottenuti mediante il saggio in piastra microtitolata sono sufficientemente quantitativi da permettere di determinare relazioni dose-risposta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per esaminare ampie librerie chimiche alla ricerca di molecole che prolunghino la durata della vita e see elegance.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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