Name: Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Scopri il protocollo di coltura cellulare aderente in sistema chiuso con i vasi HYPERStack di Corning. Questo metodo utilizza materiali permeabili ai gas per massimizzare la resa e ridurre i rischi di contaminazione.

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Gli autori desiderano ringraziare Lonza Walkersville per la loro assistenza con conoscenza del sistema chiuso, il design borsa, prestito di sigillanti borsa e saldatori, oltre a creare la borsa a schemi HyperStack.

1. HyperStack nave - gas permeabili Background Material Technology <ol><li> La nave è una nave HyperStack multistrato per la coltura di cellule del sistema chiuso che si basa sullo scambio di gas attraverso un film di gas 76.2micron permeabile polimero per il metabolismo cellulare. </li><li> La nave HyperStack differisce dai vasi delle cellule più tradizionali della cultura, nel senso che non ha una "spazio di testa" al di sopra delle celle all'interno della nave. Piuttosto che contiene questo "spazio di testa" per lo scambio di gas all'interno della nave, i prodotti del gas permeabili sono spazi aerei (di seguito "tracheale" spazi) sotto ogni camera di cultura che è aperto verso l'atmosfera. </li><li> Questo spazio tracheale permette alle cellule in crescita in ogni comparto coltura cellulare della nave per avere scambi di gas equivalente. </li><li> Il film di gas permeabile permette lo scambio di gas si verifichi, pur mantenendo un ambiente sterile. Tutte le manipolazioni di liquidi per ciascuno degli strati più avvenire attraverso una porta singola voce. </li></ol> 2. HyperStack nave Component Summary <ol><li> Il Stackette è l'individuo vano di coltura cellulare che si compone della piastra superiore e la pellicola di gas permeabili. Le cellule sono coltivate all'interno di questo comparto. </li><li> Il collettore liquido collega ciascuno dei 12 strati stackette insieme all'interno di un modulo HyperStack. I moduli sono collegati con tubi a formare vasi in multipli di 12 strati. Il collettore permette all'utente di fare una manipolazione di liquidi per l'intero vaso. </li><li> Il collettore Air collega anche gli strati stackette insieme, ma è usato per spostare l'aria dalla nave quando si verificano le aggiunte di liquidi. Esso contiene una linea di riempimento per l'utilizzo durante il riempimento. </li><li> Lo spazio tracheale è lo spazio all'aperto tra ogni strato stackette, permettendo lo scambio di gas si verifichi attraverso il cinema gas permeabili ogni layer '. </li><li> Il tubo di manipolazione dei liquidi è collegato al collettore liquido e viene usato per fare tutto chiuso manipolazioni fluido sistema. Questo componente può essere personalizzato. </li><li> Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell'aria, contiene un filtro dell'aria, ed è utilizzato per rilasciare l'aria in eccesso mantenendo la sterilità. </li><li> Il tubo caccia dispone di un filtro e morsetto e sono collegati al tubo di gestione dei liquidi e vengono utilizzati per evacuare il fluido dal tubo di gestione dei liquidi dopo il riempimento della nave. </li><li> Il manipolatore Stack Corning o CSM è un dispositivo di gestione per aiutare a collocare i vasi nelle posizioni corrette durante l'uso. </li><li> Il cuneo di riempimento è un acciaio inossidabile assistere utilizzato quando compilare manualmente i vasi HyperStack. </li></ol> 3. Diffusione risultati di gas attraverso film permeabile ai gas usato nei vasi HyperStack <ol><li> Nei sistemi tradizionali la crescita cellulare con spazio di testa ventilati, l'ossigeno nei media è impoverito una media del 50% nell'arco di 3 giorni in coltura. (Figura 1) </li><li> Nello stesso sistema crescita cellulare, il gradiente di ossigeno in un altezza di 3 mm di media è quasi il 50% maggiore alla media per spazio di testa all'incrocio di quanto lo sia a livello cellulare. (Figura 2) </li><li> La diffusione di ossigeno attraverso il film di polistirene 76.2micron gas permeabili è uguale alla diffusione attraverso i media di 2,6 millimetri. La pellicola permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack permette lo scambio di gas si verifichi a livello cellulare. </li><li> La% di ossigeno nello spazio tracheale dei vasi HyperStack rimane costante, come le cellule crescono a confluenza. (Figura 3) </li></ol> 4. Borsa media Preparazione <ol><li> I-12 HyperStack nave strato prende 1.3L dei media e il HyperStack-36 nave strato prende 3.9l dei media. </li><li> Prima di inoculare il supporto insaccato, se i livelli sierici deve essere utilizzato, tubo di saldare il sacchetto siero alla borsa media e mescolare accuratamente. </li><li> Morsetto fuori circa 300 ml di mezzi di comunicazione nella busta utilizzando fascette grossa borsa. Questo garantirà tutte le cellule inoculate vengono utilizzati durante il riempimento e nessuno è ancora nel sacchetto dei media. Luogo borsa multimediale su supporto borsa. </li></ol> 5. Media inoculando <ol><li> Riempire una siringa con un tubo attaccato con sospensione cellulare. Tubo di saldatura "tubo 3 / 16 da una siringa contenente sospensione cellulare alla borsa media. </li><li> Iniettare la sospensione cellulare in Borsa Media e mescolare bene. </li></ol> 6. Compila procedura <ol><li> Tubo di saldare il sacchetto inoculati media della nave HyperStack di 3 / 8 "tubing manipolazione dei liquidi. (Utilizzando sterili collega o collega Multipurpose (PPM), è possibile anche allegare la borsa media per nave). </li><li> Chiudere i morsetti sulla gestione dei liquidi e tubi inseguire sul HyperStack. </li><li> Posizionare i 36 Vessel strato HyperStack nel CSM in posizione di carico; agganciare il tubo di sfiato del filtro nel morsetto tenendosi il CSM. Serrare il coperchio e spostare il CSM in posizione di riempimento. Mettendo la nave nella posizione corretta riempimento, il filtro dell'aria è ora in posizione più alta per evitare bagnare durante il funzionamento di riempimento. L'angolo di 10 ° permette equilibrzione del liquido negli strati durante il riempimento. Il HyperStack-12 nave strato posizionato su un lato sul cuneo di riempimento è nella posizione corretta per il riempimento. </li><li> Aria limpida dalla linea di riempimento posizionando la borsa allo stesso livello della nave HyperStack (non superiore). Mantenere la fascetta del tubo caccia chiusa, aprire la fascetta del tubo liquido manipolazione e la pinza borsa mezzi di comunicazione per consentire fluido per entrare nella nave. </li><li> Utilizzando il supporto borsa, sollevare la borsa media per aiutare il flusso di sospensione cellulare nel vaso. </li><li> Riempire il serbatoio, fino tutti i supporti inoculati entra nella nave, il ml 300 di media dovrebbero ancora rimanere nella parte superiore della borsa media. Rimuovere la fascetta dal sacchetto supporto per continuare riempire il serbatoio. Come liquido si avvicina il collettore d'aria superiore, rallentare il tasso di riempimento abbassando la borsa media al fine di prevenire più di riempimento. Portare lentamente il livello del liquido per la linea di riempimento e bloccare il tubo liquido di movimentazione. </li></ol> 7. Procedura per l'isolamento di blocco a liquido negli strati <ol><li> Portare la nave HyperStack nel CSM in posizione di isolamento in modo entrambe le serie di collettori sono nella posizione più alta e più bassa la borsa dei media sotto l'altezza del vaso. I-12 HyperStack nave livello può essere sollevato in posizione di isolamento mettendo una mano sul fianco della nave e con l'altra per sollevare il cuneo di riempimento. </li><li> Con il filtro di caccia tenuto in posizione verticale, aprire il morsetto caccia tubo. Questo vuoto o inseguire i media nel tubo di gestione dei liquidi nuovamente dentro il sacchetto dei media. Una volta che il tubo è vuoto, chiudere il morsetto sul tubo borsa media. </li><li> Mantenere il filtro caccia tubo in posizione verticale, aprire il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi sul HyperStack per consentire eventuali residui di liquido di entrare ed equilibrare nel vaso. Attendere 1-2 minuti per questo si verifichi. </li><li> Girare la nave HyperStack nel CSM in modo che i collettori sono a sinistra. Abbassare la nave alla posizione del carico sul CSM. Dondolo la HYPEStack-12 nave strato leggermente a sinistra consentirà la rimozione del cuneo di riempimento. Chiudere i morsetti sia sulla caccia e il tubo di gestione dei liquidi. </li><li> La borsa media possono ora essere smontato o può rimanere attaccato per un uso successivo nella procedura di raccolta. Per memorizzare il sacchetto attaccato i media, tira il sacchetto vuoto e tutta la carta rimasta nel sacco, e posto sotto le bande conservando nel cassetto di stoccaggio della nave HyperStack. </li><li> Spostare la nave HyperStack alla incubatrice. Nell'effettuare la cura nave da adottare per mantenere liquido di entrare nel filtro di sfiato. Questo si ottiene inclinando la fine del molteplice HyperStack leggermente verso l'alto. </li></ol> 8. Harvest protocollo <ol><li> Per iniziare la procedura di raccolta, tubo saldare la soluzione delle cellule dissociazione e borse spegnere insieme per formare l'assemblea sacchetto di raccolta. Assicurarsi che tutte le fascette tubi sono chiusi. (Usa cartoon dimostrare) </li><li> Rimuovere nave HyperStack dal termostato, rilasciare il sacchetto dei media da sotto le bande di sostegno, e appendere allo stand borsa. Mettere il recipiente nel CSM in posizione di carico e serrare il coperchio per fissare il vaso. Agganciare il tubo di sfiato nel morsetto holding e spostare il CSM in posizione di riempimento. </li><li> Assicurarsi che il sacchetto dei media presso lo stand sacchetto è appeso inferiore al HyperStack, aprire il morsetto sul tubo borsa media e tubi di gestione dei liquidi della nave di consentire ai media di fluire nel sacchetto attaccato. </li><li> Una volta che la nave è di circa ¾ vuoto, modificare le impostazioni del CSM per la posizione finale vuota. Quando la nave HyperStack e il tubo di gestione dei liquidi sono vuote, sollevare il tubo di inseguire i media oltre il morsetto sul tubo speso borsa media, quindi chiudere sia il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi e la fascetta sul tubo speso borsa media. </li><li> Sostituire il sacchetto passato mezzi di comunicazione con l'assemblea sacchetto di raccolta mediante saldatura di tubi e aumentare l'altezza della riunione di cella borsa dissociazione sopra l'altezza del HyperStack utilizzando il supporto borsa. </li><li> Posizionare il CSM in posizione di equilibrio. Aprire la cella tubo soluzione dissociazione morsetto e trasferire la soluzione nella HyperStack. Quando il trasferimento è stato completato, chiudere le fascette sul tubo di gestione dei liquidi e la cellula tubi soluzione dissociazione. </li><li> Portare CSM in posizione di carico. Tenendo premuto il posizionamento orizzontale leva di apertura, agitare delicatamente la parte nave a fianco con la ruota, distribuendo la soluzione negli strati di cellule. La nave può occasionalmente essere restituiti alla posizione di equilibrio durante dondolo per mantenere un'equa distribuzione della soluzione. Esso non può essere visivamente evidente che gli strati sono completamente rivestiti, ma la soluzione dissociazione sarà equamente distribuita su tutta la superficie delle cellule. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuito, rilasciare la leva del CSM per bloccare il HyperStack in posizione di carico. Lasciare la HyperStack in questa posizioneper il tempo necessario per la dissociazione delle cellule. </li><li> Una volta che le cellule hanno staccato; torbidità utilizzando come guida, spostare il CSM in posizione di equilibrio. Si deve prestare attenzione a non digerire sulle celle. Aprire il morsetto spegnere borsa e il morsetto liquido HyperStack movimentazione tubi per consentire ai media spegnere per entrare nella nave. Chiudere il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi HyperStack una volta completato il trasferimento. </li><li> Riportare il CSM in posizione di carico e tenere premuto la leva di posizionamento orizzontale al rock lato nave a lato. </li><li> Utilizzando il supporto borsa, abbassare la posizione del gruppo raccolta borsa sotto il livello del HyperStack. Regolare il CSM in posizione di vuoto, aprire il tubo liquido nave gestione morsetto e trasferire la soluzione cellulare nella borsa spegnere. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare l'assemblea sacchetto raccolta dalla nave usando un sigillante tubo. La soluzione cellula è pronta per l'elaborazione. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati <ul><li> Raccogliendo tempo ha bisogno di essere ottimizzato per la conversione da una superficie di polistirene standard per la superficie permeabile polistirolo gas. Le cellule tendono a rilasciare velocemente sul prodotto HyperStack. </li><li> Per visualizzare le cellule al microscopio la gestione di sfiato e tubi liquido deve essere bloccato al largo. Mettere il recipiente HyperStack a testa in giù, con i collettori verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Passi di prevenzione possono essere adottate per evitare di bagnare i filtri durante l'uso che li farà smettere di funzionare. Da non più di riempire il serbatoio HyperStack e mantenendo il tubo di sfiato e di inseguire elevati quando i morsetti sono aperti, nessun bagnante dovrebbe verificarsi. </li><li> La pressione dei morsetti chiuso il tubo induce a rimanere chiuso dopo che i morsetti sono aperti. Pizzicare il tubo nella direzione opposta lo aprirà. </li><li> Tempo di flusso dei media entrando ed uscendo dal vaso HyperStack via a gravità si basa sulla differenza di altezza media tra il livello superiore della media della nave HyperStack e il livello superiore dei media nel contenitore multimediale. La distanza maggiore, più velocemente il flusso. La portata massima è limitata dalla valutazione dei filtri per 1.5L/min. </li><li> Mantenere adeguato volume di riempimento del serbatoio HyperStack impedirà la formazione di bolle d'aria nelle camere di crescita della cellula. Le bolle d'aria può verificarsi a causa di campionamento o incubando in un ambiente unhumidified a causa di perdita di acqua per evaporazione. La quantità e la frequenza di campionamento, nonché condizioni di incubazione determinerà se liquido, aggiungere da parte dell'utente finale. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esaurimento di ossigeno dei media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la diminuzione in mg / L di ossigeno a livello delle cellule in 3 giorni. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gradiente di ossigeno in media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la mg / L di ossigeno è maggiore ai media di intersezione spazio di testa che a livello cellulare. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Percentuale di ossigeno nello spazio tracheale del HyperStack durante la crescita delle cellule. La figura mostra che oltre il 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati, che fornisce ogni permeabile fondo pellicola di gas, rimane costante. Questo dimostra la capacità delle cellule di accesso di ossigeno durante la crescita di confluenza.

La nave HyperStack tecnologia gas permeabile è coperta da brevetto US #: 7745209. Gli autori sono dipendenti di Corning Life Sciences, Inc., che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.

Nave HyperStack ha coltivato con successo progettato, cellule primarie e staminali. Integrazioni del liquido all&#39;interno del serbatoio, sono stati condotti tramite connessioni sacco asettico da alimentazione per gravità e anche mediante pompaggio da un contenitore sterile media. La nave offre una maggiore di 2,5 volte aumento della superficie di crescita rispetto a un prodotto piatto impilati su lo stesso ingombro volumetrico. Il HyperStack-12 ha 6.000 cm 2 area di crescita, il HyperStack-36 ha 18 mila centimetri 2 Superficie crescita, e la HyperStack-120 ha 60.000 cm 2 di area di crescita. Aumentando la superficie, gli utenti sono in grado di produrre più cellule dalla popolazione stessa cella o lotto e ridurre la variabilità. Essi sono anche in grado di risparmiare spazio e / o lavoro utilizzando un numero di navi per raggiungere la stessa uscita cellulare, o aumentare la produzione di cellule senza l&#39;aggiunta di persone, suite camera bianca, o incubatori. Il sistema è prodotto con metodi a basso assemblaggio di particolato e senza l&#39;uso di collanti. Si tratta di un sistema chiuso che è confezionato con set di tubi e filtri, triple insaccate e fornito sterile.

<table><tbody><tr><td>Mezzo in sacca da 1,5 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350 ml di mezzo + 150 ml di siero (se richiesto)</td></tr><tr><td>Mezzo in sacca da 4,0 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600 ml di mezzo + 400 ml di siero (se richiesto)</td></tr><tr><td>Dispositivo HYPERStack-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo HYPERStack-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Wedge di riempimento</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore di stack</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di campionamento per sottoinsieme HyQtainer</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>Disattivatore in sacca da 600 ml (IMDM con FBS al 10%)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare da 600 ml</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

chiuso sistema cultura protocollo cellulare con imbarcazioni hyperstack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Grandi colture di cellule aderenti del volume è attualmente standardizzate sui prodotti cartilagine di accrescimento delle cellule impilate quando perline microcarrier non sono una scelta ottimale. Vasi HyperStack permettono scala sistema chiuso a partire dai prodotti attuali piastra impilati e fornisce&gt; 2,5 volte più cellule nel ingombro volumetrico stesso. I vasi HyperStack funzione di tramite materiale permeabile ai gas, che consente lo scambio di gas si verifichi, eliminando quindi la necessità di spazio di testa interna all&#39;interno di una nave. L&#39;eliminazione di spazio di testa permette il vano in cui la crescita delle cellule avviene per essere minimizzato per ridurre lo spazio, permettendo più strati di superficie crescita cellulare all&#39;interno della stesso ingombro volumetrico. Per molte applicazioni, come la terapia cellulare o di produzione di vaccini, un sistema chiuso è necessario per la crescita cellulare e la raccolta. La nave HyperStack consente inoltre di cellule e reagenti e la rimozione mediante sonda dai sacchetti media o altri metodi. Questo protocollo spiegherà la tecnologia alla base del materiale permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack, i risultati diffusione del gas per soddisfare le esigenze metaboliche di cellule, sistema chiuso protocolli di crescita cellulare, e diversi metodi di raccolta.

Una introduzione nel protocollo tecnologia, e la gestione dei Vasi HyperStack Corning e accessori utilizzati per l&#39;alta cultura resa cellule aderenti. Il protocollo mostrerà come utilizzare i vasi sistema chiuso per la raccolta delle cellule aumentando rispetto agli attuali prodotti di Piastra impilati.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

La coltura di cellule aderenti in grandi volumi è attualmente standardizzata sull'utilizzo di prodotti per la crescita cellulare a piastre sovrapposte quando le microsfere di supporto (microcarrier) non rappresentano la scelta ottimale.

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso corretto dei vasi Corning Hypers in sistema chiuso. Questo viene realizzato innanzitutto inoculando e riempiendo i vasi con il mezzo di coltura mediante il metodo a flusso per gravità. Successivamente, la sospensione cellulare viene isolata in ciascuno strato e le cellule vengono incubate.Dopo l'incubazione, il mezzo usato viene rimosso. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel raccogliere le cellule dai vasi dello stack hypers. Alla fine, si ottengono i risultati sulla diffusione dei gas per dimostrare la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita fino alla confluenza quando si utilizza il sistema chiuso dello stack hypers.Il principale vantaggio del vaso Hypers Stack con materiale permeabile ai gas è che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare. Eliminando lo spazio di testa nel vaso, il mio collega p pardo illustrerà ora un protocollo in sistema chiuso per l'utilizzo del vaso Hypers Stack. Il vaso Hypers Stack è composto da uno stat, ovvero il singolo compartimento per coltura cellulare costituito dalla piastra superiore e dal film permeabile ai gas.Le cellule vengono coltivate all'interno di questo compartimento. Il collettore liquido collega ciascuno degli strati tra loro all'interno di un modulo. I moduli sono collegati mediante tubi per formare vasi multipli di 12 strati.Il collettore consente all'utente di effettuare una singola manipolazione del fluido per l'intero dispositivo. Il collettore d'aria collega inoltre i vari strati stat tra loro, ma viene utilizzato per spostare l'aria dal dispositivo durante l'aggiunta di fluidi e contiene una linea di riempimento da utilizzare durante il riempimento tra ciascuno strato. Ogni strato stat è uno spazio aperto a contatto con l'aria, chiamato spazio tracheale, che permette lo scambio gassoso attraverso il film permeabile ai gas di ciascuno strato.Il tubo per la manipolazione dei liquidi è collegato al collettore dei liquidi ed è una componente personalizzabile utilizzata per effettuare tutte le manipolazioni dei fluidi in sistema chiuso, rilasciando l'aria in eccesso mantenendo al contempo la sterilità. Viene utilizzato il tubo di sfiato. Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell'aria e contiene un filtro per l'aria.Collegato al tubo per la movimentazione del liquido vi è il tubo di spurgo e il filtro, utilizzati per rimuovere il fluido dal tubo di movimentazione del liquido dopo il riempimento del vaso. In questo protocollo viene inoltre utilizzato il manipolatore Corning Stack (CSM), un dispositivo di manipolazione che agevola il posizionamento corretto dei vasi durante l'uso. In questa dimostrazione, la coltura cellulare in sistema chiuso viene illustrata per un vaso a 36 strati permeabile ai gas.Utilizzando un CSM, tuttavia, i dettagli per eseguire questa procedura su un vaso a 12 strati utilizzando una cuneo di riempimento sono disponibili nel protocollo scritto allegato. Preparare innanzitutto 3,9 litri di terreno in sacchetto prima di inoculare il tubo di terreno. Collegare il sacchetto di siero al sacchetto di terreno e mescolare accuratamente per ottenere la concentrazione desiderata di siero.Chiudere con mollette da sacca circa 300 millilitri di mezzo nel sacco utilizzando mollette grandi. Questo garantisce che tutte le cellule inoculate vengano utilizzate durante il riempimento e che non ne rimangano nel sacco del mezzo. Posizionare il mezzo su un supporto per sacche per inoculare il mezzo.Riempire una siringa collegata a un tubo con la sospensione cellulare. Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al sacchetto per il mezzo mediante saldatura del tubo. Tre pollici e sedici del tubo dalla siringa al sacchetto.Iniettare la sospensione cellulare nel sacchetto del mezzo e mescolare bene. Il sacchetto del mezzo inoculato può essere collegato al tubo per il travaso di liquidi da tre ottavi di pollice del recipiente mediante saldatura di tubi o l'utilizzo di connettori multifunzione. Oggi utilizzeremo la saldatura di tubi.Chiudere le pinze sui tubi di prelievo del liquido e sui tubi di spurgo del recipiente. Posizionare il recipiente a 36 strati in un CSM nella posizione di carico. Inserire il tubo del filtro di sfiato nella pinza di fissaggio sul CSM.Chiudere il coperchio e spostare il CSM nella posizione di riempimento per posizionare il filtro dell'aria nella posizione più alta, evitando così l'inzuppamento durante l'operazione di riempimento. L'angolo di 10 gradi permette inoltre l'equilibrazione del liquido tra gli strati durante il riempimento, eliminando l'aria dalla linea di riempimento. Posizionare il sacco del mezzo alla stessa altezza del recipiente, mantenendo chiusa la pinza del tubo di spurgo.Aprire la pinza del tubo per il trattamento dei liquidi e la pinza del sacchetto del mezzo per consentire al fluido di entrare nel recipiente. Utilizzando il supporto per sacchetto, sollevare il sacchetto del mezzo per favorire il flusso della sospensione cellulare nel recipiente. Riempire il recipiente fino a quando tutto il mezzo inoculato non sarà entrato nel recipiente.La parte superiore del sacco del mezzo dovrebbe ancora contenere 300 millilitri di mezzo. Rimuovere la pinza dal sacco del mezzo per continuare a riempire il recipiente quando il liquido si avvicina al collettore d'aria superiore. Ridurre la velocità di riempimento abbassando il sacco del mezzo per evitare un riempimento eccessivo.Portare lentamente il livello del liquido fino alla linea di riempimento e raggruppare il tubo di trasferimento del liquido. Portare il recipiente nel CSM in posizione di isolamento, posizionando entrambi i gruppi di collettori nella posizione più alta. Abbassare il sacchetto del mezzo al di sotto dell'altezza del recipiente.Tenendo il filtro di spurgo in posizione verticale, aprire la pinza del tubo di spurgo. Questo farà defluire il mezzo presente nel tubo di manipolazione liquidi nuovamente nel sacchetto del mezzo. Una volta svuotato il tubo, chiudere la pinza sul tubo del sacchetto del mezzo.Mantenere il filtro del tubo di caccia in posizione verticale. Aprire la pinza sul tubo di gestione del liquido del recipiente per permettere al liquido rimanente di entrare ed equilibrarsi nel recipiente. Attendere uno o due minuti affinché ciò avvenga.Successivamente, ruotare il contenitore nel CSM in modo che i collettori siano a sinistra. Abbassare il contenitore nella posizione di carico sul CSM. Chiudere le pinze su entrambi i tubi del sistema di trascinamento e di gestione del liquido.Il sacchetto del mezzo può ora essere rimosso dal recipiente, oppure può rimanere attaccato per essere utilizzato successivamente durante la procedura di raccolta. Per conservare il sacchetto del mezzo attaccato, arrotolare il sacchetto e posizionarlo sotto le fascette di ritenzione nel vassoio di stoccaggio del recipiente. Infine, spostare il recipiente nell'incubatrice. Quando si trasporta il recipiente, prestare attenzione a evitare che del liquido entri nel filtro di ventilazione d'aria.Questo viene eseguito inclinando leggermente verso l'alto l'estremità del collettore. Per iniziare l'assemblaggio del tubo per la raccolta, saldare insieme la soluzione dell'associazione cellulare e i sacchetti di arresto per formare il complesso del sacchetto di raccolta, assicurandosi che tutte le pinze dei tubi siano chiuse. Rimuovere il recipiente dall'incubatore e posizionarlo nel CSM nella posizione di carico.Rimuovere il sacchetto del mezzo dai fermi e appenderlo alla borsa. Successivamente, posizionarsi in piedi, stringere il coperchio per fissare il contenitore. Inserire il tubo di sfiato nella pinza di sostegno e spostare il CSM sulla posizione di riempimento.Assicurarsi che il sacchetto del mezzo sul supporto sia posizionato più in basso rispetto al recipiente. Aprire la pinza sulla tubatura del sacchetto del mezzo e sulla tubatura per la movimentazione del liquido del recipiente per permettere al mezzo di fluire nel sacchetto collegato. Quando il recipiente è circa tre quarti vuoto, modificare le impostazioni del CSM sulla posizione finale di svuotamento.Quando il contenitore e i tubi per la manipolazione del liquido sono vuoti, sollevare i tubi per far avanzare il mezzo oltre la pinza presente sul tubo del sacchetto per il mezzo esausto. Chiudere quindi sia la pinza sul tubo di manipolazione del liquido sia la pinza sul tubo del sacchetto per il mezzo esausto. Sostituire il sacchetto per il mezzo esausto con l'insieme del sacchetto di raccolta mediante saldatura dei tubi.Sollevare l'asssemblaggio del sacchetto per la dissociazione cellulare al di sopra dell'altezza del recipiente utilizzando il supporto per sacchetto. Posizionare il CSM sulla posizione di riempimento. Aprire la pinza del tubo della soluzione di dissociazione cellulare e la pinza dell'asssemblaggio del sacchetto di raccolta e trasferire la soluzione nel recipiente.Al termine del trasferimento, chiudere le pinze sulla tubatura di manipolazione del liquido e sulla tubatura della soluzione di dissociazione cellulare. Successivamente, portare il CSM in posizione di carico tenendo aperto il leva di posizionamento orizzontale. Agitare delicatamente il recipiente da un lato all'altro utilizzando la ruota, distribuendo la soluzione sui livelli cellulari.Il contenitore può occasionalmente essere riportato nella posizione di riempimento durante l'oscillazione per mantenere una distribuzione uniforme della soluzione. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuita, rilasciare la leva sul CSM per bloccare la posizione di riempimento. Lasciare il contenitore in questa posizione per il tempo di dissociazione richiesto per le cellule.Utilizzare la torbidità come indicatore per determinare il distacco delle cellule. Una volta distaccate, spostare il CSM nella posizione di carico. Aprire la pinza del sacchetto di arresto della reazione e la pinza del tubo per la manipolazione dei liquidi per permettere al mezzo di arresto della reazione di entrare nel recipiente.Chiudere la pinza sul tubo di trasferimento del liquido. Una volta completato il trasferimento, riportare il CSM nella posizione di carico e tenere la leva di posizionamento orizzontale per oscillare il recipiente da un lato all'altro. Utilizzando il supporto per borsa, abbassare la posizione dell'insieme del sacco di raccolta al di sotto del livello del recipiente.Regolare il CSM sulla posizione vuota. Aprire la pinza del tubo di movimentazione del liquido del recipiente e trasferire la soluzione cellulare nuovamente nel sacchetto di arresto della reazione. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare l'insieme del sacchetto di raccolta dal recipiente utilizzando un sigillatore per tubi.Ora la soluzione cellulare è pronta per essere processata nei tradizionali sistemi di crescita cellulare. Con Headspace, l'ossigeno nel mezzo si riduce in media del 50% nell'arco di tre giorni. In coltura, questo grafico mostra la diminuzione dei milligrammi per litro di ossigeno a livello delle cellule nel tempo nello stesso sistema di crescita; il gradiente di ossigeno attraverso un'altezza del mezzo di tre millimetri è quasi del 50% maggiore all'interfaccia tra il mezzo e Headspace rispetto al livello dello strato cellulare.Viene mostrata la percentuale di ossigeno nello spazio tracheale dello stack iper durante la crescita cellulare. Il grafico indica che, nell'arco di 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati, che fornisce a ciascun film permeabile ai gas una base costante, rimane invariata. Questo dimostra la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita fino alla confluenza.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riempire e raccogliere il contenuto del recipiente Corning Hypers stack in un sistema chiuso.

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Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l'utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.

Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet

Ecco un protocollo per far crescere cellule staminali pluripotenti (PSC) e cellule staminali neurali (NSC) in un sistema di coltura cellulare chiuso che consente la massima sterilità e riproducibilità, sostituendo la tradizionale cappa di biosicurezza e l'incubatore. Questa apparecchiatura è conforme alle linee guida sulle buone pratiche cliniche di fabbricazione (cGMP) e sulle buone pratiche cliniche di laboratorio (cGLP).

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Vi presentiamo un modello microfluidico cancro su chip, la tecnologia "Evolution Accelerator", che fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine in tempo reale della dinamica del cancro all'interno di condizioni ambientali ben definite a singola cellula livello. Si prevede che questa tecnologia funzionerà come modello in vitro per la ricerca fondamentale o lo sviluppo di farmaci preclinici.

Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

Qui presentiamo un protocollo per raccogliere cellule aderenti da palloni multistrato in modo semi-automatico chiuso utilizzando un sistema di centrifugazione controcorrente. Questo protocollo può essere applicato per la raccolta di celle aderenti e in sospensione da altre piattaforme di espansione cellulare con poche modifiche ai passaggi esistenti.

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere la produzione su larga scala di cellule aderenti attraverso un sistema completamente chiuso basato su microcarrier solubili di grado GMP. La coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane, cellule HEK293T e cellule Vero è stata convalidata e ha soddisfatto sia le richieste di quantità che i criteri di qualità per l'industria della terapia cellulare e genica.

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Scopri il protocollo di coltura cellulare aderente in sistema chiuso con i vasi HYPERStack di Corning. Questo metodo utilizza materiali permeabili ai gas per massimizzare la resa e ridurre i rischi di contaminazione.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

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