Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare il corretto utilizzo del sistema chiuso dei recipienti stack Corning Hypers. Ciò si ottiene inoculando e riempiendo prima i recipienti con il terreno tramite il metodo dell'alimentazione a gravità. Successivamente, la sospensione cellulare viene isolata in ciascuno degli strati e le cellule vengono incubate.

Dopo l'incubazione, il terreno esaurito viene rimosso. La fase finale della procedura consiste nel raccogliere le cellule dai vasi hyperstack. In definitiva, si ottengono risultati di diffusione del gas per mostrare la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita per raggiungere la cofluenza quando viene utilizzato il sistema chiuso hypers stack.

Il vantaggio principale del recipiente hypers stack con materiale permeabile ai gas è che fornisce una maggiore superficie per la crescita cellulare. Eliminando lo spazio di testa nel recipiente, il mio collega p pardo dimostrerà ora un protocollo di sistema chiuso per l'utilizzo del recipiente hypers stack. Il recipiente hypers stack è composto da uno stat, che è il singolo compartimento di coltura cellulare costituito dalla piastra superiore e dal film permeabile ai gas.

Le cellule vengono coltivate all'interno di questo compartimento. Il collettore di liquido collega ciascuno degli strati ette all'interno di un modulo. I moduli sono collegati con tubi per formare recipienti in multipli di 12 strati.

Il collettore consente all'utente di effettuare una manipolazione del fluido sull'intero serbatoio. Il collettore d'aria collega anche gli strati stat insieme, ma viene utilizzato per spostare l'aria dal recipiente quando si verificano aggiunte di fluido e contiene una linea di riempimento da utilizzare durante il riempimento tra ciascuno. Lo strato statistico è uno spazio all'aria aperta chiamato spazio tracheale, che consente lo scambio di gas attraverso il film permeabile ai gas di ogni strato.

Il tubo per la movimentazione dei liquidi è collegato al collettore del liquido ed è un componente personalizzabile utilizzato per effettuare tutte le manipolazioni dei fluidi del sistema chiuso per rilasciare l'aria in eccesso mantenendo la sterilità. Viene utilizzato il tubo di sfiato. Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell'aria e contiene un filtro dell'aria.

Collegati al tubo di gestione dei liquidi sono i tubi di inseguimento e il filtro, che vengono utilizzati per evacuare il fluido dal tubo di gestione dei liquidi dopo aver riempito il recipiente. In questo protocollo viene utilizzato anche il manipolatore Corning Stack o CSM, che è un dispositivo di movimentazione per aiutare a posizionare i recipienti nelle posizioni corrette durante l'uso. In questa dimostrazione, viene dimostrata la coltura cellulare a sistema chiuso per un recipiente a 36 strati permeabile ai gas.

Utilizzando un CSM, tuttavia, i dettagli per l'esecuzione di questa procedura su un recipiente a 12 strati utilizzando un cuneo di riempimento possono essere trovati nel protocollo scritto allegato. Iniziare preparando 3,9 litri di terreno in busta prima di inoculare il tubo del supporto. Bagnare la sacca di siero nella sacca del terreno e mescolare accuratamente per ottenere la concentrazione sierica desiderata.

Bloccare circa 300 millilitri di supporto nel sacchetto utilizzando i morsetti per sacchetti grandi. In questo modo si garantisce che tutte le cellule inoculate vengano utilizzate durante il riempimento e che non ne rimangano nella sacca del terreno. Posizionare il supporto su un supporto per sacchetti per inoculare il supporto.

Riempire una siringa attaccata al tubo con sospensione cellulare. Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare alla sacca del terreno mediante saldatura del tubo. Tre tubi da oltre 16 pollici dalla siringa alla borsa.

Iniettare la sospensione cellulare nella sacca del terreno e mescolare bene. La sacca per terreni inoculati può essere fissata ai tre tubi per la manipolazione dei liquidi da oltre otto pollici del recipiente mediante saldatura a tubo o utilizzando connettori multiuso. Oggi utilizzeremo la saldatura dei tubi.

Chiudere i morsetti sui tubi di movimentazione dei liquidi e di inseguimento del recipiente. Posizionare il recipiente a 36 strati in un CSM in posizione di carico. Agganciare il tubo del filtro di sfiato al morsetto di tenuta sul CSM.

Serrare il coperchio e spostare il CSM in posizione di riempimento per posizionare il filtro dell'aria nella posizione più alta per evitare bagnature durante l'operazione di riempimento. L'angolo di 10 gradi consente inoltre l'equilibrio del liquido con gli strati durante il riempimento dell'aria chiara dalla linea di riempimento. Posizionando il sacchetto del supporto allo stesso livello del recipiente, mantenendo chiuso il morsetto del tubo di scorrimento.

Aprire il morsetto del tubo di gestione dei liquidi e il morsetto del sacchetto multimediale per consentire al fluido di entrare nel recipiente. Utilizzando il supporto per sacchetto, sollevare il sacchetto del supporto per favorire il flusso della sospensione delle celle nel recipiente. Riempire il recipiente fino a quando tutto il terreno inoculato entra nel recipiente.

La parte superiore della busta del supporto deve contenere ancora 300 millilitri di supporto. Rimuovere il morsetto dal sacchetto del supporto per continuare a riempire il recipiente mentre il liquido si avvicina al collettore dell'aria superiore. Rallentare la velocità di riempimento abbassando il sacchetto del supporto per evitare un riempimento eccessivo.

Portare lentamente il livello del liquido alla linea di riempimento e raggruppare il tubo di gestione del liquido. Portare il recipiente nel CSM in posizione di isolamento posizionando entrambe le serie di collettori nella posizione più alta. Abbassare il sacchetto del supporto al di sotto dell'altezza del recipiente.

Con il filtro di inseguimento tenuto in posizione verticale, aprire il tubo di inseguimento clamp. In questo modo il supporto verrà svuotato o inseguito nel tubo per la gestione dei liquidi nel sacchetto del supporto. Una volta che il tubo è vuoto, chiudere il morsetto sul tubo del sacchetto dei supporti.

Mantenendo il filtro del tubo di inseguimento in posizione verticale. Aprire il morsetto sul tubo di movimentazione del liquido del recipiente per consentire al liquido rimanente di entrare ed equilibrarsi nel recipiente. Attendi uno o due minuti affinché ciò accada.

Quindi, ruotare il recipiente nel CSM in modo che i collettori siano a sinistra. Abbassare il serbatoio in posizione di carico sul CSM. Chiudere i morsetti sia sul tubo di inseguimento che su quello di movimentazione dei liquidi.

Il sacchetto del terreno può ora essere rimosso dal recipiente o può rimanere attaccato per essere utilizzato in seguito nella procedura di raccolta. Per riporre la sacca per supporti collegata, arrotolarla e posizionarla sotto le fascette di fissaggio nel vassoio di stoccaggio del recipiente. Infine, spostare il recipiente nell'incubatrice Quando si trasporta il recipiente, fare attenzione a evitare che il liquido entri nel filtro di sfiato dell'aria.

Ciò si ottiene inclinando leggermente l'estremità del collettore verso l'alto. Per iniziare la provetta della procedura di raccolta, saldare le celle Soluzione di associazione e spegnere insieme i sacchi Per formare il gruppo del sacco di raccolta, assicurarsi che tutti i morsetti dei tubi siano chiusi. Rimuovere il recipiente dall'incubatrice e posizionarlo nel CSM in posizione di carico.

Sganciare la sacca per supporti da sotto le fascette di fissaggio e appenderla alla sacca. Stare in piedi, stringere il coperchio per fissare il recipiente. Agganciare il tubo di sfiato al morsetto di tenuta e spostare il CSM in posizione di riempimento.

Assicurarsi che la borsa multimediale sul supporto della borsa sia appesa più in basso del recipiente. Aprire il morsetto sul tubo del sacchetto del supporto e sul tubo di manipolazione dei liquidi del recipiente per consentire al supporto di fluire nel sacchetto collegato. Una volta che il recipiente è vuoto per circa tre quarti, modificare le impostazioni CSM sulla posizione finale di vuoto.

Quando il recipiente e il tubo per la movimentazione dei liquidi sono vuoti, sollevare il tubo per inseguire il fluido oltre il morsetto sul tubo del sacchetto del supporto esaurito. Quindi chiudere sia il morsetto sul tubo di manipolazione del liquido che il morsetto sul tubo del sacco del terreno esaurito. Sostituire il sacco del terreno esaurito con il gruppo del sacco di raccolta mediante saldatura del tubo.

Aumentare l'altezza del gruppo sacca di dissociazione della cella al di sopra dell'altezza del recipiente utilizzando il supporto della sacca. Posiziona il CSM nella posizione di riempimento. Aprire il morsetto del tubo della soluzione di dissociazione cellulare e il morsetto del gruppo del sacco di raccolta e trasferire la soluzione nel recipiente.

Al termine del trasferimento, chiudere i morsetti sul tubo di manipolazione del liquido e sul tubo della soluzione di dissociazione cellulare. Quindi, portare il CSM in posizione di carico tenendo aperta la leva di posizionamento orizzontale. Scuotere delicatamente il recipiente da un lato all'altro usando la rotella, distribuendo la soluzione sugli strati cellulari.

Il recipiente può occasionalmente essere riportato in posizione di riempimento durante l'oscillazione per mantenere un'equa distribuzione della soluzione. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuita, rilasciare la leva sul CSM per bloccarla in posizione di riempimento. Lasciare il vaso in questa posizione durante il tempo di dissociazione richiesto per le cellule.

Utilizzare la torbidità come guida per determinare il distacco delle cellule. Una volta staccato, spostare il CSM in posizione di carico. Aprire il morsetto del sacco di tempra e il morsetto del tubo per la manipolazione dei liquidi per consentire al mezzo di tempra di entrare nel recipiente.

Chiudere il morsetto sul tubo di movimentazione dei liquidi. Una volta completato il trasferimento, riportare il CSM in posizione di carico e tenere premuta la leva di posizionamento orizzontale per far oscillare il recipiente da un lato all'altro. Utilizzando il supporto del sacco, abbassare la posizione del gruppo del sacco di raccolta al di sotto del livello del recipiente.

Regolare il CSM in posizione vuota. Aprire il recipiente, il tubo per la manipolazione dei liquidi Clamp e trasferire nuovamente la soluzione cellulare nella sacca di spegnimento. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare il gruppo del sacco di raccolta dal recipiente utilizzando un sigillante per tubi.

Ora la soluzione cellulare è pronta per l'elaborazione nei sistemi di crescita cellulare tradizionali. Con Headspace, l'ossigeno nei media si esaurisce in media del 50% in tre giorni. In coltura, questa cifra mostra la diminuzione in milligrammi per litro di ossigeno a livello delle cellule nel tempo nello stesso sistema di crescita, il gradiente di ossigeno attraverso un'altezza del terreno di tre millimetri è quasi il 50% maggiore alla giunzione tra terreno e spazio di testa rispetto allo strato cellulare.

Viene mostrata la percentuale di ossigeno nello spazio tracheale dell'hyperstack durante la crescita cellulare. La figura mostra che nell'arco di 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati che alimenta ciascun fondo di film permeabile al gas rimane costante. Ciò dimostra la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita per la cofluenza.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riempire e raccogliere il recipiente impilabile Corning Hypers nel sistema chiuso.