Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Ciao, mi chiamo Greg McLeod. Il mio laboratorio studia la regolazione del calcio nelle terminazioni nervose e il suo impatto sulla trasmissione neuro.

Il moscerino della frutta rappresenta un modello attraente per i neuroscienziati grazie alla sua malleabilità genetica e al sistema nervoso semplice e accessibile. In questo sistema nervoso, sono disponibili indicatori fluorescenti geneticamente ENC covid in grado di rilevare le variazioni di calcio nelle terminazioni nervose. Tuttavia, questi indicatori hanno una sensibilità limitata al calcio e spesso mostrano una risposta non lineare.

Gli indicatori sintetici sono più adatti per misurare le rapide variazioni di calcio associate all'attività nervosa. Illustreremo una tecnica per caricare indicatori sintetici di calcio coniugati con destrina nei terminali nervosi vivi di oph lava. Il coniugato con la destrina aiuta a impedire che gli indicatori di calcio vengano sequestrati all'interno di organelli come i mitocondri.

La tecnica di caricamento può essere applicata in modo equivalente a larve, embrioni e adulti. Procederemo a dissezionare una larva in un piccolo bagno di collodio su un vetrino. La cera dentale blu sosterrà un vetrino utilizzato come piano di caricamento.

Prendere una terza larva vagante dalla parte di una provetta non affollata. Posizionare la larva in alcune gocce di soluzione di Schneider fredda e fissarla attraverso la testa e la coda con la linea mediana dorsale verso l'alto. Utilizzare un paio di forbici microchirurgiche affilate per fare un'incisione.

Un piccolo taglio tra la tra qui, sufficientemente ampio da permettere alla lama inferiore delle forbici di penetrare. Tagliare attraverso la cuticola lungo la linea mediana dorsale tra la traia fino a raggiungere la testa. Ruotare il larva di 180 gradi ed estendere il taglio fino alla coda.

È importante non permettere alla lama inferiore di penetrare troppo in profondità nelle viscere, ma nella larva, poiché ciò danneggerebbe i muscoli e i nervi che si desidera esaminare. La maggior parte delle viscere fuoriescirà attraverso l'incisione; recidere il tratto qui vicino alla coda lungo un lato, e recidere la trachea sottostante fino alla testa. Ripetere sull'altro lato.

Rimuovere la maggior parte delle viscere tagliandole e togliendole dal bagno. Prendersi un momento per posare le forbici e prendere un secondo paio di pinze. Afferrare il margine tagliato della cuticola e fissarla con un perno da una parte.

Ripetere per il lato opposto. Procedere di quattro segmenti verso la testa per ripetere la procedura. Tagliare. Qualsiasi viscera residua a questo stadio, assicurarsi che non siano stati danneggiati i muscoli 7, 6, 13 o 12 in nessuno dei segmenti.

Se alcuni sono stati danneggiati, dissezionarne un altro poiché questi danni provocano inevitabilmente contrazioni genetiche che renderebbero problematica qualsiasi successiva acquisizione di immagini. Negli step seguenti, i due emisferi cerebrali, il ganglio ventrale e i nervi segmentali risultano evidenti. Introdotto l'estremità recisa sotto pressione nel nervo segmentale, lo posizioneremo su un supporto di vetro FOP, quindi utilizzeremo un filamento di riempimento in plastica per applicare un indicatore del calcio sull'estremità esposta del nervo.

Ma prima, illustreremo come realizzare il filamento di riempimento e l'effetto di riempimento per produrre il filamento stesso. Si applicherà una tecnica di trazione in due stadi a un capillare giallo difettoso, riscaldandolo lentamente a metà della sua lunghezza finché la plastica non diventa morbida e trasparente. A questo punto interrompere il riscaldamento e immediatamente tirare verso l'alto la punta per allungarla in un sottile filamento.

Questo ha un diametro di circa mezzo millimetro. Tagliare il filamento a una lunghezza di 50 millimetri. Posizionare ora il filamento sotto un microscopio stereoscopico e fissare il taglio.

Termina con una piccola estremità e tira l'altra estremità per estrarre un sottile filamento lungo un centimetro. Questo deve essere tagliato con una nuova lametta da barba su carta da filtro, per evitare di arrotondare il bordo affilato, al fine di preparare correttamente il riempimento. Inizia con un capillare a pareti sottili senza alcun filamento.

Portatelo a un punto fine e affusolato su un estrattore per pipette. Portate questa preparazione sotto una lente stereoscopica e inciderne la parte affusolata con un pezzo di carta vetrata. Spingere l'estremità distale rispetto all'incisione lontano dal lato inciso in modo che l'estremità si spezzi nettamente.

Il diametro interno della rottura deve essere maggiore del diametro esterno. All'estremità del filamento di riempimento, utilizzare un micro forgiato per restringere termicamente la rottura nel vetro fino all'effetto, finché non raggiunge un diametro interno di circa 12 micrometri. Utilizzare un becco Bunsen per lucidare l'estremità smussata dell'effetto.

Una pressione negativa può essere applicata all'estremità smussata dell'effetto utilizzando un tubo Celtic adattato perfettamente, collegato a un tubo polilineare rigido e a una siringa. Lo stesso tubo e la stessa siringa verranno utilizzati per aspirare ed espellere l'indicatore del calcio dal filamento. L'indicatore del calcio deve essere sciolto in acqua distillata fino a una concentrazione di cinque milli.

Dividere questa soluzione in aliquote da cinque microlitri. Riscaldare questi a 4 gradi di pesce. Non congelare questi quats per mantenerli non congelati fino al momento dell'uso.

Ora, aspirare uno o due centimetri dell'indicatore di calcio nel filamento ed essere pronti per procedere al passaggio più critico di questa tecnica di carico. Prendere le forbici e la pinzetta e tagliare individualmente i nervi del segmento più anteriore, il più vicino possibile ai gangli ventrali. La massa nervosa del segmento più anteriore dal ventrale vent.

Tagliare via eventuali detriti. Posizionare il filamento di riempimento sulla rampa di cera dentale con la punta al centro della larva. Fissare il tubo scolastico e la siringa.

Aspirare una certa quantità di soluzione di Schneider in una punta perfetta. Ora aspirare l'estremità del nervo nella punta. L'accoppiamento deve essere stretto ma non troppo.

Deve bloccare ulteriori ingressi degli Schneiders per proteggere. Rimuovere generalmente il tubo scolastico e la siringa e collegarli al filamento F. Toccare il lato del filamento agli Schneiders nel bagno per scaricare qualsiasi elettricità statica e inserire immediatamente l'effetto colla del filamento entro 50 micron al taglio del nervo senza toccare effettivamente.

Espellere lentamente l'indicatore del calcio per aumentare il volume del mezzo Schneider di circa un terzo. La concentrazione finale dell'indicatore del calcio sarà di poco inferiore a due milli; lasciare la preparazione in un luogo buio e umido a temperatura ambiente per circa 40 minuti. Vorrei sottolineare due punti importanti qui.

Prima di tutto, una soluzione fisiologica deve essere presente alla punta per diluire l'indicatore del calcio, poiché l'indicatore del calcio è stato solubilizzato soltanto in acqua. La soluzione fisiologica deve contenere calcio a una concentrazione di alcuni millimolari, in quanto il rigonfiamento dell'assone dipende dal calcio ed è essenziale per preservare la salute delle terminazioni nervose.

Il secondo punto è che non dovrebbero trascorrere più di cinque minuti tra il taglio dei nervi e l'applicazione del colorante sull'estremità recisa del nervo. Dopo cinque minuti, le terminazioni assonali prossimali escluderanno gli indicatori calcioconiugati al destran con pesi molecolari di 10.000. Rispettare questo limite di tempo richiederà un po' di pratica.

Non tentare di rallentare il soffitto dell'assone riducendo i livelli di calcio, poiché ciò comprometterebbe solo la futura funzione fisiologica del danno nervoso. Dopo l'incubazione di 40 minuti, posizionare la preparazione in Schneiders a contatto con il lato del filamento di riempimento e reinserirlo per rimuovere la maggior parte della soluzione indicatrice di calcio dalla punta e dall'avviatore. Nuovamente, utilizzando il filamento, aspirare Schneiders fresco dal bagno e riempire completamente il letto con Schneiders.

Non devono essere presenti bolle nel letto poiché la soluzione di Schneider fungerà da uno dei conduttori isolando dal bagno mentre il nervo del vetro pettorale viene stimolato; posizionare nuovamente il preparato in un ambiente buio per almeno 60 minuti, ma non più di quattro ore, e rinnovare i RINs in Schneider fresca ogni 30 minuti durante l'incubazione. L'indicatore del calcio viene trasportato lungo l'assone e si concentra nel terminale nervoso 20 minuti prima di esaminare il preparato. Risciacquarlo con soluzione HL6.

Contenere il livello desiderato di calcio quando il livello di calcio è superiore a circa 0,4 millimolare di glutammato o acido L-glutammico fino a 6-7 millimolari per arrestare la contrazione muscolare indotta dal nervo. La soluzione di Schneider non è adatta per l'imaging del calcio poiché contiene già livelli elevati sia di glutammato che di calcio. Questi livelli dovranno essere regolati.

Tate è inoltre presente, consentendo che il caricamento autofluorescente di Schneider e l'acquisizione di immagini possano essere eseguiti in HL6, purché il calcio sia presente ad almeno 2 milioni durante il caricamento. Quando si prepara il campione su un microscopio composto per l'acquisizione di immagini, assicurarsi nuovamente di scaricare tutta l'elettricità statica. Successivamente, toccare sia la soluzione nel bagno che l'obiettivo con una coppia di pinzette.

Se l'obiettivo è un obiettivo ad immersione, abbassarlo nel bagno, quindi collegare momentaneamente la base a massa stimolando in modo opportuno, oppure inserendone uno nel bagno e l'altro nella cavità, applicando impulsi DC quadrati di durata inferiore a tre volt e 300 microsecondi che evocano in modo affidabile un potenziale d'azione nel nervo. Qui osserviamo due gruppi di terminali nervosi nella fessura tra il muscolo sei e sette resi visibili attraverso l'espressione citosolica di GFP. Sono stati inoltre riempiti in senso anterogrado con l'indicatore del calcio Rod Dextran, che presenta spettri di eccitazione ed emissione diversi rispetto a GFP.

Questo campo visivo contiene ancora i terminali nervosi, ma la Rodamina Rin ha una bassa affinità per il calcio ed è quasi invisibile quando il nervo è inattivo. Tuttavia, è altamente sensibile al calcio che entra nei terminali durante singoli potenziali d'azione o brevi stimolazioni ripetute per due secondi. Come mostrato qui nell'analisi della fluorescenza delle stimolazioni ravvicinate a 80 hertz, le risposte nei terminali di tipo uno S sono solitamente maggiori rispetto a quelle nei terminali di tipo uno B.

Indicatori del calcio a bassa affinità come rod dextrin e flu. Un quattro dextrin ha mostrato una risposta quasi lineare alle frequenze di stimolazione nervosa in questi terminali in un intervallo compreso tra 10 e 80 hertz. L'esempio mostrato qui proviene da un terminale nervoso sul muscolo numero quattro, carico con Rod Dextrin.