Name: Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Scopri come caricare indicatori di calcio nelle terminazioni nervose di Drosophila per studiare la neurotrasmissione. Questa tecnica consente di analizzare la dinamica del calcio in vivo con alta sensibilità.

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<ol><li> Seleziona un piatto pulito dissezione che non è stato esposto a qualsiasi fissativi. </li><li> Sezionare un errante 3 ° instar larva di Drosophila in Medio Drosophila Schneider contenente Ca 2 + e L-glutamina, (non tagliare qualsiasi nervi o fibre muscolari danno numeri 7, 6, 13 o 12). </li><li> Selezionare una pipetta di vetro riempimento con una punta di 12 micron (diametro interno). </li><li> Utilizzando una siringa e tubo (per applicare una pressione negativa alla pipetta) garantire che la punta della pipetta non sia ostruito. </li><li> Selezionare un riempimento di plastica sottile filamento che possono essere inseriti per tutta la lunghezza della pipetta di vetro. </li><li> Disegnare ~ 1 cm di 5 mM destrano coniugato Ca 2 +-indicatore nel filamento di plastica. </li><li> Tagliare tutti i nervi segmento. </li><li> Sostenere la pipetta su una rampa che consentirà la punta della pipetta di avvicinarsi alla linea mediana ventrale della larva sezionato. </li><li> Disegna la fine di un nervo tagliato a segmento n.4, senza pizzicare il nervo, nella parte finale della pipetta (includere una piccola quantità di mezzo di Schneider). </li><li> Rimuovere il tubo e inserire il filamento di plastica nella pipetta fino alla fine del filamento è all&#39;interno di 50 micron del taglio del nervo (evitare di toccare il nervo). </li><li> Espellere sufficiente Ca 2 +-indicatore sul nervo fine di aumentare il volume del mezzo di Schneider di circa il 33% (concentrazione finale deve essere &lt;2 mm). Importante - Questo deve essere completato entro 5 minuti di tagliare il nervo. </li><li> Mettere la preparazione al buio a temperatura ambiente, mentre i carichi dei nervi. </li><li> Dopo 40 minuti togliere il Ca 2 +-spia con il filamento. </li><li> Lascia la pipetta in posizione e riempirlo completamente con mezzo fresco di Schneider, in quanto questo sarà utilizzato per applicare gli impulsi stimolando il nervo. </li><li> Lasciare che il Ca 2 +-indicatore per equilibrare nel nervo per almeno 60 minuti, ma non più di 4 ore, prima di iniziare Ca 2 +-imaging. </li><li> Sciacquare la preparazione con mezzo fresco di Schneider ogni 30 minuti mentre è equilibrante. </li><li> 20 minuti prima di imaging sostituire medio Schneider con emolinfa-Like No.6 soluzione (HL6; Macleod et al 2002;. 2003). </li><li> Acido L-glutammico o glutammato può essere aggiunto HL6 soluzione a 7 mm per desensibilizzare i recettori del glutammato postsinaptici per evitare nervo-evocato contrazione muscolare (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>deve contenere L-glutammina e calcio</td></tr><tr><td>sale monosodico dell'acido L-glutammico, idrato</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

caricamento terminazioni nervose drosophila con gli indicatori di calcio

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Il calcio gioca molti ruoli nel sistema nervoso, ma nessuno più impressionante come trigger per il rilascio dei neurotrasmettitori, e nessuno più profonda di come il messaggero essenziali per la plasticità sinaptica, che supporta l&#39;apprendimento e la memoria. Per ulteriormente chiarire le basi molecolari di Ca 2 +-dipendente meccanismi sinaptici, un sistema modello è necessario che sia geneticamente malleabile e fisiologicamente accessibile. Drosophila melanogaster fornisce un tale modello. In questo sistema, gli indicatori fluorescenti geneticamente codificate sono a disposizione per rilevare Ca 2 + variazioni di terminazioni nervose. Tuttavia, questi indicatori hanno limitato la sensibilità al Ca 2 + e mostrano spesso una risposta non lineare. Sintetici indicatori fluorescenti sono più adatti per misurare la rapida Ca 2 + cambiamenti associati con l&#39;attività del nervo. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento destrano coniugato sintetico Ca 2 + indicatori in terminali nervosi larve vivono in Drosophila. Particolare enfasi è posta sugli aspetti del protocollo più critico per il successo della tecnica, come il modo di evitare scariche di elettricità statica lungo i nervi isolato, il mantenimento della salute della preparazione durante i periodi di carico prolungato, e di garantire la sopravvivenza degli assoni, fornendo Ca 2 + per la promozione di tenuta delle terminazioni degli assoni reciso. Bassa affinità destrano coniugato Ca 2 +-indicatori, come fluo-4 e Rhod, sono disponibili che mostrano un elevato rapporto segnale-rumore mentre minimamente disturbare presinaptico Ca 2 + dinamica. Destrano-coniugazione aiuta a prevenire Ca 2 + indicatori essere sequestrato in organuli come i mitocondri. La tecnica di carico può essere applicato anche per le larve, gli embrioni e adulti.

Il calcio è un messaggero onnipresente nel sistema nervoso, essenziale per innescare il rilascio dei neurotrasmettitori e dei cambiamenti nella forza sinaptica. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento di Ca 2 +-indicatori in terminazioni nervose Drosophila. Abbiamo anche dimostrare fabbricazione degli apparati necessari e sottolineare i punti critici per il successo della tecnica.

Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Il calcio svolge numerosi ruoli nel sistema nervoso, ma nessuno è più impressionante di quello di innesco per il rilascio di neurotrasmettitori, e nessuno più profondo di quello di...

Ciao, mi chiamo Greg McLeod. Il mio laboratorio studia la regolazione del calcio nelle terminazioni nervose e il suo impatto sulla trasmissione neuro.Il moscerino della frutta rappresenta un modello attraente per i neuroscienziati grazie alla sua malleabilità genetica e al sistema nervoso semplice e accessibile. In questo sistema nervoso, sono disponibili indicatori fluorescenti geneticamente ENC covid in grado di rilevare le variazioni di calcio nelle terminazioni nervose. Tuttavia, questi indicatori hanno una sensibilità limitata al calcio e spesso mostrano una risposta non lineare.Gli indicatori sintetici sono più adatti per misurare le rapide variazioni di calcio associate all'attività nervosa. Illustreremo una tecnica per caricare indicatori sintetici di calcio coniugati con destrina nei terminali nervosi vivi di oph lava. Il coniugato con la destrina aiuta a impedire che gli indicatori di calcio vengano sequestrati all'interno di organelli come i mitocondri.La tecnica di caricamento può essere applicata in modo equivalente a larve, embrioni e adulti. Procederemo a dissezionare una larva in un piccolo bagno di collodio su un vetrino. La cera dentale blu sosterrà un vetrino uti

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Biologia

Abbiamo descritto le caratteristiche strutturali del Glia-sinapsi neuromuscolare in un preparato romanzo Inside-out tessuto di larve di mosca dal vivo con coloranti fluorescenti con microscopia confocale. Siamo etichettati terminazioni neuronali vivere con anticorpi fluorescenti primario di HRP, e anche visualizzare lo spazio perisynaptic con destrani fluorescenti.

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di...

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Questo video descrive l'imaging del calcio in vivo nei neuroni di Drosophila utilizzando GCaMP. La clip del protocollo in primo piano mostra come registrare i cambiamenti nella fluorescenza GCaMP dai neuroni del corpo a fungo durante un esperimento di condizionamento olfattivo.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione...

Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Le zampe anteriori e la proboscide di Drosophila contengono un ricco repertorio di neuroni sensoriali gustativi. Qui, presentiamo un metodo che utilizza l'imaging del calcio per misurare le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali nella zampa anteriore e nella proboscide di moscerini vivi dopo l'applicazione esogena di un feromone gustativo.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Qui descriviamo un metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il ceppo nervoso della rana nelle estremità nervose. Presentiamo inoltre un protocollo per la registrazione e l'analisi dei rapidi transitori di calcio nei terminali nervosi periferici.

Caricamento di un colorante di calcio in terminazioni di nervi della rana attraverso il ceppo del nervo: registrazione transitoria del calcio nella giunzione neuromuscolare della rana

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Questo protocollo valuta l'attività sinaptica funzionale tra partner neuronali definiti in vivo nel sistema nervoso centrale delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando strumenti codificati geneticamente. CsLa stimolazione optogenetica mediata da Chrimson dei neuroni sensoriali presinaptici cIVda induce la fotoconversione dipendente dal calcio di CaMPARI negli interneuroni postsinaptici del Bacino-4.

Caratterizzazione funzionale dei partner individuali pre- e postsinaptici nel sistema nervoso centrale larvale di Drosophila utilizzando CaMPARI

Scopri come caricare indicatori di calcio nelle terminazioni nervose di Drosophila per studiare la neurotrasmissione. Questa tecnica consente di analizzare la dinamica del calcio in vivo con alta sensibilità.

Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

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