Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

L'obiettivo generale della procedura è studiare l'apprendimento e la memoria negli adulti di Esso Melan Gaster, innanzitutto per determinare se le mosche presentano deficit locomotori. Vengono sottoposte al test di geotassi negativa. Successivamente, il comportamento fototattico positivo viene verificato posizionando le mosche in un labirinto a T e registrando la latenza nel muoversi verso la camera illuminata preferita.

Le mosche con fototassi positiva vengono quindi condizionate ad associare la camera illuminata al sapore amaro della chinina. Infine, si verifica quanto bene le mosche associano lo stimolo avversivo alla camera illuminata, fornendo una misura dell'apprendimento e della memoria. Ola, benvenuto nel laboratorio X.

Oggi vi illustreremo due saggi comportamentali comunemente utilizzati per studiare la neurodegenerazione in drosophila. Per prima cosa, vi mostreremo il saggio di soppressione della fototassi avversiva, dimostrato da Wil Fredo Sala, uno studente universitario del nostro laboratorio, e da me stesso, seguito dal saggio della geotassi negativa, dimostrato da Kaiwan, uno studente laureato del nostro laboratorio. Mantenere le mosche su un mezzo standard a base di agar, melassa, mais e lievito, a 25 gradi Celsius, in un ciclo luce/buio di 12 ore.

Nel giorno dell'occlusione, suddividere le mosche vergini in gruppi di 20. Le mosche vergini si riconoscono dal colore chiaro e da una macchia verde scuro situata sulla parte inferiore dell'addome. Le mosche devono essere trasferite in un nuovo flacone ogni tre giorni, e si devono utilizzare mosche sorelle per minimizzare le differenze derivanti dagli sfondi genetici.

Per un esperimento di geotassi, devono essere testati da 10 a 20 gruppi per genotipo o trattamento. Per iniziare, suddividere le mosche femmine e maschi in gruppi di 10. Queste mosche devono essere testate separatamente.

Poiché il comportamento è significativamente influenzato dal sesso, attendere almeno un'ora dopo l'anestesia prima di procedere, per garantire che l'attività locomotoria non sia compromessa. Una volta che i moscerini sono stati preparati correttamente, allineare le aperture di due provette vuote in polistirene unendole verticalmente sulla provetta inferiore.

Misurare otto centimetri a partire dal fondo e tracciare un cerchio lungo la circonferenza. Ora che l'apparato è stato assemblato, trasferire un gruppo di 10 moscerini nel vial inferiore. Unire immediatamente i vial e lasciare ambientare i moscerini per un minuto prima del test.

Dopo che i moscerini si sono calmati, battere delicatamente sul fondo della provetta per farli scendere e misurare il numero di moscerini che superano il segno degli otto centimetri entro 10 secondi. Il numero di moscerini per gruppo che superano questo segno viene registrato come percentuale del totale dei moscerini. Ripetere questa procedura 10 volte per ogni gruppo, permettendo ai moscerini di riposare per un minuto tra una prova e l'altra.

Sei ore prima di un saggio PS, selezionare moscerini femmine e trasferirli in provette di polistirene contenenti carta da filtro inumidita con acqua. Questo passaggio garantisce che i moscerini siano a digiuno e più sensibili al sapore sgradevole. In questo saggio, una soluzione di chinino funge da stimolo avversivo.

Preparare una soluzione lavorativa di un micromolare a partire da una soluzione madre di 0,1 molare. Il labirinto a T è composto da una colonna centrale con una botola e due camere laterali, una camera scura e una camera illuminata. All’altezza del segno di due millimetri, utilizzare una sega manuale per tagliare l’estremità chiusa di due provette plastiche da 15 millilitri, applicare adattatori di connessione a ciascuna estremità e sigillare il collegamento con paraform.

Avvolgere un tubo con della carta d'alluminio per realizzare la camera oscura. Assemblare le TMA avvitando la camera illuminata e quella oscura su ciascun lato della colonna centrale. Con la porta di chiusura centrale chiusa, completare l'allestimento collegando una sorgente luminosa all'adattatore della camera illuminata. Prima di eseguire il saggio, trasferire ogni moscerino da un gruppo di 10 in un tubo da centrifuga vuoto da 15 millilitri e chiuderlo leggermente per evitare fughe.

Successivamente, svitare la camera oscura dalle TMA. Trasferire una singola mosca nel tubo e reinserirlo immediatamente nel labirinto. Spegnere le luci della stanza e accendere una lampada rossa.

Lasciare che il moscerino si ambienti nella camera oscura per 30 secondi, quindi accendere lentamente la sorgente luminosa che illumina la camera illuminata. Una volta illuminata, aprire la botola che separa le due camere. Se il moscerino raggiunge la camera illuminata entro 10 secondi, viene considerato positivamente fototattico ed è pronto per essere addestrato.

Il mancato riscontro di questa risposta indica un problema nel sistema visivo e richiede l'esclusione dal saggio. Una volta confermata la fototassi positiva, battere leggermente sul moscerino per farlo tornare nella camera oscura, chiudere la porta a trappola e spegnere la luce durante un periodo di riposo di 32°. Preparare lo stimolo avversivo posizionando la carta da filtro nella camera illuminata e aggiungendo con una pipetta un millilitro di soluzione di chinino sulla carta da filtro.

Assicurarsi che tutta la carta da filtro sia completamente inumidita con stimoli avversivi. Per iniziare il condizionamento, aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che la mosca entri camminando nella camera illuminata con odore di chinino.

Dopo un minuto, fate tornare la mosca nella camera scura. Ripetete questa procedura nove volte per un totale di 10 prove di condizionamento. Di solito, dopo tre o cinque prove di addestramento, le mosche di tipo selvatico evitano immediatamente dopo l'addestramento la camera illuminata.

Eseguire cinque prove di test. Se la mosca addestrata non entra nella luce della camera entro 10 secondi, viene registrata come superata. Viene registrata e indicata la percentuale di prove superate su cinque prove consecutive.

PC zero. Dopo l'addestramento e le registrazioni iniziali di PC zero, ogni mosca viene riposizionata nel suo contenitore numerato originale con cibo e conservata per sei ore. Sei ore dopo l'addestramento, effettuare cinque ulteriori prove di test come mostrato in precedenza; questa percentuale di superamento rappresenta il PC sei ed è una misura della memoria a breve termine.

Nel saggio di geotassi negativa, il numero di moscerini che superano il segno degli otto centimetri viene convertito in una percentuale e presentato come tasso di superamento del test di arrampicata. In 10 prove, come mostrato qui a destra, moscerini maschi o femmine di 10 giorni che sovraesprimono la proteina tau umana presentano deficit locomotori significativi rispetto ai moscerini controllo di pari età che sovraesprimono GFP, mostrati a sinistra.

La prestazione nel test di soppressione della fototassi avversiva è rappresentata dalla frequenza media di superamento o dalla percentuale di prove di evitamento riuscite. Nel complesso, le mosche che sovraesprimono tau, mostrate qui a destra, sono meno capaci di associare la luce a un sapore amaro rispetto al gruppo di controllo a sinistra, sia immediatamente dopo l'addestramento che quando testate sei ore più tardi. Al termine di questa procedura, è possibile prelevare campioni per analisi immunocitochimiche al fine di rispondere ad ulteriori domande riguardo le differenze morfologiche. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come studiare l'apprendimento e la memoria nelle mosche amiche.

E ricorda, si tratta sempre di te.