Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

L'obiettivo generale della procedura è quello di studiare l'apprendimento e la memoria nell'adulto Esso Melan Gaster per determinare se i moscerini soffrono di deficit locomotori. Sono testati nelle tasse geografiche negative. Il comportamento positivo della tattica fotografica viene quindi verificato posizionando le mosche in un labirinto a T e registrando la latenza per muoversi verso la camera illuminata preferita.

I moscerini con fototassi positiva sono quindi condizionati ad associare la camera illuminata al sapore amaro del chinino. In definitiva, i moscerini vengono testati su quanto bene associano lo stimolo avversivo con la camera illuminata che fornisce una misura dell'apprendimento e della memoria. Ola, benvenuta nel laboratorio X.

Oggi vi mostreremo due saggi comportamentali comunemente usati per studiare la neurodegenerazione e la drosofila. Per prima cosa, vi mostreremo il saggio di soppressione della fototassi avversiva dimostrato da Wil Fredo Sala, uno studente universitario nel nostro laboratorio e da me, che sarà seguito dal saggio delle geotasse negative dimostrato da kaiwan, uno studente laureato nel nostro laboratorio. Mantenere le mosche sul terreno standard di melassa di farina di mais agar a 25 gradi Celsius con un ciclo di buio leggero di 12 ore.

Il giorno dell'occlusione, smistare le mosche vergini in gruppi di 20. Le mosche vergini sono identificate dal loro colore chiaro e da una macchia verdastra scura situata sul lato inferiore dell'addome. Le mosche dovrebbero essere trasferite in una fiala fresca ogni tre giorni e le mosche sorelle dovrebbero essere utilizzate per ridurre al minimo le differenze derivanti dal background genetico.

Da 10 a 20 gruppi per genotipo o trattamento dovrebbero essere testati in uno studio sulle tasse geografiche. Per iniziare, ordina le mosche femmine e maschi in gruppi di 10. Queste mosche dovrebbero essere testate separatamente.

Poiché il comportamento è significativamente influenzato dal genere. Attendere almeno un'ora dopo l'anestesia prima di procedere per assicurarsi che l'attività locomotoria non sia compromessa. Una volta preparate perfettamente le mosche, allineare le aperture di due fiale di polistirolo vuote unendole verticalmente sulla fiala inferiore.

Misura a otto centimetri dal fondo e disegna un cerchio attorno alla circonferenza. Ora che l'apparecchio è stato assemblato, trasferire un gruppo di 10 mosche nella fiala inferiore. Ricongiungersi immediatamente alle fiale e acclimatare le mosche per un minuto prima del test.

Dopo che le mosche si sono posate, picchiettarle delicatamente sul fondo della fiala e misurare il numero di mosche che superano gli otto centimetri di 10 secondi. Il numero di mosche per gruppo che ha superato questo segno è registrato come percentuale delle mosche totali. Ripeti questa procedura 10 volte per gruppo, lasciando riposare le mosche per un minuto tra le prove.

Sei ore prima del test PS, smistamento, mosche femmina in fiale di polistirene contenenti carta da filtro inumidita con acqua. Questo passaggio assicura che le mosche siano affamate e più percettive al gusto avverso. In questo saggio, una soluzione di chinino funge da stimolo avversivo.

Preparare una soluzione di lavoro di un micromolare da un ceppo di 0,1 molari. Il labirinto a T è costituito da una colonna centrale con una botola e due camere laterali, una camera oscura e una camera illuminata. Al segno di due millimetri, utilizzare una sega manuale per tagliare l'estremità chiusa di due provette da centrifuga in plastica da 15 millilitri, inserire adattatori per connettori a ciascuna estremità e sigillare la connessione con paraforma.

Avvolgere un tubo con un foglio di alluminio per riparare la camera oscura. Assemblare i TMA avvitando le camere illuminate e scure su ciascun lato della colonna centrale. Con la botola al centro chiusa, completare la configurazione collegando direttamente una sorgente luminosa all'adattatore della camera luminosa Prima di eseguire il test, trasferire ogni mosca da un gruppo di 10 in una provetta da centrifuga vuota da 15 millilitri e tappare leggermente per evitare la fuoriuscita.

Quindi, svitare la camera oscura dai TMA. Trasferisci una singola mosca nel tubo e reinseriscila immediatamente nel labirinto. Spegni le luci nella stanza e accendi una lampada rossa.

Lasciare che la mosca si acclimati nella camera buia per 30 secondi e poi accendere lentamente la fonte di luce che illumina la camera illuminata. Una volta accesa, aprite la botola che separa le due camere. Se la mosca cammina verso la camera illuminata entro 10 secondi, è considerata una tattica fotografica positiva ed è pronta per essere addestrata.

La mancata risposta in questo modo indica un problema nel sistema visivo e richiede l'esclusione dal test. Una volta confermata la fototassi positiva, tocca la mosca per tornare alla camera buia, chiudi la botola e spegni la luce durante un 32° periodo di riposo. Preparare lo stimolo avversivo inserendo la carta da filtro nella camera illuminata e pipettando un millilitro di soluzione di chinino sulla carta da filtro.

Assicurarsi che tutta la carta da filtro sia completamente umida con stimoli avversivi. Per iniziare il condizionamento, aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lascia che la mosca entri nella camera illuminata profumata al chinino.

Dopo un minuto, tocca la mosca per tornare alla camera buia. Ripetere questa procedura nove volte per un totale di 10 prove di condizionamento. In genere, mentre il tipo vola, evita la camera illuminata dopo tre o cinque prove di allenamento subito dopo l'allenamento.

Condurre cinque prove di prova. Se la mosca addestrata non entra nella luce della camera entro 10 secondi, viene registrata come un passaggio. Viene registrato e designato il tasso di superamento di cinque prove consecutive.

PC zero. Dopo l'addestramento e le registrazioni iniziali del PC, ogni mosca viene rimessa nel suo file di cibo originale numerato e tenuta da parte per sei ore. Sei ore dopo l'allenamento, condurre cinque prove di test aggiuntive come dimostrato in precedenza, questo tasso di superamento rappresenta il PC sei ed è una misura della memoria a breve termine.

Nel test delle geotasse negative, il numero di mosche che superano gli otto centimetri viene convertito in percentuale e presentato come tasso di passaggio dell'arrampicata. Oltre 10 prove come si vede qui a destra, maschio o femmina di 10 giorni vola sopra l'espressione. La tau umana ha deficit locomotori significativi rispetto alla GFP di età rispetto all'espressione delle mosche a sinistra.

Le prestazioni nel saggio di soppressione della fototassi avversiva sono rappresentate dal tasso medio di superamento o dalla percentuale di prove di evitamento riuscite. Nel complesso delle prove vola sopra l'espressione della tau mostrata qui a destra per associare la luce con un sapore amaro rispetto al gruppo di controllo a sinistra, sia immediatamente dopo l'allenamento che quando viene testato, sei ore dopo Dopo questa procedura, è possibile prelevare campioni per l'analisi immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande sulle differenze morfologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare l'apprendimento e la memoria e vola amigos.

E ricorda, è tutta una questione di te.