Name: Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri la visualizzazione in tempo reale della traslocazione della PKC nelle cellule SF9 e nei neuroni sensoriali di Aplysia utilizzando microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo consente di studiare la regolazione differenziale degli isoformi PKC.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Concessione di S. Wayne Sossin. Carole A. Farah è il destinatario di una borsa di studio post-dottorato dal Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e una borsa di studio Conrad Harrington. Gli autori desiderano ringraziare Joanna Bougie, Margaret Hastings e Margaret Labban aiuto per le riprese video e Madeline piscina Richmond per aiutare con la panoramica grafica.

1. Preparazione e manutenzione di colture cellulari monostrato SF9 <ol><li> SF9 coltura cellulare e la manutenzione viene eseguita in una cappa di coltura di tessuti. </li><li> SF9 cellule derivano da cellule ovariche di Spodoptera frugiperda (Sf21 cellule) e può essere acquistato come cellule congelate nei mezzi di comunicazione di Grace da Invitrogen. </li><li> Luogo 8 mL di medium insetti Grace, integrati (1X), per cui il 30% di siero fetale bovino (FBS) è stato aggiunto in un centimetro 75 2 fiasco coltura cellulare con un collo inclinato. </li><li> Scongelare il tubo ghiacciato di SF9 cellule rapidamente in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C il tubo muovendo avanti e indietro (circa 1-2 minuti). </li><li> Trasferimento SF9 celle a centimetri 75 2 fiasco di coltura cellulare e placca rocciosa delicatamente a mano per distribuire le cellule in modo uniforme. </li><li> Incubare per 1-2 ore a 27 ° C fino a quando le cellule sono collegati. </li><li> Rimuovere media vecchi e sostituirli con 10 ml di medium insetti freshGrace con 30% FBS. </li><li> Incubare a 27 ° C fino a quando le cellule sono confluenti. </li><li> Per mantenere colture monostrato, rimuovere medio vecchio pallone di confluenza di SF9 cellule e aggiungere 5 ml di medium insetti di Grace con il 10% FBS. </li><li> Toccare leggermente sul lato del pallone più volte a staccare SF9 cellule. </li><li> Usando una pipetta 10 ml e una pipetta, pipetta i media una volta su e giù dolcemente, spruzzando muro fiasco durante il pipettaggio in giù. Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo polistirolo. </li><li> Aggiungere 2 ml di sospensione cellulare SF9 a 8 ml di terreno insetti di Grace con il 10% FBS (diluizione 1:5 per mantenere la fase di crescita log) nel nuovo 75 cm 2 fiasco di coltura cellulare e placca rocciosa delicatamente a mano. </li><li> Incubare a 27 ° C fino a quando le cellule sono confluenti. </li></ol> 2. Espressione di PKCS fluorescente Tagged in SF9 cellule <ol><li> Per le immagini live-esperimento, della cultura SF9 celle da 35 mm cultura MatTek disheswith fondo di vetro una superficie di vetro di 14 mm e uno spessore di 0,16 coprioggetto a 0.19 mm. </li><li> PKCS taggati con proteine ​​fluorescenti sono espressi in SF9 cellule utilizzando Cellfectin raccomandazione transfezione II reagente a seguito del costruttore con le modifiche riportate di seguito. </li><li> 1 ° giorno: Prima di placcatura le cellule, il trattamento di ogni piatto MatTek con il mezzo di insetti di Grace con il 10% FBS per almeno 30 minuti. </li><li> Conte SF9 cellule dal punto 11 (sopra) utilizzando un emocitometro. </li><li> Piastra 0,05 x 10 6 cellule per ogni vetrino di vetro MatTek in un volume totale di 150 microlitri. Permettono alle cellule di attaccare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di Grazia è integrato con il 10% FBS per ogni ml piatto 1 alla volta lentamente per evitare di staccare le cellule. </li><li> Incubare a 27 ° C durante la notte. </li><li> Da questo punto in poi, l&#39;uso raccomandazione del produttore per la transfezione di SF9 cellule con DNA plasmidico. </li><li> 2 ° giorno: SF9 trasfezione delle cellule con PKCS fluorescente marcato mediante Cellfectin reagenti di trasfezione II. Abbiamo spesso co-espressi in questo sistema PKCS taggati con maggiore proteina verde fluorescente (eGFP) e monomerico proteina fluorescente rossa (MRFP) (dettagli per la costruzione plasmide sono state precedentemente descritte 2,5). Espressione di una proteina fluorescente in un momento produce circa il 70-80% che esprimono celle 72 ore dopo la trasfezione. Co-espressione di due proteine ​​fluorescenti diminuisce l&#39;efficienza di trasfezione a circa il 30% di co-cellule che esprimono. Quando co-esprimono eGFP-tagged PKC e MRFP-tagged PKC, utilizzare 2x DNA più plasmide per la MRFP-tag proteine ​​per espressione di proteine ​​ottimale. </li><li> Esibirsi dal vivo-imaging 48-72 ore post-trasfezione (per l&#39;espressione delle proteine ​​ottimali, attendere 72 ore). </li></ol> 3. Espressione di PKCS fluorescente Tagged nei neuroni sensoriali Aplysia <ol><li> Preparazione di colture cellulari neuronali Aplysia è stato descritto in un articolo video di Zhao e 4 colleghi. </li><li> PKCS taggati con proteine ​​fluorescenti sono espressi nei neuroni sensoriali Aplysia tramite microiniezione procedura dettagliata di seguito. </li><li> Preparare una soluzione madre di 1% Verde fast (FCF) in acqua distillata, filtrare utilizzando una siringa e una siringa da 28 mm filtro (0,20 micron). Aliquota e conservare a -20 ° C. </li><li> Microiniezione dei neuroni sensoriali può essere eseguita il giorno 1 o giorno 2 dopo aver isolato i neuroni, ma troviamo che aspettare 2 giorni permette una migliore aderenza delle cellule del coprioggetto. </li><li> Il giorno 2 dopo l&#39;isolamento dei neuroni sensoriali, disgelo un&#39;aliquota di Green veloce e filtrare di nuovo con una siringa e una siringa da 28 mm filtro (0,20 micron). </li><li> Preparare una soluzione di DNA plasmidico in acqua distillata contenente 0,5% Verde veloce. Le concentrazioni di DNA plasmidico più in alto di 0,4 mg / mL può essere usato ma non è consigliabile andare di sopra di questi valori. </li><li> Filtrare il DNA plasmidico / Fast soluzione verde con una siringa da 1 ml e una siringa da 4 mm filtro (0,20 micron). </li><li> Centrifugare il DNA plasmidico / Fast soluzione verde a 16110 xg per 15 minuti utilizzando un microfonorocentrifuge. </li><li> Preparare elettrodi forte per microiniezione di neuroni con un estrattore microelettrodo (Sutter Flaming / Brown Micropipetta Puller, modello P-97). Utilizzando un filamento scatola, tirare microelettrodi di vetro con 1 mm di diametro esterno, 0,75 mm di diametro interno e 100 mm di lunghezza con sottile parete di vetro capillari con un filamento interno (World Strumenti di precisione TW100F-4). Per ulteriori informazioni sulla tirando elettrodi microiniezione fare riferimento al libro di cucina Sutter elettrodo. </li><li> Riempire ogni elettrodo con 2 ml di DNA plasmidico / Fast soluzione verde utilizzando microloader puntale (eppendorf CA32950-050). </li><li> Trasferire il piatto di vetro MatTek fondo di coltura contenente culture Aplysia neuronali alla stazione di microiniezione. </li><li> La stazione di microiniezione è costituito dai seguenti: una fatta in casa grande palcoscenico di vetro per contenere i piatti della cultura su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni (Kinetic workstation vibrazioni Sistemi di isolamento), un impianto stereo-scope alogeni con illuminazione esterna, un micromanipolatore (Sutter Huxley Micromanipolatore Tipo di parete che consente il posizionamento sia grossolana e ultra-sottile nei tre assi), titolare di un microelettrodo collegato ad una pompa pneumatica (Strumenti di precisione mondiale PV820 pneumatico Pico-pompa). L&#39;ingresso di pressione della pompa pneumatica è collegato ad un serbatoio di azoto compresso. </li><li> Inserire un microelettrodo nel supporto microelettrodo. </li><li> Guarda sotto uno stereo-microscopio, inserire la punta della micropipetta nel nucleo delle cellule. </li><li> Fornire impulsi di pressione a corto di azoto (da 10 a 100 ms di durata, 20 lb / in 2) fino a quando il nucleo diventa uniformemente verdi. </li><li> Incubare le cellule per 4 ore a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. Per ottimale traslocazione della PKC, esibirsi dal vivo-imaging esperimento 20-24 ore dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 4. Visualizzazione di traslocazione della PKC in Living SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia <ol><li> Per l&#39;imaging, usiamo un microscopio invertito Zeiss LSM510 confocale con un Axiovert 200. </li><li> Imaging protocollo è lo stesso per SF9 cellule e dei neuroni sensoriali Aplysia eccezione dei seguenti: SF9 cellule sono ripreso con un obiettivo x63 olio da immersione, mentre i neuroni sensoriali sono Aplysia ripreso con un obiettivo ad immersione olio x40. SF9 cellule vengono esposte a una temperatura controllata camera mantenuta a 26-27 ° C mentre i neuroni di Aplysia sensoriali vengono esposte a temperatura ambiente mantenuto circa 18-20 ° C. </li><li> Usiamo un 30 mW Argon laser (eccitazione a 488 nm) con uscita laser 50% al PKC immagine taggati con proteine ​​eGFP e un laser HeNe (eccitazione a 543nm) per PKC immagine taggati con proteine ​​MRFP. L&#39;argon e HeNe linee laser sono attenuate al 4% e potenza di trasmissione 50%, rispettivamente prima imaging e il foro stenopeico è regolato a uno. </li><li> E &#39;importante avere il piatto cultura stabilizzato sul palco di imaging e di evitare movimenti o vibrazioni. </li><li> Togliere 1 ml di terreni di coltura dal piatto delicatamente con una pipetta 10 ml lasciando 1 mL volume totale nel piatto. </li><li> Per scattare le foto nella sezione centrale della cellula in cui il nucleo può essere visto. </li><li> Impostare una serie temporale di 10-20 immagini confocale di scattare una foto ogni 30 secondi. </li><li> Inizio della serie storica. </li><li> Dopo 2 immagini sono prese (dopo il tempo di 30 punti secondi), aggiungere 1 ml del farmaco (2X concentrazione) delicatamente goccia a goccia sulla parte superiore delle celle usando una pipetta P1000. Il farmaco è aggiunto continuamente per circa 30 secondi. </li><li> Alcuni farmaci inducono una traslocazione veloce che può essere visibile immediatamente dopo il trattamento farmacologico (al momento 60 punti secondi), mentre altri indurre una traslocazione lento che è a pochi minuti ottimale 5-10 post-trattamento (Movie Movie 1 e 2). </li><li> Se il farmaco deve essere lavato via, usare pipette 2 x 10 ml di fare il lavaggio, pipettaggio il tampone di lavaggio giù delicatamente con una pipetta da un lato del piatto e pipeting il supporto sul lato opposto. </li><li> Se il lavaggio è stato efficace e se l&#39;effetto del farmaco è reversibile, PKC torna al citosol entro 30-60 secondi. </li><li> Salvare il filmato come file LSM. </li><li> Usa immagine NIH J software per aprire i file LSM e quantificare le immagini pre e post trattamento farmacologico. La quantificazione è stata descritta altrove 1. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto una tecnica per traslocazione immagine di PKCS fluorescente taggato in tempo reale in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia. SF9 cellule fornire un sistema semplice per traslocazione immagine PKC dal coltura e trasfezione loro è molto semplice in avanti. Al contrario, la microiniezione di neuroni sensoriali Aplysia vuole del tempo per padroneggiare, fino a pochi mesi. Difficoltà legate a questa tecnica comprendono l&#39;intasamento degli elettrodi. Filtraggio della soluzione in...

<table><tbody><tr><td>Cellule Sf9 congelate</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; cellule ovariche</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Grazia&amp;rsquo;Mezzo per insetti, integrato (1X), liquido</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Utilizzare per coltivare cellule Sf9</td></tr><tr><td>Corning 75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; fiasco per coltura cellulare con collo inclinato</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Utilizzare per coltivare cellule Sf9</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Reagente</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Supplementare Grace&amp;rsquo;s media con FBS prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Usare per filtrare la soluzione di Verde Rapido</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Usare per filtrare la soluzione di DNA plasmidico / Fast Green</td></tr><tr><td>Filtrare</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Usare per filtrare la soluzione di Verde Fast</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Usare per filtrare la soluzione di DNA plasmidico / Fast Green</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro</td><td>Strumento</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Utilizzare per coltivare cellule Sf9 prima della trasfezione e dell'analisi di imaging</td></tr><tr><td>Reagente Cellfectin II</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Utilizzato per esprimere PKC marcate con fluoroforo in cellule Sf9</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Utilizzare per visualizzare la microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; neuroni sensoriali</td></tr><tr><td>Capillari di vetro a parete sottile</td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Utilizzare per preparare micr&amp;#8211;Elettrodi per microiniezione</td></tr><tr><td>Punta di pipetta Microloader</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Sterilizzare in autoclave prima dell'uso per riempire la micropipetta&amp;#8211;Elettrodi per microiniezione</td></tr><tr><td>PV820 Pneumatic PicoPump </td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Parte della stazione di microiniezione</td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;portaelettrodo</td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Utilizzare per tenere il micr&amp;#8211;elettrodo </td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Utilizzare per posizionare il micr&amp;#8211;elettrodo nei tre assi</td></tr></tbody></table>

live-imaging di traslocazione della pkc in sf9 cellule e nei neuroni sensoriali aplysia

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Proteina chinasi C (PKCS) sono serina treonina chinasi che svolgono un ruolo centrale nella regolazione una vasta gamma di processi cellulari, come la crescita cellulare e di apprendimento e memoria. Ci sono quattro famiglie note delle isoforme PKC nei vertebrati: PKCS classica (α, βI, βII e γ), nuovo tipo I PKCS (ε e η), romanzo di tipo II PKCS (δ e θ), e PKCS atipici (ζ e ι ). Il PKCS classici sono attivati ​​dal Ca 2 + e diacylclycerol (DAG), mentre il PKCS romanzo sono attivati ​​da DAG, ma sono Ca 2 +-indipendenti. Il PKCS atipici sono attivati ​​né Ca 2 + né DAG. In Aplysia californica, il nostro sistema modello per studiare la formazione della memoria, ci sono tre isoforme specifiche del sistema nervoso PKC uno per ogni categoria principale, cioè la tradizionale PKC ho Apl, il tipo di romanzo che PKC Apl II e il III atipico PKC Apl. PKCS sono lipidi-chinasi attivate, e quindi l&#39;attivazione di PKCS classico e romanzo in risposta a segnali extracellulari è stata spesso correlata con traslocazione della PKC dal citoplasma alla membrana plasmatica. Pertanto, visualizzando traslocazione della PKC in tempo reale in cellule vive è diventato uno strumento prezioso per chiarire le vie di trasduzione del segnale che portano all&#39;attivazione della PKC. Per esempio, questa tecnica ha permesso di stabilire che diverse isoforme della PKC traslocare in condizioni diverse di mediare tipi distinti di plasticità sinaptica e che (5HT) l&#39;attivazione della PKC serotonina Apl II richiede la produzione di entrambi i DAG e acido fosfatidico (PA) per traslocazione 1-2. Soprattutto, la capacità di visualizzare il neurone ripetutamente lo stesso ci ha permesso, ad esempio, per misurare desensibilizzazione della risposta PKC nei minimi dettagli 3. In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione SF9 colture cellulari, colture di neuroni sensoriali Aplysia sono stati descritti in un altro articolo video 4, esprimendo PKCS fluorescente taggato in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali e Aplysia live-imaging di traslocazione della PKC in risposta a attivatori diversi utilizzando la microscopia a scansione laser.

In questo video, dimostriamo la visualizzazione di traslocazione della PKC nelle cellule viventi utilizzando PKCS fluorescente tag.

Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia

Le protein chinasi C (PKC) sono serina-treonina chinasi che svolgono un ruolo centrale nella regolazione di un'ampia varietà di processi cellulari, quali la crescita cellulare e...

Lo scopo di questa procedura è visualizzare la traslocazione di PKC marcati con fluorescenza in cellule vive. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto colture di cellule SF nine o colture di neuroni sensoriali provenienti da Plegia California. Il secondo passaggio consiste nell'esprimere PKC marcati con fluorescenza all'interno delle cellule.L'ultimo passaggio consiste nell'immaginare la traslocazione della PKC in risposta a diversi attivatori mediante microscopia a scansione laser. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una regolazione differenziale delle diverse isoforme della PKC da parte di messaggeri secondari come il digliceride, attraverso l'analisi in tempo reale della traslocazione della PKC in cellule vive. Ciao, mi chiamo Carol Ferra.Sono un ricercatore associato nel laboratorio del dottor Wayne Sawn presso l'Istituto Neurologico di Montreal. Oggi dimostrerò l'imaging in tempo reale della traslocazione della PKC nei neuroni sensoriali di Aplysia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della plasticità sinaptica, come ad esempio come vengono attivate le diverse isoforme della PKC durante la formazione della memoria.Per preparare colture monocellulari di cellule SF nine in un'incubatrice per colture cellulari, aggiungere otto millilitri di mezzo per insetti di Grace con il 30% di siero fetale bovino in un fiasco per colture cellulari da 75 centimetri quadrati, quindi scongelare rapidamente il tubo congelato di cellule SF nine in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius muovendo il tubo avanti e indietro per circa uno o due minuti. Successivamente, trasferire le cellule SF nine nel fiasco per colture cellulari e agitare delicatamente il fiasco a mano per distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare le cellule per uno o due ore a 27 gradi Celsius fino a quando non si saranno attaccate.Quindi rimuovere il vecchio mezzo dal matraccio e sostituirlo con altri 10 millilitri di mezzo per insetti di Grace fresco con FBS al 30% e incubare le cellule a 27 gradi Celsius fino a quando non raggiungono la confluenza. Per mantenere colture in monostato, rimuovere il mezzo vecchio dal matraccio confluenziale delle cellule SF9 e aggiungere cinque millilitri di mezzo per insetti di Grace con FBS al 10%, quindi battere leggermente sul lato del matraccio più volte per staccare le cellule SF9. Successivamente, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, pipettare delicatamente il mezzo su e giù.Una volta spruzzato sulla parete del pallone durante il travaso, trasferire le cellule in un tubo sterile in polistirene da 15 millilitri. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare SF nine a otto millilitri di mezzo per insetti di Grace con il 10% di FBS nel nuovo pallone da coltura cellulare di 75 centimetri quadrati, con un rapporto di diluizione di uno a cinque. Per mantenere la crescita in fase logaritmica, agitare delicatamente il pallone a mano.Successivamente, incubare nuovamente le cellule a 27 gradi Celsius fino a quando non diventano confluenti. Dopo l'incubazione, le cellule SF9 sono pronte per essere utilizzate nell'espressione di PKC marcate con fluoroforo, come descritto nella procedura scritta precedente all'espressione di PKC marcate con fluoroforo. Colture cellulari di neuroni pleonici sono preparate in piatti di coltura con fondo in vetro Matech come precedentemente descritto. Due giorni dopo l'isolamento dei neuroni sensoriali, filtrare un'ampolla precedentemente preparata di Fast Green utilizzando una siringa e un filtro per siringa da 20 millimetri con una dimensione dei pori di 0,2 micron.Preparare una soluzione di DNA plasmidico che codifica per E-G-F-P-P KC API due in acqua distillata contenente lo 0,5% di verde brillante a una concentrazione non superiore a 0,4 microgrammi per microlitro. Filtrare la soluzione di DNA plasmidico con verde brillante utilizzando una siringa da un millilitro e un filtro per siringa da quattro millimetri con una dimensione dei pori di 0,2 micron. Successivamente, centrifugare la soluzione di DNA plasmidico con verde brillante a 16.110 ×g per 15 minuti utilizzando una microcentrifuga.Successivamente, preparare elettrodi affilati per la microiniezione di neuroni utilizzando un estrattore di microelettrodi. Estrarre microelettrodi di vetro utilizzando capillari di vetro sottile con filamenti interni. Riempire ciascun elettrodo con due microlitri di soluzione di DNA plasmidico con verde brillante.Utilizzando una punta di pipetta per carico micro, la microiniezione viene eseguita alla stazione di microiniezione. La stazione di microiniezione è costituita da un grande piano in vetro fatto in casa per contenere le piastre di coltura su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni. Uno stereomicroscopio con illuminazione alogena esterna, un micromanipolatore e un porta microelettrodi collegato a una pompa pneumatica.L'ingresso della pressione della pompa pneumatica è collegato a una bombola di azoto compresso. Trasferire la piastra per colture con fondo in vetro matech contenente le colture di neuroni plegia alla stazione di microiniezione e inserire un microelettrodo nel supporto per microelettrodi. Osservare i neuroni al microscopio stereoscopico e inserire la punta della micropipetta nel nucleo cellulare.Erogare brevi impulsi di pressione di azoto della durata di 10-100 millisecondi e di 20 libbre per pollice quadrato fino a quando il nucleo diventa uniformemente verde. Incubare le cellule per quattro ore a temperatura ambiente e conservarle a quattro gradi Celsius fino all'uso. Un microscopio confocale invertito Zeiss LSM 510 con un Axio Avert.200 viene utilizzato per l'acquisizione di immagini sia di cellule SF9 che di neuroni sensoriali di Plegia.L'immagine dei neuroni sensoriali della plegia è dimostrata in questo video. I dettagli per l'acquisizione delle immagini delle cellule SF nine sono disponibili nel protocollo scritto. Utilizzare un laser ad argon da 30 milliwatt con un'uscita laser al 50% per acquisire immagini della PKC marcata con la proteina EGFP.Successivamente, attenuare la linea laser dell'Argonne al 4% di trasmissione. Regolare quindi il diaframma a uno, stabilizzare la piastra di coltura sullo stadio di imaging ed evitare movimenti o vibrazioni. Rimuovere delicatamente un millilitro di mezzo di coltura dalla piastra utilizzando una pipetta da 10 millilitri, lasciando un volume totale di un millilitro.Nella piastra. Individuare la sezione centrale delle cellule in cui è visibile il nucleo. Impostare una serie temporale di 10-20 immagini confocali con intervalli di tempo di 30 secondi.Avviare il filmato e, dopo aver acquisito la seconda immagine, indurre la traslocazione aggiungendo delicatamente un millilitro di farmaco a concentrazione doppia. Aggiungere il farmaco goccia a goccia sopra le cellule in modo continuo per circa 30 secondi. In questo caso, la serotonina viene utilizzata per indurre una traslocazione rapida, visibile immediatamente dopo il trattamento con il farmaco.Alcuni farmaci inducono una traslocazione lenta, che risulta ottimale solo da cinque a dieci minuti dopo il trattamento; rimuovere il farmaco con due pipette da 10 millilitri, aggiungendo delicatamente il buffer di lavaggio con una pipetta su un lato della piastra ed aspirando il mezzo dall'altro lato. Se il lavaggio è efficace e l'effetto del farmaco è reversibile, la PKC tornerà nel citosol entro 30-60 secondi. Salvare il filmato come file LSM mostrato.Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi dell'immagine in tempo reale della traslocazione della PKC nei neuroni sensoriali della plessia. La PKC APL due marcata con E-G-F-P è stata espressa in un neurone sensoriale e una serie di 10 immagini confocali è stata registrata a intervalli di 30 secondi. In questo esempio, la serotonina è stata aggiunta alla piastra dopo 30 secondi di registrazione.In questo esempio, viene mostrata l'acquisizione in tempo reale della traslocazione della PKC in cellule SF nine. E-G-F-P-P KC APL uno e M-R-F-P-P KC APL due sono stati co-espressi in cellule SF nine e una serie di 10 immagini confocali è stata registrata a intervalli di tempo di 30 secondi. Uno due DIOCTYL SN glicerolo.È stato aggiunto al piatto un analogo permeabile alle cellule del glicerolo DYL dopo 30 secondi di registrazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere pkcs marcati con fluorescenza nei neuroni sensoriali dell'aplasia e di come effettuare l'immagine della traslocazione della PKC in cellule vive.

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Fonte: Jongbloets, B. C., et al. Visualizzazione dell'attività della proteina chinasi A nei topi che si comportano con la testa fissata utilizzando la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni in vivo. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra una procedura di microscopia di imaging a fluorescenza a due fotoni per visualizzare l'attività della proteina chinasi A in topi con testa fissa durante la locomozione forzata.

Visualizzazione dell'attività della proteina chinasi A in un topo utilizzando la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni 

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Questo protocollo presenta un metodo per l'imaging dell'attività della popolazione neuronale con risoluzione a singola cellula in specie di invertebrati non transgenici utilizzando coloranti sensibili alla tensione di assorbanza e un array di fotodiodi. Questo approccio consente un flusso di lavoro rapido, in cui l'imaging e l'analisi possono essere perseguiti nel corso di un solo giorno.

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Questo documento presenta un protocollo graduale dettagliato su come utilizzare un sistema integrato multifunzionale e programmabile dall'utente che consente l'imaging multicanale automatico e l'analisi meccanobiologica per chiarire la meccanosensibilità della proteina associata al Sì (YAP).

Meccanobiologia completamente ottica Interrogazione di proteine associate al sì nel cancro umano e nelle cellule normali utilizzando un sistema multifunzionale

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Scopri la visualizzazione in tempo reale della traslocazione della PKC nelle cellule SF9 e nei neuroni sensoriali di Aplysia utilizzando microscopia confocale a scansione laser. Questo metodo consente di studiare la regolazione differenziale degli isoformi PKC.

Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia

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