Name: Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar Cromatografia su strato sottile (TLC) Accoppiato con cromatografia gas-liquido (GLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Scopri il profilo dei glicerolipidi polari in Arabidopsis thaliana mediante cromatografia su strato sottile accoppiata con cromatografia gas-liquido. Questo metodo semplice e robusto consente analisi quantitative su larga scala.

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Questo lavoro è supportato da un finanziamento da US National Science Foundation a Christoph Benning.

1. Estrazione dei lipidi <ol><li> Iniziare l'estrazione dei lipidi dalla raccolta di 30 mg di 4 settimane di età lascia Arabidopsis da piante coltivate su agar solidificato media o suolo e trasferirli in provette da 1,5 ml in polipropilene reazione. Foglie fresche possono essere istantaneamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. </li><li> Aggiungere 300 microlitri di estrazione solvente composto da metanolo, cloroformio e acido formico (20:10:01, v / v / v) per ogni campione. Agitare vigorosamente (utilizzando una vernice shaker o simili) per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 150 ml di acido fosforico 0,2 M (H 3 PO 4), 1 M di cloruro di potassio (KCl) e mescolare brevemente nel vortex. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg a temperatura ambiente per 1 minuto. Lipidi sciolte nella fase cloroformio minore sarà individuato su piastre TLC. </li></ol> 2. Cromatografia su strato sottile (TLC) 15 <ol><li> Per preparare piatti TLC, immergere uno 20cmx20cm gel di silice rivestito con lastrina di caricamento striscia per 30 sec in 0,15 M di solfato di ammonio ((NH 4) 2 SO 4) soluzione, dopo immergendo per 30 secondi, asciugare la piastra per almeno 2 giorni un recipiente coperto. Durante l'attivazione la sublimazione di ammonio lascia dietro di acido solforico, che protonates fosfatidilglicerolo necessarie per la sua separazione da glycerolipids altri. </li><li> Il giorno della sperimentazione, attivare TLC piastre di cottura in forno a 120 ° C per 2,5 ore. </li><li> Dopo il raffreddamento le piastre attivato a temperatura ambiente, usare una matita per disegnare una linea retta (1,5 cm dal bordo del piatto) attraverso la piastra all'origine del cromatogramma. </li><li> In una cappa aspirante, lentamente consegnare 3 X 20 l di estratto lipidico in fase di cloroformio inferiore utilizzando una pipetta 20 microlitri con 200 ul punte di plastica gialla sotto una debole corrente di N 2. A tal fine, un tubo Tygon è collegata al regolatore del serbatoio 2 N. Mantenere il posto più piccolo di 1 cm di diametro. Ogni piatto può contenere fino a 10 campioni (quando successiva analisi GLC è prevista). </li><li> Come lipidi punti completamente asciutto nella cappa, preparare il solvente di sviluppo composto da acetone, toluene, acqua (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Se l'umidità relativa dell'aria è alta, la separazione potrebbe essere danneggiato. In questo caso l'acqua deve essere ridotta a dare (91 ml: 30 ml: 7,0 mL) per ottenere la separazione desiderata. </li><li> Versare 80 ml solvente di sviluppo in un TLC sigillabile camera di sviluppo (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0 cm / cm / cm) e posizionare la lastra nella vasca con l'estremità del campione verso il basso. Tenuta del serbatoio con il morsetto. Il solvente salirà il piatto e lipidi saranno separati. Il tempo di sviluppo è di circa 50 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Quando il fronte del solvente ha raggiunto 1 cm dal bordo superiore della piastra, rimuovere con cautela la piastra dal serbatoio e asciugare completamente nella cappa per circa 10 minuti. </li><li> Lipidi separati da TLC può essere reversibile macchiato brevemente con iodio per l'analisi quantitativa o irrimediabilmente macchiata con acido solforico o α-naftolo. <ol><li> Carbonizzazione acido solforico: spruzzare il piatto con il 50% di acido solforico in acqua in una bottiglia di vetro a spruzzo nella cappa e cuocere in forno a 120 ° C per 15 minuti (Figura 2A). </li><li> α-naftolo colorazione per glicolipidi: spruzzare il piatto con del 2,4% (w / v) α-naftolo nel 10% (v / v) di acido solforico, 80% (v / v) di etanolo e cuocere in forno a 120 ° C per 3-5 minuti fino a quando le bande glicolipidi sono macchiati rosa o viola (Figura 2B). Trattamento eccessivo porterà alla carbonizzazione di tutti i lipidi a causa della presenza di acido solforico nel reagente. </li><li> Colorazione di iodio: in una cappa aspirante, la piastra in una vasca TLC chiuso con cristalli di iodio (in un vassoio sul fondo portando alla saturazione dell'atmosfera con vapori di iodio fino a quando i lipidi sono visibili). Non esporre la piastra di iodio troppo lungo lo iodio può modificare covalentemente acidi grassi polinsaturi (Figura 2C). In alternativa, per evitare l'ossidazione dei lipidi, solo piste di serie intervallate da corsie campione deve essere colorato con una lana di vetro collegato pipetta Pasteur con cristalli di iodio attraverso la quale viene soffiata N 2 su singole corsie standard. </li></ol></li></ol> 3. Grassi Acil metilestere (FAME) di reazione 16 <ol><li> Rimuovere macchie di silice circostanti lipidi identificato dalla piastra TLC con una lametta. Raschiare la silice che contiene lipidi e trasferire la polvere di silice usando un imbuto in un tubo di vetro con un (PTFE)-tappo a vite rivestiti in Teflon. </li><li> Aggiungere 1 ml 1 N di acido cloridrico (HCl) in metanolo anidro di ogni campione con pipetta di vetro. </li><li> Aggiungere 100 ul 50 mg ml -1 pentadecanoic acido (15:00) con 200 microlitri pipetta ad ogni campione come standard interno con una pipetta 200 microlitri punta con 200 microlitri di plastica gialla. Mantenere un tubo con solo acido pentadecenoic in metanolica HCl come controllo. Chiudere ermeticamente con tubi di vetro rivestita di teflon tappi. </li><li> Incubare gltubi culo in un bagno d'acqua 80 ° C per 25 minuti. Tubi devono essere sigillati in modo che il solvente non evapori. </li><li> Dopo che i tubi si sono raffreddati, aggiungere 1 ml di sodio cloruro 0,9% seguito da 1 ml di esano e vortice vigorosamente. Centrifugare i campioni a 1000xg per 3 minuti. </li><li> Nella cappa, rimuovere lo strato esano / superiore del campione con pipetta Pasteur e collocarlo in un nuovo tubo di vetro 13x100 millimetri. </li><li> Far evaporare esano sotto una debole corrente di N 2 senza seccare completamente. </li><li> Sciogliere il grasso risultante acil methylesters s in 60 microlitri esano. Trasferimento dei campioni in fiale autocampionatore e tappo. I campioni possono essere conservati a 4 ° C per breve termine e -20 ° C per pochi giorni. </li></ol> 4. Gascromatografia (GLC) 10 <ol><li> Prima di iniziare GLC, Assicurarsi che l'elio, idrogeno e cilindri ad aria sono riempiti. </li><li> Esano sufficiente deve essere aggiunto al serbatoio del solvente ed il contenitore dei rifiuti deve essere vuoto. Per i grassi separazione acil methylesters, allegare un DB-23 colonna alla macchina. </li><li> Fiale posto nel campionatore automatico. Avviare il software Chemstation per GLC sul computer sistema. </li><li> Impostare la temperatura di ingresso a 250 ° C con una portata di elio a 48,6 ml min -1 e la pressione a 21,93 psi. Il rapporto di divisione è 30,0: 1. </li><li> La temperatura del forno è impostato inizialmente a 140 ° C per 2 minuti e cresciuto a 160 ° C ad una velocità di 25 ° C min -1. Quindi impostare la temperatura aumenterà da 160 ° C a 250 ° C ad una velocità di 8 ° C min -1 e tenere a 250 ° C per 4 minuti seguita da una diminuzione a 140 ° C ad una velocità di 38 ° C min - 1. Una corsa dura circa 21 minuti. </li><li> La temperatura del rivelatore a ionizzazione di fiamma è di 270 ° C con un tasso di idrogeno flusso di 30,0 ml min -1, portata d'aria a 400 ml min -1 e la portata di elio al 30,0 ml min -1. </li><li> Inserire il numero di fiale e nomi di esempio nella tabella sequenza di esecuzione. Impostare il 10 L iniettore per iniettare un campione di 2 microlitri per flaconcino. </li><li> Quando lo strumento è pronto, iniziare la sequenza di esecuzione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Esempi di colorazione irreversibile di TLC separati da lipidi da 4 settimane di età piantine di Arabidopsis sono mostrati nella Figura 2. I lipidi acido solforico colorato (Figura 2A) sono carbonizzati e appaiono come macchie scure. α-naftolo è preferito a macchia glicolipidi come MGDG, dgdg, SQDG glicolipidi ecc colorati con α-naftolo portare una rosa-viola, mentre gli altri lipidi polari macchia gialla (Figura 2B). La colorazione di iodio è reversibile e dà lipidi un colore giallastro che scompare in un tempo breve evapora iodio (Figura 2C). Lipidi iodio brevemente macchiato può essere sottoposto ad analisi GLC lipidi senza macchia, anche se sono preferibili per ridurre abbattere dei lipidi. Se fatto con successo, segnali distintivi che rappresentano differenti grassi acil metilico saranno osservati dopo GLC (Figura 3). Grassi metilico acilici con catena di carbonio più brevi e meno doppi legami hanno tempo di permanenza più brevi con la batteria DB-23 colonna. Grassi acil profiling metilico è uno strumento sensibile per identificare i mutanti con alterata composizione lipidica. Nella Figura 4, il MGDG18: 3 rapporto di acidi grassi molare è diminuito nel tgd4-1 mutante rispetto al wild-type 18. Dividendo il moli di grassi acil metilico per una classe di lipidi con le moli di tutte le classi di lipidi, il rapporto molare di ogni lipidi vengono calcolati. Ad esempio, per calcolare il rapporto molare di MGDG: (MGDG)% mol = Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (totale)] x100% I rapporti conseguenti molare di ogni classe dei lipidi sia dal tipo selvaggio e il mutante può essere paragonato. Per esempio, il tgd4-1 mutante è aumentata quantità relative di MGDG e PG, ma è diminuito quantità di dgdg e PE (Figura 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso di analisi dei lipidi polari utilizzando piantine di Arabidopsis. Lipidi totali sono estratti da 4 settimane di età piantine di Arabidopsis e separati da TLC. I lipidi separato può essere grattata da lastrina per transesterificazione seguita da analisi GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separazione dei lipidi su lastre TLC. Estratti lipidici di 35 mg (peso vivo) piantine di tipo selvatico sono separati da TLC e macchiato da acido solforico (A), α-naftolo (B) o vapori di iodio (C). Tre ripetizioni sono indicati in ogni metodo di colorazione. Dgdg, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidilinositolo, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Analisi GLC della Methylesters acidi grassi (FAME) derivato dal MGDG del tipo selvatico. FAMEs sono separati su una colonna di 30 m capillare e rilevati da ionizzazione di fiamma. Pentadecanoic acido (15:00) è utilizzato come standard interno. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Profilo degli acidi grassi di MGDG nel tipo selvatico Col2 (colonne bianche) e la tgd4-1 mutante (colonne nere). Gli acidi grassi sono presentati come numero di atomi di carbonio, seguito dal numero di doppi legami. Tre ripetizioni viene calcolata la media e le deviazioni standard sono mostrati. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Polare composizione dei lipidi del tipo selvatico Col2 (colonne bianche) e la tgd4-1 mutante (colonne nere). Tre ripetizioni viene calcolata la media e le deviazioni standard sono indicate dalle barre di errore.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

TLC accoppiato con GLC fornisce uno strumento robusto e rapido per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi polari nelle piante. Piccoli cambiamenti nella composizione lipidica possono essere identificati, quindi, questo metodo è stato utilizzato per lo screening su larga scala di mutanti ridotta nei percorsi metabolici dei lipidi polari 1,20. Questo metodo è anche ampiamente utilizzato per attività di monitoraggio degli enzimi che utilizzano lipidi polari come substrato. 2,6,7 Oltre a foglie, la composizione lipidica di altri tessuti vegetali come radici e semi o frazioni subcellulari come i cloroplasti e mitocondri può essere determinata anche nello stesso modo. Il sistema di solventi (acetone, toluene, acqua) usato qui è ottimizzato per la separazione di glicolipidi e fosfolipidi nelle piante. Tuttavia, in tgd1, 2,3,4 mutanti e cloroplasti isolati, TGDG corre insieme al PE, mentre tetragalactosyldiacylglycerol funziona con PC. In questo caso un sistema di solvente con cloroformio, metanolo, acido acetico e acqua (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) viene utilizzato 13. A volte bidimensionale TLC utilizzando due diversi sistemi solvente viene eseguita per separare ulteriormente glicolipidi e fosfolipidi 19. Inoltre, tessuti vegetali possono essere direttamente sottoposte alla reazione FAME seguito da GLC per determinare il profilo totale di acidi grassi, senza separazione iniziale sul TLC 5. Accanto alla TLC-GLC dimostrato sistema, un altro metodo utilizzato per la profilazione dei lipidi si basa sulla diretta di massa a ionizzazione electrospray tandem spettrometria di 17. In questo metodo la separazione cromatografica iniziale dei lipidi nel estratto è omesso. Tuttavia, questo metodo richiede apparecchiature costose e personale esperto, che lo rende meno utile per analisi di routine in laboratorio o per lo screening mutante.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>HCl metanolico 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Diluire a 1N con metanolo</td></tr><tr><td>Piastre TLC Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Con supporto preassorbente</td></tr><tr><td>Camera per TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Provette con tappo a vite</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a vite</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>Disco in PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>Sistema GLC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Colonna DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>Vial per GLC</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per vial GLC</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Software Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana profiling glycerolipid polar cromatografia su strato sottile (tlc) accoppiato con cromatografia gas-liquido (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Membrane biologiche delle cellule separato dall&#39;ambiente. Da una singola cellula per le piante e gli animali pluricellulari, glycerolipids, come fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, membrane a doppio strato forma che fungono da entrambi i confini e interfacce per lo scambio chimico tra le cellule e l&#39;ambiente circostante. A differenza degli animali, cellule vegetali hanno un organello speciale per la fotosintesi, il cloroplasto. Il sistema a membrana intricato del cloroplasto contiene glycerolipids unico, vale a dire glicolipidi carente di fosforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (dgdg), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. I ruoli di questi lipidi sono oltre la semplice strutturali. Queste glicolipidi e glycerolipids altri sono stati trovati nelle strutture cristalline di fotosistema I e II che indicano il coinvolgimento di glycerolipids nella fotosintesi 8,11. Durante il digiuno fosfato, dgdg è trasferito alle membrane extraplastidic per compensare la perdita di fosfolipidi 9,12. Gran parte della nostra conoscenza della biosintesi e funzione di questi lipidi è stata tratta da una combinazione di studi genetici e biochimici con 14 Arabidopsis thaliana. Durante questi studi, una procedura semplice per l&#39;analisi dei lipidi polari è stato essenziale per lo screening e analisi di mutanti lipidi e saranno descritte in dettaglio. Un estratto lipidico foglia è prima separate da cromatografia su strato sottile (TLC) e glycerolipids sono macchiati reversibilmente con vapori di iodio. I lipidi individuali sono raschiati dalla piastra TLC e convertito in grasso methylesters acil (FAME), che vengono analizzati dal gas-cromatografia liquida accoppiata con rilevazione a ionizzazione di fiamma (FID-GLC) (Figura 1). Questo metodo ha dimostrato di essere uno strumento affidabile per lo screening dei mutanti. Ad esempio, il tgd1, 2,3,4 reticolo endoplasmatico-to-plastidiale mutanti traffico di lipidi sono stati scoperti in base all&#39;accumulo di un galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) e una diminuzione della quantità relativa di 18:3 (carboni: doppio obbligazioni) grassi gruppi acil in lipidi di membrana 3,13,18,20. Questo metodo è applicabile anche per determinare le attività enzimatiche di proteine ​​con lipidi come substrato 6.

Composizione di estratti dei lipidi polari e la composizione in acidi grassi di glycerolipids individuali sono determinati in un esperimento lipidi semplice e robusto profilo. A tal fine, glycerolipids sono isolati per cromatografia su strato sottile e sottoposti a transmetilazione dei loro gruppi acilici. Grassi methylesters acil sono quantificati da gas-cromatografia in fase liquida.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar Cromatografia su strato sottile (TLC) Accoppiato con cromatografia gas-liquido (GLC)

Le membrane biologiche separano le cellule dall'ambiente circostante. Da una singola cellula fino alle piante e agli animali multicellulari, i glicerolipidi, come...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la composizione in lipidi polari dei germogli di arabidopsis. Questo viene ottenuto estraendo innanzitutto i lipidi dai germogli. I lipidi polari vengono quindi separati mediante cromatografia su strato sottile.In seguito, i singoli spot lipidici vengono isolati dalla piastra a strato sottile e convertiti in esteri metilici degli acidi grassi mediante transesterificazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel quantificare la composizione degli esteri metilici degli acidi grassi mediante cromatografia gas-liquido. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano il rapporto molare e il profilo degli acidi grassi di ciascun lipide polare nei ceppi di tipo selvaggio e nei mutanti.Ciao, mi chiamo Christophe Benning. Molti di voi ci hanno chiesto come eseguire un'analisi quantitativa dei lipidi polari. Utilizziamo un metodo molto semplice e robusto che ci ha dato buoni risultati durante lo screening su larga scala di mutanti nella pianta modello opsis o nei motori RG chilometro.Altri eccellenti metodi, come il profilo lipidico basato sulla spettrometria di massa, richiedono attrezzature costose e molta esperienza e formazione. Utilizziamo una procedura in due fasi che prevede una semplice cromatografia su strato sottile combinata con la quantificazione di esteri metilici di acidi grassi dopo l'isolamento di mutanti. Di solito è richiesta un'analisi più quantitativa.Questo viene effettuato isolando i lipidi di membrana dalla piastra a strato sottile e preparando esteri metilici degli acidi grassi, che vengono quantificati mediante cromatografia gassosa. Il metodo è altamente riproducibile e i risultati sono confrontabili con tecniche più complesse basate sulla spettrometria di massa. Il procedimento sarà illustrato da Zen Wang, studente laureando del mio laboratorio. Iniziare l'estrazione dei lipidi raccogliendo 30 milligrammi di foglie di Arabidopsis di quattro settimane di età da piante cresciute su mezzo solido all'agar o su suolo. Trasferire le foglie in provette da reazione in propilene da 1,5 millilitro.Aggiungere 300 microlitri di solvente di estrazione composto da metanolo, cloroformio e acido formico a ciascun campione. Agitare vigorosamente i campioni per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di acido fosforico 0,2 molare, cloruro di potassio 1 molare ed eseguire un vortex.Centrifugare brevemente il campione a 13.000 ×g per un minuto. A temperatura ambiente, i lipidi disciolti nella fase inferiore di cloroformio verranno depositati su piastre per cromatografia su strato sottile. Per preparare le piastre TLC, immergere una piastra TLC da 20 per 20 centimetri rivestita con gel di silice e dotata di striscia di carico in una soluzione di solfato di ammonio 0,15 M.Dopo aver immerso per 30 secondi, asciugare la piastra per almeno due giorni in un contenitore coperto. Durante l'attivazione, la sublimazione dell'ammonio lascia acido solforico, che protona il fosfato e il glicerolo necessari per la sua separazione da altri lipidi glicerolici. Nel giorno dell'esperimento, attivare le piastre TLC riscaldandole in forno a 120 gradi Celsius per due ore e mezza.Dopo aver raffreddato le piastre attivate a temperatura ambiente, utilizzare una matita per tracciare una linea retta attraverso la piastra in corrispondenza dell'origine del cromatogramma. In una cappa aspirante, un tubo tigon collegato al regolatore della bombola di azoto viene utilizzato per fornire un flusso di gas azoto; sotto un flusso lento di azoto, si aggiungono lentamente tre volte 20 microlitri dell'estratto lipidico dalla fase cloroformica inferiore sulla piastra, usando una pipetta da 20 microlitri con punta di plastica gialla da 200 microlitri. Si utilizza una pipetta da 20 microlitri per mantenere la macchia con un diametro inferiore a un centimetro.Ogni piastra può contenere fino a 10 campioni una volta che le macchie di lipidi si sono completamente asciugate. All'interno della cappa, preparare il solvente di sviluppo composto da acetone, toluene e acqua. Versare 80 millilitri del solvente di sviluppo in una camera sigillabile per lo sviluppo TLC e inserire la piastra nel serbatoio.Con l'estremità del campione rivolta verso il basso, sigillare il serbatoio. Utilizzando la molletta, il solvente risalirà la piastra e i lipidi verranno separati. Il tempo di sviluppo è di circa 50 minuti a temperatura ambiente.Quando il fronte del solvente ha raggiunto un centimetro dal bordo superiore della piastra, rimuovere con attenzione la piastra dal serbatoio e farla asciugare completamente in cappa per 10 minuti. I lipidi separati mediante TLC possono essere temporaneamente colorati in modo reversibile con iodio per analisi quantitative oppure permanentemente colorati con acido solforico o alfa natal. Per colorare in modo irreversibile la piastra mediante carbonizzazione con acido solforico.Nebulizzare la piastra con acido solforico al 50% in acqua utilizzando un flacone spray in vetro all'interno della cappa e cuocere a 120 gradi Celsius per 15 minuti. In alternativa, per la colorazione con alpha natal per i glicolipidi, nebulizzare la piastra con alpha natal al 2,4% peso su volume in acido solforico al 10% volume su volume, etanolo al 80% volume su volume. Cuocere la piastra a 120 gradi Celsius per tre-cinque minuti fino a quando le macchie di glicolipidi diventano rosa o viola.Eseguire la colorazione con iodio: in una cappa, preparare un contenitore chiuso per cromatografia in fase liquida con cristalli di iodio disposti su un vassoio nella parte inferiore del contenitore, in modo da saturare l'atmosfera con vapori di iodio. Posizionare la piastra di cromatografia su strato sottile (TLC) all'interno del contenitore ed esporla allo iodio fino a quando i lipidi diventano visibili. Evitare un'esposizione prolungata allo iodio, poiché lo iodio potrebbe legarsi in modo covalente.Modificare gli acidi grassi polinsaturi. Rimuovere la silice circostante le macchie lipidiche identificate dalla piastra TLC utilizzando una lametta e raschiare la silice contenente i lipidi. Utilizzando un imbuto, trasferire la polvere di silice in un tubo di vetro con tappo a vite provvisto di guarnizione in teflon.Aggiungere un millilitro di acido cloridrico in metanolo anidro a ciascun campione mediante pipetta di vetro. Quindi aggiungere 100 microlitri di acido pentadecanoico a 50 microgrammi per millilitro a ciascun campione come standard interno, utilizzando una pipetta da 200 microlitri con punta di plastica gialla da 200 microlitri. Preparare inoltre un tubo contenente soltanto acido pentadecanoico in metanolo con acido cloridrico come controllo.Chiudere ermeticamente i tubi di vetro con tappi rivestiti in teflon. Incubare i tubi di vetro in un bagno d'acqua a 80 gradi Celsius per 25 minuti. I tubi devono essere sigillati in modo che il solvente non evapori dopo il raffreddamento dei tubi.Aggiungere un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% seguito da un millilitro di esano, quindi vortexare vigorosamente e centrifugare i campioni a 1000 ×g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere lo strato superiore di esano del campione con una pipetta Pasteur sotto cappa chimica e trasferirlo in un nuovo tubo di vetro da 13 × 100 millimetri. Evaporare l'esano sotto un flusso lento di azoto senza portare a completa essiccazione, quindi risospendere gli esteri metilici degli acidi grassi ottenuti in 60 microlitri di esano. Trasferire i campioni in vial per autosampler, quindi chiuderli ermeticamente.I campioni possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un periodo breve e a meno 20 gradi Celsius per alcuni giorni prima dell'inizio della GLC. Assicurarsi che le bombole di elio, idrogeno e aria siano piene; è necessario aggiungere esaano sufficiente al serbatoio del solvente e il contenitore dei rifiuti deve essere vuoto per la separazione dei metil esteri degli acidi grassi. Collegare una colonna DB 23 all'apparecchio.Posizionare i vial nel campionatore automatico. Avviare il software Chem Station per GLC sul sistema.informatico. Impostare la temperatura dell'ingresso a 250 gradi Celsius con un flusso di elio di 48,6 millilitri al minuto e una pressione di 21,93 PSI.Il rapporto di suddivisione è di 30 a uno. La temperatura del forno è impostata inizialmente a 140 gradi Celsius per due minuti e poi aumentata a 160 gradi Celsius a un tasso di 25 gradi Celsius al minuto. Successivamente, impostare l'aumento della temperatura da 160 gradi Celsius a 250 gradi Celsius a un tasso di otto gradi Celsius al minuto, mantenendo la temperatura a 250 gradi Celsius per quattro minuti, seguito da una diminuzione a 140 gradi Celsius a un tasso di 38 gradi Celsius al minuto.Utilizzando questo profilo di temperatura, un'analisi richiede circa 21 minuti. La temperatura del rivelatore a ionizzazione di fiamma è di 270 gradi Celsius, con una portata di idrogeno di 30 millilitri al minuto. Portata dell'aria a 400 millilitri al minuto e portata dell'elio a 30 millilitri al minuto.Inserire il numero di provette e i nomi dei campioni nella tabella della sequenza di esecuzione. Impostare l'iniettore da 10 microlitri per iniettare due microlitri di campione per ogni provetta. Quando lo strumento è pronto, avviare la sequenza di esecuzione.Di seguito sono mostrati esempi di colorazione di lipidi separati mediante TLC da piantine di Arabidopsis di quattro settimane. I lipidi colorati con acido solforico vengono carbonizzati e appaiono come macchie marroni. L'alfa natale è preferito per la colorazione di glicolipidi come M-G-D-G-D-G-D-G e SQ dg.I glicolipidi colorati con alfa natal presentano un colore rosa-violaceo, mentre gli altri lipidi polari appaiono gialli. La colorazione con iodio è reversibile e conferisce ai lipidi un colore giallastro che scomparirà in breve tempo man mano che l'iodio evapora. In breve, i lipidi colorati con iodio possono essere sottoposti ad analisi mediante GLC, anche se è preferibile utilizzare lipidi non colorati per ridurre la degradazione dei lipidi, qualora ciò sia possibile.Segnali distintivi rappresentanti diversi metil esteri degli acidi grassi saranno osservati dopo la gascromatografia in fase liquida (GLC); i metil esteri degli acidi grassi con catene carboniose più corte e minor numero di doppi legami presentano un tempo di ritenzione più breve. Utilizzando la colonna DB 23. Il profilo dei metil esteri degli acidi grassi è uno strumento sensibile per identificare mutanti con composizione lipidica alterata.Il rapporto molare degli acidi grassi tre di MGDG 18 è ridotto nel mutante TGD four dash one rispetto al tipo selvatico dividendo le moli di estere metilico degli acidi grassi per una classe lipidica con le moli di estere metilico degli acidi grassi di tutte le classi lipidiche. Per tutte le classi lipidiche, vengono calcolati i rapporti molari di ciascun lipide; i rapporti molari risultanti di ogni classe lipidica, provenienti sia dal tipo selvatico che dal mutante, possono essere confrontati qui. È evidente che il mutante TGD four dash one presenta quantità relative aumentate di MGDG e pg, ma quantità ridotte di D-G-D-G-N-P-E. La cromatografia su strato sottile consente l'esame di molti campioni in parallelo e permette un'analisi visiva delle principali differenze nei profili lipidici.Inoltre, analizzando una TLC, si esaminano essenzialmente molti enzimi e geni necessari per la sintesi dei lipidi e quindi per il profilo lipidico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la composizione dei lipidi polari mediante TOC e GOC. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con il tuo esperimento.

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