Sottocutaneo infezione di Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare la sopravvivenza e la disseminazione di stafilococco aureo resistente alla meticillina o MA, nonché i livelli di chemochine e citochine nei siti di infezione. Ciò si ottiene rimuovendo la pelliccia dal dorso dei topi per consentire una chiara area di osservazione. Come secondo passo.

L'MRSA in sospensione verrà somministrato ai topi per via sottocutanea tre giorni dopo l'infezione, le patologie infettive e la conta batterica possono essere valutate determinando il numero di unità formanti colonie da omogeneizzati tissutali su piastre di agar. Ciao come stai? Mi chiamo De Lordon.

Sono un post ricercatore. Ciao, mi chiamo Mariel Sanchez. Sono una dottoranda e sono Andrea Huda.

Sono un ricercatore associato, facciamo parte del laboratorio di George Lee nel reparto pediatrico del Cedar-Sinai Medical Center. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo medico, come la modellazione di infezioni gravi, tra cui miosite, polimiosite e fascite necrotizzante. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle gravi infezioni di emergenza, può essere applicato anche ad altri sistemi come lo streptococco di gruppo A e altri organismi.

Inoltre, possiamo studiare la funzione e la patogenesi di altri organismi che causano miosite e polimiosite. In generale, le persone nuove a questa procedura possono avere difficoltà perché uno dei membri del personale dell'autorità di regolamentazione globale delle aree caucus è altamente mutevole. Se non si prende precauzione, i dati raccolti possono avere variazioni significative che si tradurranno in difficoltà di interpretazione dei dati.

Iniziamo. In una struttura BSL two, preparare una piastra di agar di sangue di pecora in base TSA e un loop sterile utilizzando un blocco congelato. Trasferisci la coltura Mercer di serie da un deposito a meno 80 gradi Celsius.

Quindi, utilizzando l'ansa sterile, rompere un piccolo frammento di ghiaccio dalla coltura madre sulla piastra. Dopo aver acquisito un piccolo chip di coltura stock Mercer, trasferire immediatamente la coltura stock nel congelatore per evitare lo scongelamento perché il congelamento e lo scongelamento ripetuti danneggeranno la coltura stock. Usa l'anello per striare l'agar, facilitando la crescita delle singole colonie di Mercer.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una notte senza supplemento di CO2. Il giorno dopo. Prepara ed etichetta sia un nuovo uovo di sangue, una piastra TSA e una provetta da 15 millilitri con tappo a scatto con tre millilitri di THB.

Recuperare la piastra M SSA coltivata durante la notte ed esaminare il fenotipo emolitico delle colonie. Utilizzando un ansa sterile, scegli una colonia che abbia un fenotipo coerente con le precedenti colonie sperimentali. Inoculare il THB con la colonia selezionata utilizzando la stessa striscia ad anello.

La piastra incuba la soluzione THB a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 220 rotazioni al minuto. Questi batteri verranno utilizzati per inoculare la coltura per l'infezione sottocutanea dei topi nelle fasi successive. Posizionare anche la piastra di agar sanguigno nell'incubatrice.

La piastra verrà utilizzata la mattina seguente per confermare che il fenotipo emolitico dei batteri nella soluzione di THB corrisponda a quello della colonia originariamente selezionata. Se il fenotipo dell'emolisi non è coerente con il clone originale, non iniziare l'esperimento. Trasferisci il mouse su una piattaforma e rasa la pelliccia dalla schiena.

Se l'animale è eccessivamente aggressivo, può essere necessaria una sedazione con fluoro. Applicare circa cinque millimetri cubi di crema depilatoria come NA sulla zona rasata. NA può essere acquistato presso la farmacia locale.

Assicurati di acquistare la crema depilatoria contenente olio per bambini perché il prodotto senza l'olio per bambini sarà troppo stimolante per i topi. Lasciare incubare la crema sulla superficie della pelle per circa un minuto mentre la crema depilatoria è in incubazione, bagnare alcuni tovaglioli di carta con acqua distillata doppia dopo un minuto. Usa i tovaglioli di carta bagnati per pulire l'area rasata.

Assicurati che la pelle sia libera dalla crema depilatoria, preriscalda 10 millilitri di THB in un tubo da 50 millilitri con tappo a vite a 37 gradi Celsius in un incubatore di batteri per quattro-10 ore. Trasferire 20 microlitri di coltura batterica durante la notte nel THB di preriscaldamento. Questo diluirà il mercenario notturno.

Una sospensione a uno a 500. Posizionare la provetta a 37 gradi Celsius in un'incubatrice agitata a 220 rotazioni al minuto per circa due ore e mezza o tre ore dopo il periodo di incubazione. Utilizzare più THB per diluire ulteriormente la sospensione batterica da uno a 10 e misurare la sospensione con uno spettrofotometro.

Con assorbenza a 514 nanometri. Continuare a incubare nuovamente la sospensione a 37 gradi Celsius agitando a 220 rotazioni al minuto fino a quando la sospensione diluita da uno a 10 raggiunge 0,25. Per raccogliere la centrifuga Mör, il tubo da 50 millilitri a 3,225 volte la gravità per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il resus supinato.

Sospendi la tavolozza batterica in 10 millilitri di DPBS e lava nuovamente i batteri ripetendo la fase di centrifugazione per questo modello di infezione grave. Risospendere il pellet batterico in circa un millilitro di DPBS ottenendo circa una volta 10 per 10 unità formanti colonie per millilitro. Assemblare le piastre A-R-T-S-A di sangue di pecora diluire in serie i batteri da 10 a 1 a 10 a otto volte in piastra DPBS.

10 gocce da microlitro della sospensione batterica diluita in serie su una piastra di agar sanguigno in triplice copia. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver incubato le piastre per 16-18 ore, osservare e registrare il fenotipo di emolisi dell'inoculare.

Conta le unità formanti colonie sulle piastre. L'inoculare dell'infezione sarà calcolato in base all'unità formante la colonia. Numero sulle targhe.

Preparare una siringa con 100 microlitri di sospensione batterica in DPBS preparata in precedenza. Prima dell'iniezione, i topi devono essere sedati in modo che la loro frequenza respiratoria sia di circa una volta al secondo. A scopo dimostrativo, in questo video viene mostrato un topo soppresso.

Iniettare l'M ser in un fianco dopo l'iniezione. Trasferisci il mouse nella sua gabbia. Osservare gli animali per tre-cinque ore dopo l'iniezione per assicurarsi che il topo sia vivo prima di trasferirlo nuovamente nella stanza degli animali.

Monitorare quotidianamente le lesioni sul dorso degli animali dopo che gli animali sono stati sacrificati. Misurare e registrare le dimensioni e le condizioni delle lesioni sulla pelle. Sia le aree della lesione cutanea che quelle muscolari vengono quantificate moltiplicando la lunghezza e la larghezza della lesione in millimetri.

Le lesioni di forma irregolare devono essere scomposte in pezzi simmetrici più piccoli e ogni pezzo deve essere misurato con lo stesso metodo. Preparare provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri con 100 microlitri di DPBS per la raccolta dei tessuti. Intacca la pelle con una lama di rasoio sterile e asporta la lesione con un paio di forbici sterili.

Quando si asporta la lesione, assicurarsi che vengano asportati anche circa 2-5 millimetri di pelle sana che circonda l'area. Posizionare la lesione nelle provette di raccolta dei tessuti per analizzare le lesioni muscolari. Staccare accuratamente la pelle per misurare le dimensioni e registrare lo stato della lesione sul tessuto muscolare.

Raccogli la milza e i reni. Posizionare questi tessuti nelle proprie provette di raccolta individuali. Omogeneizzare i tessuti agitando con una siringa da un millilitro per circa 30 secondi.

Aggiungere 900 microlitri di DPBS a ciascun tubo. Assemblare le piastre THA agitare i campioni di tessuto omogeneizzati per cinque minuti. Diluire in serie il campione.

Le sospensioni tendono da uno a 10 a sei volte. In 96, le piastre a pozzetti erogano 10 microlitri di ciascuna sospensione diluita in serie sulle piastre. Incubare le piastre in un incubatore di batteri a 37 gradi Celsius durante la notte.

La mattina successiva, contare le unità formanti colonie dalle piastre e calcolare il numero di unità formanti colonie in base ai fattori di diluizione. Se l'infezione viene eseguita correttamente, si osserverà una bolla sulla superficie della pelle immediatamente dopo l'iniezione sottocutanea. Se non si osservano bolle, l'iniezione potrebbe essere troppo profonda, il che potrebbe influire sull'esito dell'infezione.

Le dimensioni della lesione e la sopravvivenza batterica possono essere valutate in vari momenti dopo l'infezione da MSA. Le seguenti lesioni cutanee sono state esaminate il terzo giorno dopo l'infezione e sono esempi di una lesione su un topo CD infettato su un fianco con una volta 10 alle sette unità formanti la colonia. Le lesioni muscolari si trovano tipicamente nel tessuto sottostante le lesioni cutanee.

Di seguito sono riportati esempi delle lesioni della superficie muscolare coincidenti per le foto delle lesioni cutanee mostrate in precedenza. Si tratta di lesioni muscolari osservate al terzo giorno dopo l'infezione in un topo infettato con una volta 10 alle sette unità formanti colonie. L'area della lesione è determinata come la lunghezza moltiplicata per la larghezza della lesione misurata in millimetri e può essere misurata per valutare il danno tissutale della pelle.

Il numero di unità formanti la colonia dei batteri localizzati nel sito di infezione può essere quantificato sulle lesioni soggette ad accisa. Il numero di unità formanti colonie può indicare se un fattore di virulenza fornisce all'MSA un vantaggio di sopravvivenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le precauzioni di sicurezza standard dovute all'uso di aghi e microbi altamente patogeni A seguito di questa procedura.

Infine, poiché il modello di ascesso che utilizziamo è 1.000 volte più basso dell'inoculare rispetto al nostro modello, può essere utilizzato per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono i fattori S che promuovono l'infezione persistente da RSA? Non dimenticare che lavorare con una siringa riempita con un Mars A può essere estremamente pericoloso e precauzioni come gettare la siringa direttamente nell'affilato, è importante evitare di pugnalare accidentalmente l'ago. Inoltre, per questo esperimento, è importante seguire i protocolli standard BS O2 per garantire una corretta disinfezione dell'area di lavoro.

Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione. Ciao, ciao.