Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

Ciao, sono Alex Hoge. Lavoro nel laboratorio di Hall presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò come trasformare *E. coli* elettrocompetenti mediante il metodo dell'elettroporazione.

Oggi sto utilizzando questa tecnica per trasformare un coli con il mio prodotto di clonazione perché sto eseguendo una prova per effettuare una localizzazione su preparati interi nel pesce zebra. Ok, quindi inizieremo a fare la trasformazione. Per prima cosa, è necessario avere il bagno d'acqua o il blocco termico a 42 gradi.

È necessario mantenere in ghiaccio i batteri appena prelevati dalla coltura principale. Oggi utilizziamo cellule competenti elettricamente provenienti da ities e anche il tuo DNA in ghiaccio. Inoltre, è necessario disporre di un tubo di mezzo SOC a temperatura ambiente o a 37 °C e delle piastre con mezzo LB più antibiotico.

Ora aggiungerò il DNA insieme ai batteri. Lavoro vicino alla fiamma per evitare di contaminare i batteri. Aggiungo quindi il DNA ai batteri.

Sono 50 microlitri di batteri, che vanno immediatamente rimessi sul ghiaccio; si può scuotere leggermente il tubo per mescolare i batteri con il DNA, quindi si lascia in ghiaccio fino a 15 minuti. Trascorsi questi 15 minuti, si procede con lo shock termico, ovvero si espongono i batteri a 42 gradi per 45 secondi. Prelevo quindi i tubi dal ghiaccio e li pongo direttamente nel blocco preriscaldato a 42 gradi, avvio il timer per 45 secondi, dopodiché li rimetto subito sul ghiaccio, passandoli rapidamente dal bagno a 42 gradi direttamente sul ghiaccio.

E poi aspettiamo per due minuti. Ora aggiungerò il mezzo SOC ai batteri e li metterò a 37 per 30 minuti. Prelevo quindi 500 microlitri del mezzo SOC e li aggiungo ai batteri, quindi li inserisco nella mia piccola camera artigianale.

Quindi, se si utilizzano provette eend e una camera improvvisata per l'incubatore, assicurarsi di posizionare le provette eend in orizzontale perché in questo modo verranno agitate molto meglio. Ora siamo pronti per inserire le provette nell'agitatore. Questo perché dobbiamo mantenere la piccola camera a 37 gradi per 30 minuti.

Ora abbiamo terminato l'incubazione a 37 gradi e procederemo a piastrare i batteri su lb più antibiotici. Nel mio caso si tratta di cloranfenicolo. Quindi, prelevo 50 microlitri di ogni campione e li pongo sulla piastra.

Quindi, con i restanti 500 microlitri, si centrifugano in una piccola centrifuga da banco, in modo da eliminare il liquido e raccogliere i batteri. Dopo la centrifugazione otteniamo un bel pellet e quello che faremo ora è rimuovere quasi tutto il mezzo SOC, lasciandone soltanto 50 microlitri, per poi seminare questi 50 microlitri di batteri concentrati. Quindi ne ho eliminati circa 450 microlitri.

Lascio solo questa quantità. Ora procederò a sospendere il pallet nel volume residuo di 50 microlitri di terreno SOC. Successivamente, posso seminare questi 50 microlitri su un'altra piastra.

Quindi resisto a ciascun pallet, poi lo manipolo e lo piastricco. Alla fine avremo due piastre per campione. Ora dobbiamo distribuire i batteri sulla piastra LB.

Quindi userò alcune perle di vetro per autoclave, ma si può anche utilizzare un pezzo di pipetta modellato a forma di spalmatore come questo. Metterò alcune perle nella piastra di Petri. Mi piace così.

Bene, 10 15. Dopo aver aggiunto le perle, posizionate tutte le piastre in una pila come questa e agitatele delicatamente in modo che le perle distribuiscano uniformemente i batteri su tutta la superficie delle piastre. Quindi, mentre muovo le piastre, le lascio asciugare.

Questo significa che non dovresti vedere ampie striature di liquido quando muovi le perline. Ad esempio, in quella piastra, le perline tendono ad aggregarsi e si notano molte striature. È troppo umida; quando le perline si muovono liberamente, quella è secca.

Ora le piastre sono asciutte, quindi possiamo eliminare le perle. Quindi eseguo semplicemente l'aspirazione in questo modo, in modo da poterle riciclare. Ora metteremo la piastra nell'incubatrice a 37 °C per tutta la notte e posizioneremo le piastre capovolte. Dopo 12 ore di incubazione a 37 °C, preleviamo la piastra dall'incubatrice.

E come possiamo vedere, abbiamo meno colonie nella piastra in cui ho seminato 50 microlitri rispetto alla piastra in cui ho seminato il resto. Ciò che è importante quando si trasformano batteri è avere la quantità corretta di colonie sulla piastra, la densità giusta. In questo caso qui si hanno pochissime colonie, ma se si desiderano più colonie, si può fare riferimento all'esempio corretto mostrato in questa piastra, dove la densità è esattamente quella appropriata, circa 100 colonie per piastra.

Questa piastra è un esempio inadeguato perché presenta troppe colonie e non è possibile selezionare colonie singole. Quindi vi ho appena mostrato come trasformare E. coli mediante ciascuna trasformazione. L'aspetto molto importante di questa tecnica consiste nel mantenere tutto rigorosamente freddo sul ghiaccio prima dell'impulso elettrico.

Poi 45 secondi a temperatura normale, ulteriore tempo a 42 gradi, quindi di nuovo sul ghiaccio. Successivamente, tutti gli altri passaggi devono essere eseguiti a temperatura calda o a 37 gradi. Ora procederò alla selezione delle mie colonie mediante screening PCR.

Uno dei punti è quindi quello di avere due piastre. Su una, ci si aspetta un numero elevato di colonie, mentre sull'altra un numero inferiore di colonie. È importante che le piastre siano molto asciutte, utilizzando perle o il pipettaggio passivo.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con la tua conferma.