Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

Ciao, sono Alex Hoge. Lavoro nella palestra Hall Lab del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California Irvine. E oggi vi mostrerò come trasformare gli e coli elettricamente competenti con il metodo di ogni shock.

Quindi oggi sto usando questa tecnica per trasformare un coli con il mio prodotto di lazione perché sto facendo un test per fare un po' di montaggio intero nel pesce zebra. Ok, quindi inizieremo a fare la trasformazione. Quindi, per prima cosa, devi avere il tuo bagno d'acqua o l'autobus a secco a 42 gradi.

Devi avere i tuoi batteri che hai appena portato fuori dalla città principale nel ghiaccio. Oggi utilizziamo cellule di competenza elettrica da ities e anche il tuo DNA nel ghiaccio. Inoltre, è necessario un tubo di terreno SOC a temperatura domestica o 37 e le piastre di LV più terreni antibiotici.

Quindi ora aggiungerò il DNA con i batteri. Quindi lavoro vicino alla fiamma per non contaminare i batteri. Quindi aggiungo la lazione con i batteri.

Sono 50 microlitri di batteri e poi immediatamente di nuovo nel ghiaccio puoi mescolarlo un po' per mescolare i batteri e il tuo DNA e lasciarlo per un massimo di 15 minuti nel ghiaccio. Quindi ora sono passati 15 minuti e siamo pronti per fare lo shock termico, che consiste nel mettere i batteri a 42 gradi per 45 secondi. Quindi tolgo i tubi dal ghiaccio direttamente a 42 gradi impostati, 30 timer 45 secondi, e poi li rimetterò nel ghiaccio molto velocemente e li metterò fuori da 42 direttamente sul ghiaccio.

E poi aspettiamo due minuti. Quindi ora aggiungerò il terreno SOC ai batteri e li metterò a 37 per 30 minuti. Quindi svapo 500 microlitri di media SOC e li metto nei batteri e li metto nella mia piccola camera di fortuna.

Quindi, se hai intenzione di utilizzare tubi di estremità e una camera di fortuna per la tua incubatrice, assicurati di mettere i tubi di estremità orizzontalmente perché tremeranno molto meglio in questo modo. Quindi ora siamo pronti per mettere i tubi nello shaker. Ecco perché abbiamo questa piccola camera a 37 gradi per 30 minuti.

Quindi ora abbiamo terminato l'incubazione a 37 gradi e stiamo per placcare i batteri con antibiotici lb plus. Quindi, nel mio caso, si tratta di cloralio. Quindi a I 50 microlitri di ogni campione e metterlo sul piatto.

Quindi, con i restanti 500 microlitri, li fai girare su un piccolo piano d'appoggio, alcuni si rifiutano per sbucciare i batteri. Quindi, dopo la ificazione, otteniamo un bel pellet e quello che faremo ora è rimuovere quasi tutto il mezzo SOC, basta lasciare 50 microlitri e poi possiamo placcare questi 50 microlitri di batteri concentrati. Quindi pago circa 450 microlitri in più.

Lascio così tanto. Quindi ora sospendo il pallet nei 50 microlitri rimasti del supporto SOC. E dopo posso impiattare questi 50 microlitri su un altro piatto.

Quindi resisto a ogni bancale, poi lo burattino e lo impiatta. Quindi ci saranno alla fine due piastre per campione. Quindi ora dobbiamo diffondere i batteri sulla piastra LB.

Quindi userò delle perle di vetro per autoclave, ma puoi anche usare un tubo oltre che modella in un divaricatore in questo modo. Quindi metterò alcune perline sulla capsula di Petri. Mi piace.

Beh, 10 15. Quindi, dopo aver aggiunto le perline, metti tutti i tuoi piatti in una pila del genere e li scuoti delicatamente per far sì che le perline diffondano i batteri ovunque in modo uniforme sui piatti. Quindi mentre sposto i piatti fino a quando non sono asciutti.

Quindi, il che significa che non dovresti vedere grandi strisce di liquido quando ti muovi con le perline. Ad esempio, in quel piatto, le perline tendono a collassare insieme e a vedere molte striature. È sudore quello, le perline si muovono liberamente, quello è secco.

Quindi ora i piatti sono asciutti in modo da poter scartare le perline. Quindi vado avanti in questo modo in modo che tu possa riciclarli. Quindi ora metteremo la piastra nell'incubatrice a 37 durante la notte, e tu metti le piastre a testa in giù dopo 12 ore di incubazione a 37, tiriamo fuori la piastra dall'incubatrice.

E come possiamo vedere, abbiamo meno colonie nella piastra dove l'ho impiattata 50 microlitri rispetto alla piastra dove ho impiattato il resto. Ciò che è importante quando si trasformano i batteri è avere la giusta quantità di colonie nel piatto, la giusta densità. Quindi in questo posto ci sono pochissime colonie, ma se volete più colonie, potete avere il buon esempio in questa piastra dove è esattamente la giusta densità, circa 100 colonie per piastra.

Questo piatto è un cattivo esempio perché ci sono troppe colonie e non puoi scegliere le singole colonie. Quindi vi ho appena mostrato come trasformare l'e coli ad ogni trasformazione. Quindi l'aspetto molto importante di questa tecnica è mantenere tutto o ghiacciato prima della scossa.

Poi 45 secondi normali, di più a 42 gradi di nuovo nel ghiaccio. E poi tutto il resto deve essere a una temperatura calda o a 37 gradi. Quindi ora ho intenzione di esaminare le mie colonie con lo screening PCR.

Quindi, uno dei punti è anche quello di avere due piatti. Quindi, in primo luogo, ci aspettiamo di avere molte colonie e quelle meno colonie. E l'importante è che i piatti siano molto asciutti con l'uso di perline o della pasta per pipe.

Grazie per l'osservazione e buona fortuna con la tua conferma.