Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dedurre il tropismo virale in un paziente con infezione da HIV sequenziando la regione V tre del gene dell'involucro virale per iniziare a estrarre H-I-V-R-N-A dal plasma sanguigno del paziente. Quindi, amplifica la regione V tre di HIV GP one 20 usando R-T-P-C-R nidificato. Quindi identificare la presenza del prodotto utilizzando l'elettroforesi su gel, seguita dal sequenziamento basato sulla popolazione dei prodotti V tre amplificati.

Infine, analizza le sequenze utilizzando il software di chiamata di base e deduci l'utilizzo del co-recettore utilizzando l'algoritmo da genoma a fenotipo. In definitiva, questi risultati possono mostrare se la truppa virale di un paziente è R cinque o non R cinque attraverso il sequenziamento basato sulla popolazione del ciclo tre dell'HIVV. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che un saggio truppa rispetto ai metodi esistenti come i saggi fenotipici basati su cellule è che può essere eseguito in qualsiasi laboratorio dotato di apparecchiature di sequenziamento per ridurre i costi in meno tempo con meno materiale di partenza.

Questa tecnica è rilevante per il trattamento con la terapia antiretrovirale perché può identificare se è probabile che la popolazione virale di un paziente risponda a un CCR cinque antagonisti Da 500 microlitri di plasma. Usa un semplice estrattore automatico per estrarre H-I-V-R-N-A. Ora passa a una camera bianca PCR per impostare la R-T-P-C-R al fine di garantire un campionamento adeguato della popolazione virale.

Pianificare di eseguire ogni reazione di trascrizione inversa in triplicato in questa reazione in un solo passaggio. Utilizzare l'RNA virale per sintetizzare il CDNA, amplificando in particolare la regione tre dell'HIVV con la riparazione primaria SQV tre F1 e CO 6 0 2. Basato su componenti per reazione.

Preparare una soluzione di miscela madre sufficiente per il numero di campioni da amplificare utilizzando una pipetta a ripetizione Aggiungere 36 microlitri di miscela di campioni in ciascun pozzetto della piastra PCR. Ora passa a una pipetta multicanale per trasformare i microlitri di estratto del campione di RNA in ciascuno dei pozzetti designati. Fai attenzione a cambiare le punte tra ogni aggiunta.

Una volta completato il trasferimento, coprire i pozzetti con tappi per strisce PCR. Quindi posizionare la piastra PCR in un termociclatore programmato per un passaggio R-T-P-C-R della regione tre dell'HIVV. Per la PCR nidificata, utilizzare la riparazione del primer SQV tre F due e CD quattro R.

Calcolare la quantità di reagente necessaria per il numero di campioni da amplificare in una camera bianca PCR. Generare la miscela PCR annidata e quindi utilizzare una pipetta ripetitrice per aliquotare 19 microlitri per pozzetto di una piastra PCR pulita. Al termine dell'R-T-P-C-R, spostarsi in una sala di amplificazione post.

Utilizzare una pipetta multicanale a otto canali per trasferire un microlitro del modello R-T-P-C-R nella miscela PCR nidificata. Cambia le punte tra ogni aggiunta. Coprire i pozzetti con i tappi delle strisce PCR e trasferire la piastra in un termociclatore per l'amplificazione.

Rimuovere la piastra dal termociclatore dopo che la temperatura è tornata a 25 gradi Celsius. Al fine di confermare che la regione V tre è stata amplificata con successo, analizzare prima i prodotti mediante elettroforesi su gel. Prepara un gel AROS all'1,6% con una macchia di gel cyber safe.

Utilizzando una pipetta multicanale da 10 microlitri. Trasferire otto campioni di PCR da microlitri nei rispettivi pozzetti. Carica anche una scala del DNA su almeno un pozzetto per fila.

Far funzionare il gel a circa 100 volt per 10 minuti. Visualizza le bande mediante fluorescenza ultravioletta e documenta l'immagine mediante fotografia. Prendere nota dei campioni in cui tutte le amplificazioni in triplice copia hanno avuto successo.

Se necessario, ripetere R-T-P-C-R per quei campioni con meno di tre amplificazioni del prodotto. I campioni di CDNA virale amplificato vengono ulteriormente verificati mediante reazioni di sequenziamento del DNA che verranno eseguite utilizzando i primer V 3, 0, 2 F e S, QV, tre R, uno. Togliere il reagente big di dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente.

Calcolare e preparare i reagenti necessari per il numero di campioni da analizzare. Aliquotare cinque microlitri di miscela di reazione di sequenziamento nei pozzetti della piastra appropriata utilizzando una pipetta multicanale. Coprite il piatto con una salvietta Kim e mettetelo da parte.

Nel frattempo, preparare una diluizione da una a 15 del prodotto PCR amplificato aggiungendo 180 microlitri di acqua sterile al prodotto PCR rimanente. Pipettare un microlitro del campione diluito sul fondo della piastra appropriata. I pozzetti cambiano sempre le punte tra i campioni quando il trasferimento del campione è completo.

Sigillare la piastra con tappi a strisce e vortice per un secondo. Per centrifugare la piastra, impostare la velocità su 140 5G. Quando la velocità di centrifuga raggiunge 140 5G, interrompere la rotazione.

Posizionare la piastra in un termociclatore affinché la reazione proceda. In ogni pozzetto far precipitare il DNA con quattro microlitri di acetato di sodio a tre molari e 40 microlitri di etanolo refrigerato al 95%, richiudere i tappi. Cortecciare la piastra per 10 secondi e picchiettare la piastra per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Posizionare le piastre a meno 20 gradi Celsius per un tempo compreso tra 30 minuti e due ore. Recuperare il DNA mediante centrifugazione a 2000 G per 20 minuti. Rimuovere e gettare i cappucci delle strisce.

Capovolgere il piatto sopra il contenitore dei rifiuti e travasare il super natin. Sbarazza il super natin rimasto. Tamponando i piatti invertiti su un tovagliolo di carta.

Piega due fogli di carta assorbente per unire il piatto. Posizionare la piastra a faccia in giù nella centrifuga e centrifugare a 140 5G. Fermare la rotazione quando raggiunge i 140 5G.

Quindi lavare con 155 microlitri di etanolo al 95% e decantare. Ripetere quindi la centrifugazione. Lascia riposare il piatto per due o cinque minuti per consentire all'ultimo etanolo di evaporare.

Per denaturare i campioni di DNA, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 10 microlitri di colorante alto per maide in tutti i pozzetti della piastra, compresi quelli vuoti. Sigillare la piastra con una septima e metterla in un termociclatore a 90 gradi Celsius per due minuti. Infine, posizionare la piastra del campione in una piastra di sequenziamento e nel sequenziatore.

Un percorso accettabile per l'analisi dei dati è l'uso del richiamo del software per eseguire la chiamata automatica delle basi senza alcun intervento umano. Recall è un software di chiamata gratuito basato su misura, accedi e seleziona i file di esempio da caricare con l'opzione di navigazione. Individua il file di dati di sequenziamento non elaborati e carica fino a 20 megabyte.

Quindi, imposta la sequenza di riferimento su V tre. Fare clic su Elabora dati. Selezionare la cartella risultante sul lato destro della pagina per visualizzare l'elenco dei campioni.

Quelli che sono rossi hanno fallito. Quelli che sono verdi sono passati. Facendo clic su un campione specifico e sul pulsante di visualizzazione, è possibile rivedere la sequenza, seguire le istruzioni sul lato destro della pagina per navigare attraverso la sequenza, scaricare i file in una cartella zip.

Il tropismo virale può essere dedotto da sequenze generate dal sequenziamento basato sulla popolazione utilizzando l'algoritmo da geno a co-recettore feno. Dal menu a discesa dell'impostazione significativa, selezionare l'ottimizzato in base all'analisi dei dati clinici da motivare 2% e 5,75% FPR. Ora scegli di caricare o incollare una sequenza per l'analisi.

I file FASTA sono accettabili. Non aggiungere altri procedere per ottenere un geno Tono FPRA predittore di reattività ai cinque antagonisti CCR. Il rapporto G due P generato fornisce la sequenza V three loop negli amminoacidi e indica le posizioni rilevanti dalle mutazioni associate al virus non R five che utilizza.

In fondo al rapporto, il tasso di falsi positivi è indicato e interpretato in termini di risposta a un antagonista CCR cinque. Questo rapporto può essere scaricato come file PDF. Se una qualsiasi delle tre sequenze di un campione viene dedotta come non R cinque, è improbabile che il paziente risponda a un antagonista CCR cinque come previsto l'elettroforesi su gel di RTP CR Amplificazioni dell'HIV uno V tre loop indica che non tutti i campioni clinici producono un prodotto.

Le sequenze generate dai campioni amplificati possono essere visualizzate in un cromatogramma letto mediante richiamo. Ci si aspetta una sequenza pulita con poche miscele. Occasionalmente le sequenze possono essere disordinate e non suscettibili di un'assegnazione di base accurata.

Alcuni pazienti possono essere identificati come affetti da virus non CCR 5 che utilizzano il virus, come mostrato qui. È improbabile che questi pazienti rispondano al trattamento con un antagonista CCR 5. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti ha una popolazione virale composta da cinque CCR che utilizzano il virus, come indicato da una casella verde nella parte inferiore del rapporto di analisi G 2P.

Quindi, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro giorni dall'inizio alla fine. Questo va dall'estrazione all'analisi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come prevedere il tropismo virale utilizzando metodi di sequenziamento basati sulla popolazione in combinazione con l'algoritmo bioinformatico del fenotipo del genoma.

Va bene, questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.