Name: Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri come inferire il tropismo dell'HIV-1 mediante sequenziamento della regione V3 con nested RT-PCR e analisi bioinformatica. Questo metodo computazionale classifica il virus come R5 o non-R5 per guidare la terapia antiretrovirale.

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Lo sviluppo di questo test è stato sostenuto dal Viiv Healthcare e il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e attraverso un GlaxoSmithKline / CIHR Sedia in Clinical Virology di Dr. Harrigan. Sostegno fornito da Pfizer e ViiV Healthcare.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan ha conflitti di interesse con ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, e Quest. Questo video-articolo è sponsorizzato da ViiV Healthcare.

Il metodo qui presentato è un metodo di sequenziamento standard applicata ai test tropismo. L&#39;applicazione clinica di loop V3 busta HIV sequenziamento di prevedere tropismo virale è stata limitata fino alla fine. Questo metodo è stato dimostrato, nelle analisi retrospettiva del maraviroc (ViiV Healthcare) le sperimentazioni cliniche, devono essere al minimo ugualmente in grado di prevedere tropismo virale rispetto ad altri test validati nella pratica clinica. Ci sono molti vantaggi per l&#39;esecuzione di analisi genotipica del ciclo V3 per la previsione tropismo. In primo luogo, questa procedura può essere eseguita in qualsiasi struttura con attrezzature sequenza operativa, aumentando notevolmente l&#39;accessibilità e riducendo i tempi di risposta del test tropismo. In confronto, l&#39;analisi fenotipica avanzata Trofile Sensibilità (ESTA) (Monogram Biosciences), che ha servito come il gold standard per i test tropismo, sono effettuati presso un centro nel sud della California. Ulteriori vantaggi includono l&#39;obbligo di meno materiale di partenza e un carico minimo richiesto virale plasmatica di 500copies/mL. Inoltre, i costi operativi di esecuzione del test genotipici sono relativamente bassi in confronto a quelle di un test fenotipici. L&#39;utilizzo del software ricordiamo in particolare elimina la necessità di rivedere la sequenza manuale, che tende ad essere una parte del lavoro intensivo di analisi genotipo. Il metodo qui presentato è abbastanza semplice, che non compensa un altro passo particolare importanza. Facciamo suggeriamo di eseguire PCR e il sequenziamento in triplice copia per aumentare le probabilità di catturare specie di minoranza all&#39;interno della popolazione virale di un campione. Replica superiore a tre può essere eseguita, però abbiamo trovato triplica essere sia efficiente ed affidabile. Suggeriamo inoltre di utilizzare il One-Step della trascrittasi inversa PCR Kit (Qiagen), che esegue sia RT-PCR e PCR nel primo turno la stessa reazione, pur mantenendo alta sensibilità e specificità.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Estrazione di RNA con NucliSens easyMAG versione 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0,6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Lysis Buffer</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG versione 1.0 </td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa biologica di sicurezza di Classe II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PCR in un unico passaggio con trascrittasi inversa e PCR di secondo ciclo&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>Componenti del kit utilizzati:&lt;br/&gt;- Miscela enzimatica SuperScript III RT/Platinum Taq High Fidelity&lt;br/&gt;- Miscela di reazione 2X (un buffer contenente 0,4 mM di ciascun dNTP, 2,4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR System</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>Componenti del kit utilizzati:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. con 15 mM MgCl2 (tappi etichettati 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3,5 U/&amp;#x03BC;l)- Soluzione madre di MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM) (tappi etichettati 4)</td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico del blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Rosso cresolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>grado indicatore</td></tr><tr><td>Termociclatore </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Elettroforesi su gel&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer TAE 50X</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml) </td></tr><tr><td>Colorante SYBR Safe per gel di DNA</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio (ultra puro)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Scala molecolare E-Gel Low Range Quantitative DNA</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado reagente, tipo II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparato per elettroforesi su gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sequenziamento&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25000 reazioni)</td></tr><tr><td>Formammide Hi-Di</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0,5 M, pH=8,0</td></tr><tr><td>Soluzione tampone TRIZMA Cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9,0</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Etilene al 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Running Buffer (10X) con EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polimero Pop-7 (25 mL) oppure Polimero Pop-7 (10 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 oppure cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>Kit standard per sequenziamento 3700/3730 BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga con portapiastrine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di DNA 3730xl</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inferenza genotipica del virus hiv-1 tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Premessa: Prima di ricevere un farmaco da CCR5-antagonista di classe nella terapia anti-HIV, un paziente deve sottoporsi a un test HIV tropismo per confermare che la sua popolazione virale utilizza il corecettore CCR5 per entrare cellulare, e non un corecettore alternativa. Un approccio ai test tropismo è quello di esaminare la sequenza della regione V3 della busta HIV, che interagisce con il corecettore. Metodi: L&#39;RNA virale è estratto dal plasma sanguigno. La regione V3 è amplificata in triplice copia con nidificate trascrittasi inversa-PCR. Le amplificazioni sono poi sequenziato e analizzato utilizzando il software, RE_Call. Le sequenze vengono poi sottoposti ad un algoritmo di bioinformatica come geno2pheno dedurre tropismo virale della regione V3. Sequenze sono considerati come se fossero non-R5 geno2pheno se il loro tasso di falsi positivi è inferiore al 5,75%. Se uno dei tre sequenze da un campione si deduce come non-R5, il paziente è improbabile che per rispondere a un CCR5-antagonista.

Tropismo dell&#39;HIV può essere dedotta dalla regione V3 della busta virale. V3 è amplificato mediante PCR in triplice copia tramite nested RT-PCR, in sequenza, e interpretato utilizzando il software bioinformatico. I campioni con con sequenza di 1 o più (s) con punteggi bassi G2P sono classificati come non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Contesto: Prima di ricevere un farmaco appartenente alla classe degli antagonisti del CCR5 nella terapia per l'HIV, il paziente deve essere sottoposto a un test di tropismo dell'HIV per confermare che il proprio...

L'obiettivo generale di questa procedura è dedurre il tropismo virale in un paziente infettato da HIV mediante il sequenziamento della regione V3 del gene dell'involucro virale, iniziando con l'estrazione dell'RNA dell'HIV dal plasma sanguigno del paziente. Successivamente, amplificare la regione V3 della GP120 dell'HIV mediante PCR nested con trascrizione inversa. Quindi, identificare la presenza del prodotto mediante elettroforesi su gel, seguita da sequenziamento basato su popolazione dei prodotti V3 amplificati.Infine, analizzare le sequenze utilizzando un software di chiamata delle basi e dedurre l'uso del co-recettore mediante l'algoritmo da genoma a fenotipo. In definitiva, questi risultati possono indicare se la popolazione virale di un paziente è R5 o non R5 attraverso il sequenziamento basato su popolazione del loop V3 dell'HIV. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai test su popolazione rispetto alle metodiche esistenti, come i saggi fenotipici basati su cellule, consiste nella possibilità di eseguirlo in qualsiasi laboratorio dotato di apparecchiatura per il sequenziamento, a costi ridotti, in minor tempo e con minor quantitativo di materiale iniziale.Questa tecnica è rilevante per il trattamento con terapia antiretrovirale perché può identificare se la popolazione virale di un paziente è probabile che risponda a un antagonista del CCR5. Da 500 microlitri di plasma, utilizzare un estrattore automatico Easy Mag per estrarre l'RNA del virus dell'immunodeficienza umana (H-I-V-R-N-A). Successivamente, spostarsi in una stanza PCR priva di contaminazioni per allestire la RT-PCR, al fine di garantire un campionamento adeguato della popolazione virale.Prevedere di eseguire ogni reazione di trascrizione inversa in triplice replicato in questa reazione in un unico passaggio. Utilizzare l'RNA virale per sintetizzare il cDNA, amplificando specificamente la regione HIVV tre con SQV tre F1 e CO 6 0 2 prime repair. In base ai componenti per reazione.Preparare una soluzione madre in quantità sufficiente per il numero di campioni da amplificare, utilizzando una pipetta ripetitrice. Aggiungere 36 microlitri di mix campione in ciascun pozzetto della piastra PCR. Passare ora a una pipetta multicanale per trasferire microlitri di estratto del campione di RNA in ciascuno dei pozzetti designati. Prestare attenzione a cambiare i puntali dopo ogni aggiunta.Una volta completato il trasferimento, coprire le pozzette con tappi a striscia per PCR. Quindi posizionare la piastra PCR in un termociclatore programmato per una PCR in un unico passaggio della regione HIVV tre. Per la PCR nested, utilizzare la riparazione dei primer SQV tre F due e CD quattro R.Calcolare la quantità di reagente necessaria per il numero di campioni da amplificare in una stanza pulita per PCR. Preparare la miscela per PCR nested, quindi utilizzare una pipetta ripetitrice per aliquotare 19 microlitri per pozzetto in una piastra PCR pulita. Al termine della R-T-P-C-R, spostarsi in una stanza post-amplificazione.Utilizzare una pipetta multicanale a otto canali per trasferire un microlitro del template di R-T-P-C-R nella miscela di PCR nested. Cambiare le punte dopo ogni aggiunta. Coprire le pozzette con tappi a striscia per PCR e trasferire la piastra in un termociclatore per l'amplificazione.Rimuovere la piastra dal termociclatore dopo che la temperatura è tornata a 25 gradi Celsius. Per verificare che la regione V tre sia stata amplificata con successo, analizzare prima i prodotti mediante elettroforesi su gel. Preparare un gel di AROS al 1,6% con colorante per gel cyber safe.Utilizzando una pipetta multicanale da 10 microlitri, trasferire otto microlitri di campioni PCR nelle rispettive pozzette. Caricare inoltre un DNA ladder in almeno una pozzetta per ogni riga.Eseguire l'elettroforesi a circa 100 volt per 10 minuti. Visualizzare le bande mediante fluorescenza ultravioletta e documentare l'immagine con una fotografia. Registrare i campioni in cui tutte le amplificazioni triplicate sono state eseguite con successo.Se necessario, ripetere la R-T-P-C-R per quei campioni con meno di tre amplificazioni del prodotto. I campioni di cDNA virale amplificati vengono ulteriormente verificati mediante reazioni di sequenziamento del DNA che saranno eseguite utilizzando i primer V 3 0 2 F e S QV tre R uno. Rimuovere il reagente big di dal congelatore e farlo scongelare a temperatura ambiente.Calcolare e preparare i reagenti necessari per il numero di campioni da analizzare. Aliquotare cinque microlitri di mix di reazione per il sequenziamento nei pozzetti appropriati della piastra utilizzando una pipetta multicanale. Coprire la piastra con un fazzoletto di carta Kim e metterla da parte.Nel frattempo, preparare una diluizione 1:15 del prodotto PCR amplificato aggiungendo 180 microlitri di acqua sterile al prodotto PCR rimanente. Pipettare un microlitro del campione diluito sul fondo della piastra appropriata. Cambiare sempre la punta tra un campione e l'altro al termine del trasferimento del campione.Sigillare la piastra con tappi a striscia e vortexare per un secondo. Per centrifugare la piastra, impostare la velocità a 140 5G. Quando la velocità di rotazione raggiunge 140 5G, arrestare la centrifugazione.Posizionare la piastra in un termociclatore per far avvenire la reazione. In ogni pozzetto precipitare il DNA con quattro microlitri di acetato di sodio 3 M e 40 microlitri di etanolo al 95% freddo, quindi richiudere i tappi. Vortexare la piastra per 10 secondi e battere leggermente la piastra per rimuovere eventuali bolle d'aria.Collocare le piastre a meno 20 gradi Celsius per un periodo compreso tra 30 minuti e due ore. Recuperare il DNA mediante centrifugazione a 2000 ×g per 20 minuti. Rimuovere e scartare i tappi a striscia.Rovesciare la piastra sopra il contenitore dei rifiuti e decantare il soprannatante. Rimuovere eventuali residui di soprannatante tamponando le piastre capovolte su un tovagliolo di carta.Piegare due fogli di carta assorbente per inserire la piastra al loro interno. Posizionare la piastra capovolta nella centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 140 5G, fermando la centrifuga quando raggiunge 140 5G.Quindi lavare con 155 microlitri di etanolo al 95% e decantare. Ripetere quindi la centrifugazione. Lasciare riposare la piastra per due-cinque minuti per consentire l'evaporazione di eventuali residui di etanolo.Per denaturare i campioni di DNA, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 10 microlitri di colorante ad alta densità in tutti i pozzetti della piastra, inclusi quelli vuoti. Sigillare la piastra con un settimo e posizionarla in un termociclatore a 90 gradi Celsius per due minuti. Infine, inserire la piastra dei campioni in una piastra per sequenziamento e quindi nel sequenziatore.Un percorso accettabile per l'analisi dei dati consiste nell'utilizzare il software recall per eseguire la chiamata automatica delle basi senza alcun intervento umano. Recall è un software gratuito basato su impostazioni personalizzate: effettuare l'accesso e selezionare i file campione da caricare tramite l'opzione di navigazione. Individuare il file dei dati di sequenziamento grezzi e caricare fino a 20 megabyte.Successivamente, impostare la sequenza di riferimento su V tre. Fare clic su elabora dati. Selezionare la cartella risultante sul lato destro della pagina per visualizzare l'elenco dei campioni.Quelli rossi hanno fallito. Quelli verdi hanno superato il test. Cliccando su un campione specifico e sul pulsante "Visualizza", è possibile esaminare la sequenza, seguire le istruzioni riportate sul lato destro della pagina per navigare all'interno della sequenza e scaricare i file in una cartella compressa zip.Il tropismo virale può essere dedotto dalle sequenze generate mediante sequenziamento basato su popolazione, utilizzando l'algoritmo genotipo-fenotipo per il co-recettore. Dal menu a discesa dell'impostazione significativa, selezionare l'opzione ottimizzata in base all'analisi dei dati clinici provenienti da motivate al 2% e 5,75% FPR. Scegliere ora di caricare o incollare una sequenza per l'analisi.Sono accettabili file FASTA. Non aggiungere altri passaggi per ottenere un predittore genotipico FPRA della risposta agli antagonisti del CCR5. Il rapporto G2P generato fornisce la sequenza del loop V3 in amminoacidi e indica le posizioni rilevanti delle mutazioni associate a virus non R5.In fondo al rapporto, viene indicato il tasso di falsi positivi e interpretato in termini di risposta a un antagonista del CCR5. Questo rapporto può essere scaricato come file PDF. Se una qualsiasi delle tre sequenze di un campione viene classificata come non R5, è improbabile che il paziente risponda a un antagonista del CCR5, come previsto. L'elettroforesi su gel degli amplificati RTP CR del loop V3 dell'HIV-1 indica che non tutti i campioni clinici producono un prodotto.Le sequenze generate dai campioni amplificati possono essere visualizzate in un cromatogramma letto mediante richiamo. Ci si aspetta una sequenza pulita con poche sovrapposizioni. Occasionalmente, le sequenze possono risultare confuse e non adatte a un'assegnazione accurata delle basi.Alcuni pazienti possono essere identificati come portatori di virus che non utilizzano CCR5, come mostrato qui. Questi pazienti probabilmente non risponderanno al trattamento con un antagonista di CCR5. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti presenta una popolazione virale composta da virus che utilizzano CCR5, come indicato da un riquadro verde nella parte inferiore del rapporto di analisi G2P.Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro giorni, dall'inizio alla fine, ovvero dall'estrazione all'analisi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come prevedere il tropismo virale utilizzando metodi di sequenziamento basati sulle popolazioni in combinazione con l'algoritmo bioinformatico genome pheno.Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Full-Length individuo proviral sequenziamento (Flip) fornisce un metodo efficiente e ad alta produttività per l'amplificazione e sequenziamento del singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1 (intatto e difettoso) e permette per la determinazione del loro potenziale replica-competenza. Salti mortali supera i limiti delle precedenti analisi progettate per sequenziare il serbatoio latente di HIV-1.

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

Qui presentiamo un metodo di sequenziamento profondo che fornisce una determinazione obiettiva della nascente 3'-termini nonché profili mutational di molecole di DNA single-stranded. L'applicazione principale è la caratterizzazione del nascente retrovirali DNAs complementare (cDNA), gli intermedi generati durante il processo di trascrizione inversa retrovirale.

Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

Scopri come inferire il tropismo dell'HIV-1 mediante sequenziamento della regione V3 con nested RT-PCR e analisi bioinformatica. Questo metodo computazionale classifica il virus come R5 o non-R5 per guidare la terapia antiretrovirale.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

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