Name: Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri l'amministrazione passiva di anticorpi monoclonali contro Histoplasma capsulatum in topi C57BL/6. Questo metodo permette di studiare l'efficacia protettiva dell'immunità umorale nelle infezioni fungine.

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1. La crescita di H. Capsulatum <ol><li> Preparare un armadio di biosicurezza per lavorare con il fungo pulendo l'armadio con candeggina al 10% seguiti da 20 min irradiazione UV. H. capsulatum in fase di lievito richiede biosicurezza livello (BSL) pratiche II, mentre la forma dello stampo richiede BSLIII. Utilizza il form lievito nei seguenti passi. </li><li> Avanti preparare un tubo da 15 ml con 5 ml di PBS. Raccolta una colonia di H. capsulatum (ceppo ATCC Hc G217B) da una piastra di agar sangue BHI [glucosio 10 g / L, cisteina 0,1 g / L, penicillina-streptomicina 1% e pecore globuli rossi 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] coltivati ​​a 37 ° C o prelevare un 'aliquota da stock lievito congelato a -80 ° C e aggiungere al PBS. Vortex le cellule vigorosamente e centrifugare per 1100 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet e aggiungere 10 ml di PBS fresco. Ripetete questa procedura per tre volte. Sospendere le cellule in 5 ml di PBS e il trasferimento in una provetta da 50 ml. </li><li> Per distruggere le cellule aggregate, passare la sospensione di cellule di lievito con un 26 G1 / 2 ago u cantare una siringa da 10 ml 5 volte in un armadio biosicurezza (con protezione del viso). Per isolare piccoli, lievito uniformemente dimensioni, centrifugare le cellule a 55 g per 1 minuto a temperatura ambiente e quindi rimuovere la parte superiore da 1 ml. </li><li> Aggiungere la sospensione cellulare ad una beuta sterile contenente 100 ml di terreno HAM F12 (GIBCO) integrata con 16 g / L di glucosio, 1g / L di acido glutammico, 8.4mg / L cistina, 6 g / L acido glutammico e poi crescere le cellule a 37 ° C per 48 ore in un incubatore con agitazione 150rpm. </li></ol> 2. Ibridomi crescita e di purificazione degli anticorpi monoclonali <ol><li> Trasferire il ibridomi selezionati e medie DMEM contenente 10% siero fetale bovino, il 10% NCTC, 1% di aminoacidi non essenziali e 1% di penicillina-streptomicina. Crescere le cellule in un pallone di colture cellulari (Becton Dickinson) per 5-7 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Centrifugare il supporto a 1100 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e raccogliere tutte le sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Successivamente, purificare il supernatante libero da cellule usando una proteina A / G di resina FPLC. </li><li> La concentrazione mAb può essere calcolato da una cattura ELISA (1) utilizzando un controllo isotipo IgG di serie (Figura 1B). </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Preparazione dell'inoculo <ol><li> Prendete un h 48 Histoplasma capsulatum (ceppo ATCC Hc G217B) cultura fase lievito coltivato in HAM F-12 di media. </li><li> Centrifugare le cellule a 1100 xg per 10 min. Eliminare il supernatante e aggiungere PBS fresco. </li><li> Ripetere la procedura di 3,2 3 volte. </li><li> Passare la sospensione di cellule di lievito 5 volte attraverso un 26G1 / 2 aghi con una siringa. </li><li> Centrifugare la sospensione a 55 g per 1 minuto a gruppi di cellule pellet residuo. Trasferire il surnatante contenente la sospensione singola cella in una nuova provetta. </li><li> Enumerare la sospensione singola cella utilizzando un hematocytometer. </li><li> Regolare la concentrazione delle cellule al fine di raggiungere 1,25 x 10 7 lievito (sopravvivenza) o 5,0 x 10 6 (CFU, citochine e istologia) in un suspention di &lt;50 microlitri (Figura 2). </li></ol> 4. Somministrazione intraperitoneale del MAbs <ol><li> Sollevare il topo per la coda e la nuca del collo (Fig. 3A). Immobilizzare il mouse per la collottola del collo theears il più vicino possibile (assicurarsi di assumere abbastanza pelle in modo che il mouse cannotturn la testa a mordere la persona che gestisce esso; Figura 3B e 3C). </li><li> Stabilizzare il dito withthe piccola coda leggermente premuto contro il palmo della mano (Fig. 3D). </li><li> Tampone della zona di iniezione con etanolo al 70% prima di inserire l'ago e per aspirare a cercare il sangue prima di iniettare. </li><li> Utilizzare il 26G1 / 2 a piercethe pelle e abdominalmuscles per iniettare la soluzione mAb contenente 500μg (PBS, il controllo degli anticorpi isotipo o il mAb da testare, diluito in 1 ml di PBS) nella sinistra thelower o il basso a destra dell'addome (cavità intraperitoneale), con l'animale nella posizione a testa in giù, avendo cura di evitare gli organi membrana interna andother (Figura 3E). </li><li> Attendere brevemente prima di ritirare il needleto ridurre la probabilità di perdite. </li><li> Attendere almeno due ore prima di procedere alla fase successiva. </li></ol> 5. Topo Anestesia e infezioni intranasale <ol><li> Preparare l'anestesia con ketamina e xilazina a 100 mg / kg e 10 mg / kg, rispettivamente. Eseguire la somministrazione intraperitoneale di PBS, il controllo degli anticorpi isotipo, o anticorpi sperimentali, come descritto nel protocollo di accompagnamento scritto. Attendere due ore dopo l'iniezione mAb prima anestetizzare il mouse e procedere con l'infezione intranasale. Preparare ketamina anestesia utilizzando e xilazina a 100 mg / kg e 10 mg / Kg, rispettivamente (7). </li><li> Durante il periodo di 2 ore di attesa, preparare l'inoculo Histoplasma capsulum come descritto nel protocollo di accompagnamento scritto. </li><li> Procedere secondo il itens 5,1-5,5. Toe pizzicare gli animali con una pinzetta e di verificare l'assenza di riflessi e confermare che l'anestesia ha funzionato. Dopo anestesia, delicatamente sospendere il mouse per i suoi denti davanti ad una stringa di nylon o cotone. Utilizzare 2 stand colonna di legare le corde al fine di sospendere gli animali. </li><li> Lentamente amministrare circa 50 microlitri inoculo in un nare utilizzando una micropipetta, mentre segue con attenzione il tasso di respirazione del mouse. Lasciare che il mouse per riposare in questa posizione per 2-5 minuti dopo l'infezione intranasale per facilitare la deposizione del lievito nei polmoni dell'animale (Figura 3F). </li><li> Dopo il mouse è stato infettato, mantenere il mouse in un monitorata, ambiente caldo (temperatura tra i 25 ei 37 ° C), con cura utilizzando una lampada di calore, se necessario, fino a che non recupera dalla anestesia. Quando la sveglia mouse, tornare a una gabbia pulita con accesso ad libitum a cibo e acqua. Le gabbie vengono restituiti al nostro impianto di animali e tenuti in una stanza pulita animale (BLSI). </li></ol> 6. Studi di sopravvivenza <ol><li> Valutare gli animali infetti e mock-infettate clinicamente per tachipnea, letargia, ottundimento, e perdita di peso. Gli animali devono essere controllate due volte al giorno da parte dei membri di laboratorio e ogni giorno da custodi degli animali. </li><li> Con istoplasmosi murino, fino quasi alla fine della vita, ci sono di solito segni evidenti dell'infezione diverso da un lieve aumento della frequenza respiratoria. Con malattia avanzata, il che avviene di solito da 10-11 giorni, i topi diventano significativamente tachypneic e hanno diminuita attività. Di solito sono rapidamente diventati moribondo e scadenza. </li><li> Gli animali in difficoltà dovrebbero essere opportunamente eutanasia con CO 2 in una camera dedicata, gli animali deceduti devono essere enumerati tutti i giorni. </li></ol> 7. CFU Studi, Istologia e citochine Studi <ol><li> Preparare provette da 15 ml con 10 ml PBS per ogni organo da raccogliere. </li><li> Eutanasia degli animali 7 e 14 giorni dopo l'infezione con un inuculum subletale (5,0 x 10 6) come precedentemente indicato e rimuovere la, milza polmoni e fegato immediatamente. </li><li> Rimuovere un pezzo di organo da valutare ed effettuare la fissazione in formalina durante la notte. Le sezioni saranno esaminate al microscopio per la valutazione patologica. </li><li> Preparare 50 ml provette coniche con 5 ml di PBS superato con 70 filtri cellule micron per ogni organo deve essere omogeneizzato. Macerare ogni restante parte degli organi separatamente nel 50 ml provette sterili con pistoni siringa 5 ml. </li><li> Poi, in serie diluire omogenati d'organo (1:100, 1:1000 e 1:5000) e 100μL piatto di ogni diluizione in BHI piastre di agar-sangue (2). </li><li> Aggiungi compresse inibitore della proteasi per il omogenati in base alle istruzioni del produttore (Roche, Germania). </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per un massimo di 14 giorni e CFU enumerare. </li><li> Centrifugare omogenati d'organo a 4000xg per 10 minuti e rimuovere surnatanti organo, whish saranno utilizzati utilizzati nel test citochine effettuate secondo metodi standard secondo il produttore. </li></ol> 8. Anticorpo monoclonale di protezione contro H. Capsulatum dipende dalla specificità anticorpale e Isotipo <ol><li> MAb isotipo è fondamentale per la protezione contro H. capsulatum, come topi trattati con anticorpi monoclonali IgG1 o IgG2a di Hsp60 ha prolungato significativamente la sopravvivenza rispetto ai topi di controllo ricevere un mAb IgG2b di Hsp60 o sia un isotipo di controllo mAb o PBS (Figura 4). </li><li> Inoltre, in topi che avevano ricevuto anticorpi monoclonali di protezione, c'è stata una riduzione significativa del numero di CFU polmonare e splenica al 7 ° giorno e diminuisce di 2 e 2,5 unità log di numeri lievito nei polmoni al giorno 14 (Figura 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Crescita di H. capsulatum e ibridomi. (A) HAM liquido preparazione F-12 la cultura da una singola colonia ottenuta da H. capsulatum coltivate su un BHI piastre di agar-sangue. (B) la crescita degli ibridomi in fiasche di coltura cellulare e purificazione mAb da proteina A / G cromatografia di affinità con resina. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: H. capsulatum preparazione inoculo di infezione intranasale. Sospensione di cellule ottenute dopo H. capsulatum interruzione aggregati da siringa e centrifugazione viene enumerato contando, in un emocitometro. La concentrazione delle cellule è regolata a 1,25 x 10 7 (esperimenti di sopravvivenza) o 5 x 10 6 (CFU, citochine e istologia) a &lt;50 microlitri. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/&gt; Figura 3: la gestione del mouse durante mAb amministrazione. (A) Il mouse è preso per la coda e (B e C) immobilizzato tenendo la nuca del suo collo il più vicino possibile theears. (D) La coda è tenuta tra il mignolo e il palmo. (E) La soluzione mAb viene iniettato tramite un 26G1 / 2 ago. (F) Il H. capsulatum inoculo è somministrato per via intranasale pipettando gentilmente la sospensione cellulare in un Nare. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: MAbs di Hsp60 possono alterare la patogenesi di istoplasmosi. iniezioni ip con 500 mcg di IgG1, o IgG2a mAbs 2 ore prima di infezione prolungato significativamente la sopravvivenza (p &lt;0,05, rispetto ai controlli), ma un IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: CFU determinazioni nei polmoni a 7 e 14 giorni dopo una sfida subletale intranasale con 5x10 6 lieviti Hc ip di topi trattati con anticorpi monoclonali selezionati per Hsp60 o irrilevanti mAb ha mostrato una riduzione degli oneri fungine per IgG1 e IgG2a animali trattati con anticorpi monoclonali. Barre nere rappresentano CFU al giorno 7 e barre bianche 14 giorni dopo l'infezione (* p &lt;0,001 a 7 giorni e ** p &lt;0,001 a 14 giorni dall'infezione).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato qui dimostra che mAb di H. capsulatum può modificare il corso di sperimentale istoplasmosi murini. MAbs di antigeni di superficie di patogeni possono modificare le complesse dinamiche che si verificano durante l&#39;interazione tra un host e un agente patogeno. Questo studio stabilisce che mAbs mediare protezione in un modello murino di istoplasmosi letale quando iniettato per via intraperitoneale, e suggerisce proteine ​​candidate per lo sviluppo del vaccino, come H2B, antigene M (supe...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Azienda </th></tr><tr><td> Cappa di sicurezza biologica (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 di media </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C agitatore </td><td></td></tr><tr><td> Vortice </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml provette coniche </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 aghi </td><td> BD </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 mL fiaschi </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast cromatografia liquida proteina) del sistema </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Lettore ELISA </td><td> Biotek </td></tr><tr><td> Anestesia (ketamina e xilazina) </td><td></td></tr><tr><td> Colonna sta </td><td></td></tr><tr><td> Nylon string </td><td></td></tr><tr><td> Calore lampada </td><td></td></tr><tr><td> Filtri cellule 70μm </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> BHI piastre di agar </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro h. capsulatum e altri patogeni fungini

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Lo scopo l&#39;uso di questa metodologia è 1) per avanzare la nostra capacità di proteggere le persone con anticorpi o vaccini per prevenire o curare l&#39;istoplasmosi causata dal fungo Histoplasma capsulatum e 2) per esaminare il ruolo dei fattori di virulenza come bersaglio per la terapia. Per generare anticorpi monoclonali, i topi sono immunizzati, le risposte immunitarie sono valutati mediante un solido sistema di fase ELISA sviluppato nel nostro laboratorio, e la migliore topi risponditore vengono selezionati per l&#39;isolamento di splenociti per la fusione con cellule ibridomi. Topi C57BL / 6 sono stati ampiamente utilizzati per studiare H. patogenesi capsulatum e fornire il miglior modello per ottenere i dati richiesti. Al fine di valutare il ruolo del mAbs in infezione, i topi sono intraperitoneale somministrato sia con mAb a H. capsulatum o isotipo controllo di pari mAb e poi infettato da entrambi per via endovenosa (ev), intraperitoneale (ip), o intranasale (in) percorsi. Nella letteratura scientifica, l&#39;efficacia di anticorpi monoclonali per le infezioni fungine nei topi si basa sulla mortalità come un punto finale, in collaborazione con le unità Formin colonia (CFU) valutazioni in momenti precedenti. Sopravvivenza (tempo al decesso) studi sono necessari in quanto rappresentano al meglio la malattia umana. Quindi, l&#39;efficacia del nostro intervento non sarebbe adeguatamente essere stabilito senza curve di sopravvivenza. Questo vale anche per stabilire l&#39;efficacia del vaccino o test di mutanti per la virulenza. Con istoplasmosi, i topi vanno spesso ad essere energici per morto diverse ore. La capacità di un intervento, come la somministrazione di un mAb inizialmente può proteggere un animale dalla malattia, ma la malattia può ricaduta che non potrebbero essere realizzati in breve esperimenti CFU. Oltre a saggi di sopravvivenza e carica fungina, esaminiamo la risposta infiammatoria all&#39;infezione (istologia, reclutamento cellulare, le risposte citochine). Per la sopravvivenza / ora per esperimenti di morte, i topi sono infettati e controllati almeno due volte al giorno per i segni di morbilità. Per valutare la carica fungina, istopatologia, e le risposte delle citochine, i topi sono l&#39;eutanasia in vari momenti dopo l&#39;infezione. Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti secondo le linee guida dell&#39;Istituto per gli studi sugli animali dell&#39;Albert Einstein College of Medicine.

Topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per studiare la patogenesi Hc e fornire il modello migliore. Stiamo esplorando i potenziali benefici dell&#39;immunità umorale contro questo fungo e ha generato anticorpi monoclonali diversi [di istone H2B e 60kDa Heat Shock Protein] che abbiamo testato per la loro efficacia protettiva dopo la somministrazione intraperitoneale.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

Lo scopo dell'impiego di questa metodologia è 1) far progredire la nostra capacità di proteggere gli individui mediante l'uso di anticorpi o vaccini per la prevenzione o il trattamento di ...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la nostra capacità di proteggere gli individui mediante anticorpi o vaccini per prevenire o trattare l'istoplasmosi, e di esaminare il ruolo dei fattori di virulenza nella patogenesi della malattia. Questo viene raggiunto innanzitutto isolando e caratterizzando anticorpi monoclonali diretti verso antigeni bersaglio. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'amministrare gli anticorpi monoclonali selezionati per via intraperitoneale due ore prima dell'infezione intranasale.Per consentire a queste molecole di distribuirsi in tutto l'organismo, il terzo passaggio della procedura consiste nell'anestetizzare i topi e infettarli per via intranasale con l'inoculo desiderato. L'ultimo passaggio della procedura prevede il monitoraggio dello stato di salute degli animali. Gli animali vengono sacrificati a intervalli diversi per determinare il carico fungino e valutare le risposte infiammatorie oppure vengono seguiti per valutare la sopravvivenza.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un prolungamento della sopravvivenza e una modulazione delle risposte patologiche negli organi colpiti di topi infettati in modo letale. La procedura verrà dimostrata da Ally Emer, una ricercatrice postdottorato con ampia esperienza nella patogenesi fungina e nei modelli di infezione animale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i farmaci antifungini, è che gli anticorpi monoclonali sono molecole con proprietà specifiche che agiscono attraverso il coinvolgimento del fattore potenziale dell'ospite. Una dimostrazione visiva della metodica è fondamentale.L'amministrazione di anticorpi monoclonali e i passaggi relativi all'infezione intranasale sono difficili da apprendere poiché richiedono competenze specifiche nella manipolazione degli animali. Preparare un'area di sicurezza di livello due per lavorare con il fungo in forma di lievito pulendo l'armadio con candeggina, seguito da irradiazione UV. Preparare un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS.Isolare una colonia di H caps AUM da un'aliquote di stock congelata a meno 80 gradi Celsius e aggiungerla al vortice di PBS. Vortexare energicamente le cellule e centrifugare a 1100 ×g per 10 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet e aggiungere almeno 10 millilitri di PBS fresco.Ripetere questa procedura tre volte dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS. Tutti i lavaggi devono essere eseguiti a temperatura ambiente. Per disperdere le cellule aggregate, passare le cellule di lievito attraverso un ago da 26 gauge e mezzo usando una siringa da 10 millilitri per cinque volte, raccogliendo le cellule di lievito in un tubo conico da 50 millilitri.Per isolare lieviti di piccole dimensioni e dimensioni uniformi, centrifugare le cellule a 55 volte G per un minuto, quindi rimuovere il millilitro superiore. Aggiungere la sospensione cellulare in un matraccio erlenmeyer di vetro sterile da 250 millilitri contenente 100 millilitri di mezzo ham, F 12, quindi coltivare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore in un incubatore con agitazione alla concentrazione ambiente di anidride carbonica. Questa coltura verrà utilizzata per preparare l'inoculo e verrà valutata l'efficacia degli anticorpi monoclonali generati nel passaggio successivo.Coltivare gli ibridomi selezionati in DMEM dopo cinque a sette giorni. Dopo l'incubazione, raccogliere gli anticorpi prelevando tutti i mezzi di coltura dalla fiala di coltura cellulare e quindi centrifugare il mezzo a 1100 ×g per 10 minuti. Come per le cellule di lievito, gli anticorpi possono essere lavati a temperatura ambiente.Raccogliere il sopranatante senza disturbare i pellet. Successivamente, purificare il sopranatante acellulare utilizzando una resina proteica AG mediante cattura F-P-L-C-A. L'eli SA viene utilizzata per calcolare la concentrazione dell'anticorpo monoclonale, al fine di determinare la quantità di anticorpo purificato da iniettare.Eseguire la somministrazione intraperitoneale di anticorpo di controllo isotipico PBS o di anticorpo sperimentale come descritto nel protocollo scritto allegato. Attendere due ore dopo l'iniezione dell'anticorpo monoclonale prima di anestetizzare il topo e procedere con l'infezione intranasale durante il periodo di attesa. Preparare l'inoculo di *Histoplasma capsulatum* come descritto nel protocollo scritto allegato e assemblare l'apparato a corda per l'infezione del topo legando saldamente un filo di nylon o di cotone tra due supporti verticali, quindi allontanare i supporti in modo che la corda risulti tesa.L'anestesia con ketamina a 100 milligrammi per chilogrammo e xilazina a 10 milligrammi per chilogrammo. Può essere preparata anche in questo momento, quando gli anticorpi hanno avuto tempo sufficiente per diffondersi. Anestetizzare il topo e confermare la sedazione mediante l'assenza di risposta alla stimolazione delle dita dei piedi.Pinzare con pinzette. Sospendere delicatamente il topo per i denti anteriori al filo. Somministrare lentamente circa 50 microlitri di inocolo nell'aria utilizzando una micropipetta.Mentre si monitora attentamente la frequenza respiratoria del topo, lasciare riposare l'animale in questa posizione per due-cinque minuti dopo l'infezione intranasale, al fine di favorire il deposito del lievito nei polmoni dell'animale una volta infettato. Mantenere il topo in un ambiente caldo sotto controllo, utilizzando con attenzione una lampada riscaldante se necessario, fino al completo risveglio dall'anestesia.Quando il topo si sveglia, riposizionarlo in una gabbia pulita. Con accesso ad libitum a cibo e acqua, valutare clinicamente gli animali infettati e quelli di controllo non infettati. Gli animali devono essere controllati due volte al giorno dai membri del laboratorio e quotidianamente dagli addetti alla cura degli animali per rilevare segni di tachipnea, letargia e perdita di peso.Nel mormo, fino a poco prima della morte, in genere non ci sono segni evidenti dell'infezione, a parte un lieve aumento della frequenza respiratoria. Con la malattia avanzata, i topi diventano significativamente apatici e mostrano ridotta attività. In genere, peggiorano rapidamente e muoiono.Gli animali in stato di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia in modo appropriato con anidride carbonica in una camera dedicata. La morte accertata mediante l'assenza di risposta riflessa alla compressione delle dita dei piedi negli animali deceduti deve essere registrata quotidianamente.Preparare provette coniche da 15 millilitri con 10 millilitri di PBS per ciascun organo da prelevare. Eutanasia gli animali infettati con l'inoculo subletale di cinque volte 10 alla sesta. Le cellule di lievito come mostrato in precedenza e rimuovere immediatamente polmoni, milza e fegato; preparare provette coniche da 50 millilitri con cinque millilitri di PBS.Montare una piastra di Petri con setacci cellulari da 70 micron per ciascun organo da omogeneizzare. Macerare ogni organo separatamente utilizzando stantuffi da cinque millilitri e trasferire in provette da 50 millilitri. Successivamente, diluire in serie l'omogenato degli organi in tre diluizioni: uno a 100, uno a 1001 a 5.000 e piastrare 100 microlitri su BHI.Incubare le piastre ematiche a 37 gradi Celsius in un incubatore con una percentuale normale di anidride carbonica per un massimo di 14 giorni ed enumerare le UFC dell'anticorpo monoclonale. L'isotipo è fondamentale nella protezione contro hcaps Lotum, poiché i topi trattati con anticorpi monoclonali IgG1 o IgG2a specifici per HSP60 mostrano una sopravvivenza significativamente prolungata rispetto ai topi di controllo che ricevono un anticorpo monoclonale IgG2b specifico per HSP60 o un anticorpo monoclonale di controllo isotipico o PS. Inoltre, nei topi che hanno ricevuto anticorpi monoclonali protettivi, si è osservata una riduzione significativa del numero di UFC polmonari e spleniche al giorno sette e una diminuzione di 2 e 2,5 unità logaritmiche del numero di lieviti nei polmoni al giorno 14. Dopo questa procedura, altri metodi, come la determinazione del carico ugal indicativo dell'unità formante colonie, l'analisi delle citochine coinvolte nell'infezione e la valutazione della topologia, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio definendo il meccanismo d'azione della modifica della malattia indotta dagli anticorpi durante il tentativo di questa procedura.È importante ricordare di lavorare in condizioni di sicurezza biologica durante la manipolazione del knock on e di operare secondo le normative per la cura degli animali relative alle infezioni intranasali.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra il punteggio di induzione e clinica di un modello animale di sclerosi multipla: cronico-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale nei ratti DA. La malattia, indotta da immunizzando topi con una emulsione che contiene tutto midollo spinale di ratto e adiuvante completo di Freund, presenta segni clinici simile alla malattia umana.

Induzione e punteggio clinico dell&#39;epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l'uveite micobatterica innescata (PMU) nei topi. Questo metodo delinea i passaggi per aiutare a produrre un'infiammazione oculare affidabile e robusta nel sistema modello murino. Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato occhi uveitici e occhi non infiammati da singoli animali per ulteriori valutazioni con saggi immunologici, trascrittomici e proteomici.

Uveite micobatterica innescata (PMU) come modello per l'uveite post-infettiva

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

I topi sono generalmente resistenti alle infezioni da Mycobacterium abscessus, il che complica la scoperta e lo sviluppo di antibiotici tanto necessari contro le infezioni polmonari. Qui, descriviamo un metodo di preparazione dell'inoculo e dell'infezione intratracheale che ha dimostrato di fornire un'infezione prolungata nei topi immunocompetenti.

Preparazione di Mycobacterium abscessus incluso nella perla di agar per inoculare topi immunocompetenti per via intratracheale

Scopri l'amministrazione passiva di anticorpi monoclonali contro Histoplasma capsulatum in topi C57BL/6. Questo metodo permette di studiare l'efficacia protettiva dell'immunità umorale nelle infezioni fungine.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

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