Name: Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ su monte intero per visualizzare i pattern di espressione genica in embrioni di Danio rerio. Questa tecnica collega biologia molecolare e organismale, offrendo agli studenti un'esperienza pratica integrativa.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dipartimento di Biologia presso la Syracuse University e il Dr. Marilyn Kerr per il loro ruolo nella gestione del corso di Biologia comparata dei Vertebrati. Il laboratorio Albertson è supportato da concedere R21DE019223 dal National Institutes of Health / National Institute of Dental Research e craniofacciale, oltre a concedere R01AG031922 dal National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Trasformazione plasmide di Target cDNA Parte I: Trasformazione di plasmidi (Tempo richiesto: 3 ore più notte di incubazione) <ol><li> SOC caldo brodo di coltura in un bagno d'acqua ° 42 C (500 microlitri per reazione) </li><li> Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio </li><li> Aggiungere 1 ml plasmide a 25 microlitri cellule competenti </li><li> Mettere in ghiaccio per 20 minuti </li><li> Scossa cellule bagno di calore in 42 ° C acqua per 45 secondi </li><li> Immediatamente posto le cellule in ghiaccio per 2 minuti </li><li> Aggiungere 500 ml di 42 ° C brodo di coltura di ogni flaconcino di cellule </li><li> Agitare a 37 ° C per 2 ore a 255 giri al minuto (rpm) </li><li> Tavola 75 mix trasformazione microlitri su Luria Bertani (LB) piastre di agar </li><li> Incubare le piastre invertita a 37 ° C per una notte </li></ol> Parte II: E. coli Cultura (Tempo richiesto: 15 minuti più incubazione overnight) <ol><li> Per ogni reazione, aliquota 3 ml di brodo LB e 3 ml di 50 mg / ml di ampicillina in un tubo di cultura </li><li> Raschiare 1 colonia batteri dalla piastra di agar e aggiungere ad ogni provetta cultura </li><li> Agitare provette di coltura a 37 ° C a 255 giri al minuto durante la notte </li></ol> Parte III: Prep plasmidi (Tempo richiesto: 1,5 ore) <ol><li> Isolare plasmide di culture durante la notte con il 5 Kit Primo Mini FastPlasmid (Catalogo # 2300000) </li><li> Per verificare la presenza del plasmide preparato, eseguire il DNA eluito dal kit su un 1% di Tris-Acetato-EDTA (TAE) gel colorato con bromuro di etidio </li></ol> 2. In Situ DIG marcato Sintesi RNA sonda Parte I: Linearizzazione di plasmidi (Tempo richiesto: 2,5 ore) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparato plasmidi </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Enzima di restrizione * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) Acqua </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare a 37 ° C per 2 ore * Varia con plasmide ** Varia con l'enzima di restrizione </li></ol> Parte II: Trascrizione (Tempo richiesto: 3 ore) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineare plasmidi </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Trascrizione Buffer 10X ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digossigenina Etichetta Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polimerasi * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> RNasi inibitore </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare a 37 ° C per 1 ora </li><li> Aggiungere 2 ml di * polimerasi </li><li> Incubare a 37 ° C per 1 ora </li><li> Aggiungere 2 ml di DNasi </li><li> Incubare a 37 ° C per 20 minuti * Varia con plasmide ** Varia con la polimerasi </li></ol> Parte III: Precipitazioni (Tempo richiesto: 5 minuti più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e risospendere) <ol><li> Aggiungere 4 ml di EDTA 0,2 M </li><li> Aggiungere 5 ml di cloruro di litio 4M </li><li> Aggiungere 150 ml di etanolo freddo ghiaccio al 100% </li><li> Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte </li><li> Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante </li><li> Pellet secco per 7 minuti </li><li> Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC </li><li> Incubare a 37 ° C per 5 minuti </li></ol> Parte IV: Frazionamento - Eseguire solo se la dimensione della sonda è maggiore di 0,6 kb (Tempo richiesto: Varia in base alle dimensioni della sonda, di solito non più di 20 minuti) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA sonda </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Sodio Bicarbonato </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Carbonato di sodio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare in un bagno d'acqua a 60 ° C. Base il tempo di incubazione sull'equazione: Tempo (min.) = (a partire kb - voluta kb) / (0,11 x a partire kb x desiderato kb) Media dimensione desiderata = 0,6 kb </li></ol> Parte V: Precipitazioni finale (Tempo richiesto: 5 minsce più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e ri-sospendere, 1 ora per elettroforesi su gel) <ol><li> Aggiungere 40 microlitri di acqua DEPC </li><li> Aggiungere 8 microlitri di sodio acetato </li><li> Aggiungi 1,04 microlitri di acido acetico glaciale </li><li> Aggiungere 240 microlitri etanolo freddo ghiaccio al 100% </li><li> Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte </li><li> Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante </li><li> Pellet secco per 7 minuti </li><li> Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC </li><li> Vortex per miscelare </li><li> Per verificare la presenza di riboprobe, eseguire il risospese in una soluzione 1% gel colorato TAE con bromuro di etidio </li></ol> 3. Montare tutto ibridazione in situ Parte I: Fissazione di embrioni e di digestione proteinasi K (Tempo richiesto: Fix più 4 ore durante la notte il giorno dopo per la conservazione, 2,5 ore da storage a parte II) <ol><li> Raccogliere in scena embrioni di zebrafish e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C </li><li> Lavare gli embrioni fissato in tampone fosfato contenente 0,1% di Tween-20 (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno </li><li> Per garantire l'esposizione degli embrioni ai reagenti sperimentale, gli embrioni dechorionate manualmente (se necessario) con pinze a punta fine </li><li> Disidratare embrioni con il lavaggio in una serie graduata di 25% e 50% di metanolo in PBST per un'ora ogni lavaggio, quindi memorizzare in 100% di metanolo a -20 ° C </li><li> Quando si è pronti ad utilizzare, reidratare gli embrioni in PBST con il lavaggio a 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST per 10 minuti ciascuno. Infine lavare 2 volte per 10 minuti ciascuno in 100% PBST. Data esatta non è importante per PBST / metanolo lava </li><li> Embrioni candeggina in una soluzione di perossido di idrogeno al 10% in PBST, se necessario, per rimuovere i pigmenti scuri. Gli embrioni devono incubare in una soluzione di perossido di idrogeno per 10-20 minuti, a seconda dell'età dell'embrione, e il tappo della provetta da microcentrifuga deve rimanere aperta per evitare l'accumulo di pressione dell'aria </li><li> Embrioni digerire con 50 mg / ml proteinasi K diluito 1:5000 in PBST per 3-15 minuti, a seconda dell'età degli embrioni </li><li> Ri-fix embrioni in PFA 4% per 30 minuti, e poi lavare 3 volte in PBST per 5 minuti ciascuno </li></ol> Parte II: ibridazione di Riboprobes (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per l'ibridazione, 1,5 ore il giorno successivo alla Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embrioni con la soluzione prehybridization (PHS), in un caldo 70 ° C acqua bagno per 2-3 ore </li><li> Rimuovere PHS, aggiungere 0,5 mL soluzione di ibridazione e di 1,5 microlitri precedentemente sintetizzato riboprobes digossigenina marcato, incubare a 70 ° C durante la notte. La temperatura può oscillare all'interno di pochi gradi a seconda del bersaglio riboprobe </li><li> Il giorno dopo, lavare gli embrioni a 70 ° C in soluzioni graduali di 75%, 50% e 25% PHS di 2X citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) per 10 minuti ciascuno, quindi lavare in SSC 0.2X per 30 minuti a 68 ° C </li><li> Lavare in tampone di acido maleico (MAB) 2 volte per 10 minuti a temperatura ambiente </li></ol> Parte III: Anti-digossigenina (α-DIG) Incubazione Anticorpo (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per bloccare, 2,5 ore il giorno successivo alla Parte IV) <ol start="13"><li> Trasferimento degli embrioni a una piastra 12 pozzetti </li><li> Pre-embrioni in blocco 1-2 mL di soluzione di blocco per almeno 3 ore a temperatura ambiente </li><li> Allo stesso tempo, pre-blocco l'anticorpo preparando un secondo volume di soluzione di saturazione e diluendo il anticorpo anti-digossigenina 1:2000 in questa soluzione </li><li> Rimuovere pre-blocco e aggiungere 1-2 ml di pre-bloccato α-DIG soluzione, incubare una notte a 4 ° C </li><li> Il giorno dopo, lavare gli embrioni in MAB. Lasciare gli embrioni ad incubare in MAB per 5 minuti prima, quindi eseguire modifiche del buffer e incubare per due di 10 minuti, uno di 30 minuti e un intervallo di 60 minuti. Data esatta non è necessaria </li><li> Lavare embrioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in fosfatasi alcalina (AP) tampone </li></ol> Parte IV: La colorazione e trattamento finale (Tempo richiesto: 1 ora a notte per la colorazione, a seconda della riboprobe usato, 4 ore all'inizio della lava glicerolo, 6-10 ore per lavare glicerolo, possono essere conservati in glicerolo) <ol start="19"><li> Aggiungere 1-2 mL di soluzione colorante per gli embrioni, avvolgere la piastra in alluminio, colorazione e controllare a intervalli regolari (ogni 20 minuti circa) fino a colorazione è sufficiente </li><li> Lavare gli embrioni con PBST 2 volte per 5 minuti ciascuno per fermare la reazione di colorazione </li><li> Disidratare embrioni utilizzando 10 lavaggi minuti nel 25% (1 volta) e il 50% (2 volte) metanolo in PBST, poi in 100% di metanolo, per eliminare la colorazione di fondo </li><li> Lasciare embrioni ad incubare in 100% di metanolo per almeno 2 ore a temperatura ambiente </li><li> Reidratare in PBST con 10 lavaggi minuti nel 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST, quindi lavare in 100% PBST 2 volte </li><li> Trasferimento e coloratimbryos ad una soluzione di glicerolo 80% in PBST, utilizzando una serie graduata di lava, e conservare a 4 ° C. </li></ol> Ricette: <ul><li> Piastre di agar-10 LB agar LB g + 250 ml di acqua distillata, autoclave, quando fredde al tatto si aggiungano 250 microlitri ampicillina, versare 15-20 mL di soluzione calda in ogni scatola di Petri, permettono agar per solidificare </li><li> LB brodo-12.5 g brodo LB + 200 ml di acqua distillata, autoclave, lasciare raffreddare prima dell'uso </li><li> 1% TAE-gel 0.4 g di agarosio, 40 ml 1X TAE, 2 bromuro di etidio microlitri; carico 7 microlitri plasmide (plasmidi Trasformazione di Target cDNA) o 3 riboprobe microlitri di acqua e 4 microlitri DEPC (in situ DIG marcato Sintesi RNA Probe) + 1 tintura microlitri di carico, 5 scaletta del DNA microlitri </li><li> Prehybridization soluzione-50% formammide, SSC 5X, 9.2mm acido citrico, 1% Tween-20 </li><li> Ibridazione soluzione prehybridization soluzione più 500 mg / ml tRNA e 50 mg / mL di eparina </li><li> MAB-100mm acido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, il pH a 7,5 </li><li> Blocco Soluzione-3 parti MAB, 1 parte di reagente al 10% Boehringer blocco in MAB, 1 parte di calore disattivato agnello siero </li><li> AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9.5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0.1% Tween-20 </li><li> Soluzione-5-Bromo-4-cloro-3-fosfato indolil colorazione (BCIP) e Nitro blu di tetrazolio (NBT) in tampone AP </li></ul> 4. RAPPRESENTANTE RISULTATI Quando eseguito correttamente, la reazione tra l'NBT, BCIP, e fosfatasi alcalina si formerà un precipitato viola che dovrebbe apparire sul pesce zebra embrione come una macchia viola. Riboprobes deve essere preventivamente sintetizzato da cDNA corrispondente al gene di interesse. Pertanto, si può concludere qualsiasi visualizzati macchia rappresenta le aree del pesce zebra in cui il gene di interesse è stato trascritto in quella fase particolare dello sviluppo. Ai fini di questo corso, sono stati sintetizzati da riboprobes aldh1a2 (precedentemente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.) myod1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (precedentemente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La colorazione era atteso sulla linea mediana e in strutture anatomiche tra cui il somiti, tailbud, myotome, cervello e cuore. Mutanti Ace/fgf8a ci si aspettava di avere difetti di molte di queste strutture. La colorazione era facilmente visualizzati utilizzando un microscopio standard di dissezione. Ulteriori fonti contengono maggiori informazioni e suggerimenti su Wish tecniche simili a quelle descritte qui (Clark, 2003;. Costa D'et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un embrione di zebrafish 24 ore dopo la fecondazione, che è stata ibridata con riboprobes specifici per aldh1a2. Colorazione specifica può essere vista negli occhi, romboencefalo, pinne pettorali gemma primordi, e somiti. Anteriore è al top, posteriore è al fondo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un embrione di zebrafish allo stadio di 13 somiti di sviluppo che è stato ibridato con una sonda specifica per fgf8a. Colorazione specifica è visto nel telencefalo, diencefalo dorsale, mesencefalo-rombencefalo confine, somiti e tailbud. È ventrale a sinistra, dorsale è a destra. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un post 22 ore embrione fecondazione zebrafish che è stato ibridato con una specifica riboprobe per pax2a, un marker utile per la visualizzazione robusto il sistema nervoso. Colorazione specifica può essere visto nella fessura coroide, mesencefalo-rombencefalo confine, vescicola dell'orecchio, e neuroni del midollo spinale. Con vista dorsale anteriore a sinistra.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
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<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Desiderio era utilizzato in un corso di laboratorio di Biologia comparata dei vertebrati per aiutare gli studenti a comprendere il ruolo della genetica nello sviluppo anatomico attraverso la visualizzazione di modelli noti di espressione genica. Per la prima parte del corso, gli studenti eseguito dissezioni sugli organismi che rappresentino più diversi taxa cordati, permettendo loro il tempo per studiare, capire, confrontare e vertebrati anatomia contrasto. Come introduzione alla seconda parte del corso, gli studenti hanno ricevuto una lezione formale che descrive lo sviluppo zebrafish e anatomia. I metodi e risultati attesi dell&#39;esperimento WISH sono stati anche discussi. Gli studenti hanno poi dato zebrafish vivo al somitogenesis e prim-6 fasi di sviluppo, ed a 2 e 5 giorni dopo la fecondazione (DPF) di esaminare al microscopio dissezione. Questo è stato quello di dare agli studenti una migliore comprensione di ciò che embrioni di zebrafish aspetto e le tipologie di cambiamenti morfologici che si verificano con l&#39;ontogenesi. Nella prossima sessione di laboratorio, gli studenti hanno ricevuto embrioni di zebrafish, in cui desiderio era stato precedentemente effettuato. Sono stati invitati a studiare e descrivere i pattern di espressione genica per ogni gene di interesse (riboprobe utilizzato). Gli embrioni utilizzati per DESIDERA sono stati ottenuti da accoppiamenti tra i membri di una linea eterozigoti ace/fgf8a. Sulla base di eredità mendeliana, il 25% degli embrioni da accoppiamenti ace/fgf8a dovevano essere omozigoti mutanti e di esporre i difetti di molte delle strutture anatomiche focalizzato su in questo corso. Sulla base delle relazioni pubblicate e osservazioni non pubblicate in laboratorio Albertson, difetti nel cervello e nel cuore loop improprio ci si aspettava, così come difetti del somiti (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; osservazioni personali). Agli studenti è stato chiesto di esaminare tutti i campioni, wild-type (animali eterozigoti sono indistinguibili da fratelli di tipo selvatico nelle fasi iniziali di sviluppo) e mutanti omozigoti, per ogni pattern di espressione genica presentato. Sono stati poi chiesto di scrivere relazioni di laboratorio che descrivono i loro risultati, e in base alla loro conoscenza dell&#39;anatomia e della genetica, come espressione dei geni difettosi possono avere precipitato malformazioni anatomiche. Studenti sembravano a ricevere questo esercizio di laboratorio con entusiasmo e curiosità. La maggior parte non avevano mai usato prima e DESIDERA erano estremamente interessati a questa parte del corso. Gli studenti trovano i diversi modelli di espressione genica in embrioni di zebrafish intrigante, alcuni addirittura descritto il pattern di colorazione visualizzati associandoli con i ben noti disegni e simboli, come ad esempio una faccina sorridente. Le relazioni di laboratorio risultante ha mostrato gli studenti avevano una comprensione generale del protocollo desiderio e l&#39;espressione dei geni in specifiche strutture anatomiche. Gli studenti sono stati necessari per comprendere le funzioni specifiche dei geni studiati utilizzando WISH durante l&#39;(Stickney et al, 2000 laboratorio;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente però, che alcuni studenti hanno una conoscenza limitata di fondo delle vie di segnalazione e di geni di interesse. Ulteriori informazioni su questi concetti nel desiderio conferenza introduttiva potrebbe essere una gradita aggiunta per l&#39;utilizzo del desiderio in futuro corsi di vertebrati Comparative Biology. Dato che il protocollo richiede generalmente quattro giorni consecutivi, a seconda del calendario del corso, gli studenti possono solo essere in grado di completare una parte dell&#39;esperimento in classe e l&#39;istruttore deve essere responsabile per il resto. Nella nostra classe comparata Biologia dei Vertebrati, studenti hanno completato le reazioni colorazione in laboratorio, mentre l&#39;Assistente didattico effettuato tutti i passaggi precedenti. Se si preferisce avere il WISH studenti svolgono in classe, il protocollo può essere diviso in subunità che può essere eseguito su diverse sessioni di laboratorio, a seconda del lasso di tempo della classe. Se non è possibile per gli studenti a svolgere l&#39;intero protocollo, come è stato qui per l&#39;incontro di laboratorio una volta alla settimana, gli studenti possono aggiungere la soluzione colorante all&#39;inizio di classe e, a seconda del riboprobe usato, hanno la colorazione completa nel giro di un&#39;ora. Il tempo necessario per la macchia di sviluppare varia notevolmente con ogni riboprobe e una varietà di condizioni sperimentali, e devono essere predeterminati prima classe. In particolare, se gli studenti saranno solo sviluppando la macchia in laboratorio, gli istruttori sarà responsabile per tutte le fasi precedenti, che richiederà tempo e risorse al di fuori della classe. Se lo si desidera, un&#39;alternativa più breve di DESIDERA potrebbe essere immunoistochimica, utilizzando etichette di anticorpi per visualizzare la localizzazione delle proteine, tuttavia in questo momento, zebrafish anticorpi specifici per i geni dello sviluppo non sono facilmente disponibili. Un&#39;altra opzione sarebbe quella di eseguire DESIDERA su diverse specie di vertebrati uno° gli studenti hanno confrontare i pattern di espressione degli stessi geni in diversi organismi (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Organismi modello emergente, 2008; organismi modello emergente, 2010). L&#39;obiettivo primario di utilizzare desiderio in un corso di biologia comparata dei vertebrati è stato quello di dimostrare agli studenti come vengono utilizzate tecniche di biologia molecolare per studiare lo sviluppo anatomico. Ha anche fornito l&#39;opportunità per gli studenti di speculare su come modificare l&#39;espressione genica può portare non solo a malformazioni di sviluppo, ma anche di cambiamento evolutivo. Formalizzato come la biologia evoluzionistica dello sviluppo (spesso definito come &quot;evo-devo&quot;), questo campo in rapida crescita di studio mira a collegare genotipo e fenotipo attraverso lo sviluppo, e di chiarire le basi meccanicistiche potenziale di cambiamento evolutivo. Con l&#39;ascesa di questo campo, più ecologi, biologi organismal, e fisiologi stanno adottando tecniche molecolari nella loro ricerca. Ci sostengono che l&#39;uso di desiderio in un corso di Biologia comparata dei Vertebrati contribuirà a mantenere il curriculum aggiornato con gli attuali progressi tecnologici e concettuali nella ricerca, e per facilitare un migliore allineamento orizzontale dei corsi di alto livello, combinando biologia sottocampi biologico. Inoltre, questo approccio integrato offrirà agli studenti l&#39;opportunità di imparare una varietà di tecniche di ricerca biologica in un unico corso, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-centrifuga </li><li> 37 ° C incubatore (con agitatore) </li><li> 4 ° C, micro-centrifuga </li><li> Bagnomaria </li><li> Vortice </li><li> Gel elettroforesi apparato </li><li> Congelatore a -20 ° C </li><li> -80 ° C congelatore </li><li> Rocker / agitatore </li><li> 4 ° C frigorifero </li><li> Microscopio da dissezione (preferibilmente con uno schermo di insegnamento o fotocamera) </li></ul>

utilizzando il monte intero in situ ibridazione a link biologia molecolare e organismal

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Montare tutto ibridazione in situ (WISH) è una tecnica comune nei laboratori di biologia molecolare per studiare l&#39;espressione genica attraverso la localizzazione di trascritti di mRNA specifico all&#39;interno intero campione mount. Questa tecnica (adattato da Albertson e Yelick, 2005) è stato utilizzato in un superiore livello universitario comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati alla Syracuse University. I primi due terzi del Comparative corso di laboratorio di Biologia dei Vertebrati ha dato agli studenti l&#39;opportunità di studiare l&#39;embriologia e anatomia degli organismi diversi che rappresentano diversi taxa cordati principalmente attraverso dissezioni tradizionale e l&#39;uso di modelli. La parte finale del corso ha comportato un approccio innovativo per l&#39;insegnamento dell&#39;anatomia attraverso l&#39;osservazione dello sviluppo dei vertebrati impiegando tecniche molecolari in cui è stata effettuata desiderio su embrioni di zebrafish. Un eterozigote fattore di crescita dei fibroblasti 8 bis (fgf8a) mutante linea, asso, è stato utilizzato. A causa di eredità mendeliana, asso incrociati prodotto wild-type, eterozigote e omozigote mutanti ace/fgf8a in un rapporto 01:02:01. Sonde di RNA con pattern di espressione nota sulla linea mediana e nello sviluppo di strutture anatomiche come il cuore, somiti, tailbud, myotome, e il cervello sono stati utilizzati. DESIDERO è stata effettuata utilizzando pesce zebra alla somite 13 e prim-6 tappe, con gli studenti di eseguire la reazione di colorazione in classe. Lo studio di embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo ha dato agli studenti la capacità di osservare come queste strutture anatomiche cambiata nel corso dell&#39;ontogenesi. Inoltre, alcuni mutanti ace/fgf8a visualizzata looping improprio cuore e difetti di somite e lo sviluppo del cervello. Gli studenti in questo laboratorio di osservare il normale sviluppo dei vari apparati utilizzando sia l&#39;anatomia esterni così come i modelli di espressione genica. Essi hanno inoltre identificato e descritto embrioni visualizzazione improprio sviluppo anatomico e di espressione genica (cioè, i mutanti putativo). Per gli istruttori di istituzioni che non già in possesso delle attrezzature necessarie e dove i fondi per laboratorio e di innovazione curriculare sono limitate, il costo finanziario dei reagenti e gli apparecchi possono essere un fattore da considerare, così come il tempo e lo sforzo necessario da parte del istruttore indipendentemente dall&#39;impostazione. Tuttavia, ci sostengono che l&#39;uso del desiderio in questo tipo di impostazione in aula di laboratorio in grado di fornire un collegamento importante tra la genetica dello sviluppo e anatomia. L&#39;avanzare della tecnologia e la capacità di studiare lo sviluppo organismal a livello molecolare diventa più facile, più economico, e sempre più popolare, molti biologi evoluzionisti, ecologisti, e fisiologi si stanno rivolgendo a strategie di ricerca nel campo della biologia molecolare. Utilizzando DESIDERANO in una comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati è un esempio di come le molecole e anatomia possono convergere all&#39;interno di un singolo corso. Questo dà agli studenti universitari di livello superiore la possibilità di praticare le moderne tecniche di ricerca biologica, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

Intero monte<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (desiderio) è stato utilizzato in un corso di laurea alto livello comparata dei vertebrati Biologia oltre a vertebrati dissezioni. Questo ha dato agli studenti l&#39;opportunità di studiare gli schemi di espressione genica e anatomia, che collega lo studio della biologia molecolare e organismal all&#39;interno di un corso.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

L'ibridazione in situ su campione intero (WISH, Whole mount in situ hybridization) è una tecnica comune nei laboratori di biologia molecolare, utilizzata per studiare l'espressione genica attraverso la localizzazione di...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare i modelli di espressione genica negli embrioni di pesce zebra durante specifici stadi dello sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto ibridando una sonda ribosomica antisenso marcata con digossigenina all'mRNA bersaglio. Il secondo passaggio consiste nel rilevare la sonda ribosomica.Utilizzando un anticorpo per la doxiciclina, l'anticorpo viene coniugato a un enzima fosfatasi alcalina. Il terzo passaggio della procedura è la colorazione mediante l'aggiunta di NBT e BCIP, che reagiscono con l'enzima fosfatasi alcalina producendo un precipitato viola insolubile. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'incubare gli embrioni sufficientemente colorati in metanolo per ridurre la colorazione non specifica.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i modelli di espressione genica in embrioni interi di pesce zebra in specifici stadi di sviluppo utilizzando l'ibridazione in situ su embrioni interi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le tradizionali dimostrazioni in aula di istologia o dissezioni, è che offre agli studenti l'opportunità di costruire collegamenti concettuali tra biologia molecolare e tendenze nello sviluppo e nell'evoluzione degli organismi, fornendo così un'esperienza veramente integrata. Sebbene questi metodi siano stati tradizionalmente utilizzati per studiare lo sviluppo di alcuni organismi modello, possono essere facilmente applicati anche ad altri organismi non modello per comprendere la conservazione dei percorsi di sviluppo attraverso i taxa dei vertebrati, nonché i punti in cui tali percorsi divergono, portando a novità evolutive.Questo metodo potrebbe essere poco familiare agli studenti del biennio, quindi alcuni potrebbero incontrare iniziali difficoltà; tuttavia, l'apprendimento di questa tecnica sarà molto utile durante le esperienze di ricerca universitaria e nei corsi avanzati. Per iniziare la procedura, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire circa 50 embrioni di zebrafish in un tubo microcentrifuga. Rimuovere il liquido in eccesso quindi aggiungere con la pipetta 1,5 millilitri di paraformaldeide al 4% nel tubo.Collocare il tubo con gli embrioni su un agitatore a temperatura ambiente per tutta la notte. La mattina seguente, rimuovere il fissativo e smaltirlo. Aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato contenente lo 0,1% di tween 20 agli embrioni per lavarli.Utilizzare pinzette a punta fine per rivestire manualmente gli embrioni, se necessario, e una pipetta di trasferimento per posizionare gli embrioni rivestiti in un tubo microfuso pulito. Quindi aggiungere con la pipetta 1,5 millilitri di metanolo al 25% e PBST nel tubo. Dopo un'incubazione di un'ora, aspirare la maggior quantità possibile di questa soluzione senza disturbare gli embrioni.Quindi, sostituire con 1,5 millilitri di metanolo al 50% in PBST e incubare per almeno un'ora. Infine, sostituire con 1,5 millilitri di metanolo al 100% e conservare a meno 20 gradi Celsius. Gli embrioni possono essere conservati in metanolo a meno 20 gradi Celsius.Quando si è pronti all'uso, prelevare con una pipetta il metanolo dal tubo e scartare la pipetta. Aggiungere 50% metanolo in PBST nel tubo e incubare per 10 minuti. Ripetere questa operazione, eseguire un secondo lavaggio, quindi aspirare la soluzione e ripetere l'incubazione con metanolo al 25% in PBST.Infine, lavare due volte per 10 minuti ciascuna in PBST al 100% e preparare una soluzione di perossido di idrogeno al 10% in PBST. Immergere gli embrioni di pesce zebra in questa soluzione a temperatura ambiente con il tappo del tubo microfuge aperto per 10-20 minuti, a seconda dell'età dell'embrione. Per rimuovere qualsiasi pigmentazione scura, utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere e scartare la soluzione di perossido di idrogeno.Lavare i campioni in 1,5 millilitri di PBST più volte per arrestare la reazione. Diluire una soluzione madre di proteinasi K a 50 milligrammi per millilitro di PBST da uno a 5.000. Tipicamente, un microlitro di proteinasi K in 4,999 millilitri di PBST.Rimuovere il PBST dagli embrioni. Utilizzando una pipetta di trasferimento, scartare e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione di proteinasi K nel tubo. Immergere gli embrioni nella soluzione di proteinasi K a temperatura ambiente per un periodo compreso tra tre e quindici minuti, a seconda dell'età degli embrioni.Lavare con PBST più volte per arrestare la reazione. Quindi rimuovere il PBST e immergere gli embrioni in formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente per una nuova fissazione, rimuovere la paraformaldeide utilizzando una pipetta trasferibile e scartarla. Aggiungere 1,5 millilitri di PBST agli embrioni e lavare per cinque minuti.Pipettare con attenzione il PBST dal flacone e scartarlo. Ripetere il lavaggio con ulteriori due volumi di PBST. Procedere quindi all'ibridazione della sonda rip, preriscaldare il bagno d'acqua a 70 gradi Celsius e preparare la soluzione di pre-ibridazione.Quindi utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere e scartare il PBST. Immergere gli embrioni in 0,5 millilitri di soluzione di pre-ibridazione e incubare nel bagnomaria a 70 gradi Celsius per due o tre ore, avendo cura di non disturbare gli embrioni.Aspirare la soluzione di pre-ibridazione dal tubo microcentrifuga e scartarla. Aggiungere delicatamente 0,5 millilitri di soluzione di ibridazione nel tubo. Quindi aggiungere rapidamente la doxigina sintetizzata in precedenza nel ribo etichettato.Utilizzare concentrazioni del sonda ribonucleica nel tubo intorno a un microgrammo per millilitro. Incubare a 70 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, preparare soluzioni di PHS al 75%, al 50% e al 25% in due volte salino citrato di sodio, nonché soluzioni di due volte SSC e 0,2 volte SSC.Riscaldare ulteriori soluzioni nel bagnomaria a 70 gradi Celsius. Quando le soluzioni avranno raggiunto i 70 gradi Celsius, prelevarle dal bagnomaria. Quindi aspirare la soluzione di ibridazione dal tubo e scartarla.Aggiungere 0,5 millilitri di ciascuna soluzione P-H-S-S-S-C calda, incubando gli embrioni in ciascuna soluzione per 10 minuti a 70 gradi Celsius. Infine, incubare gli embrioni nella soluzione 0,2 volte SSC a 68 gradi Celsius per 30 minuti. Aspirare la soluzione 0,2 volte SSC dal tubo e scartarla.Incubare gli embrioni in 1,5 millilitri di tampone acido malico a pH 7,5 a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere questa operazione, lavare una seconda volta. Preparare la soluzione di blocco secondo il protocollo scritto.Trasferire gli embrioni in MAB in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Rimuovere l'eccesso di MAB e pipettare da uno a due millilitri di soluzione bloccante in ciascun pozzetto.Incubare bene a temperatura ambiente con agitazione per almeno tre ore. Diluire l'antigene nell'anticorpo uno a 2000 nella soluzione di blocco rimanente. Incubare a temperatura ambiente per almeno tre ore con agitazione delicata.Avendo cura di non disturbare gli embrioni. Aspirare con la pipetta la soluzione di blocco dalle pozzette della piastra e scartarla. Aggiungere delicatamente con la pipetta la soluzione di anti-doxyicina in anticorpo e soluzione di blocco, precedentemente preparata, nelle pozzette e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, lavare gli embrioni con cinque cambi di 1,5 millilitri di tampone acido malico. Lasciare gli embrioni in incubazione nel tampone acido malico per cinque minuti. Inizialmente, eseguire un cambio di tampone e successivamente effettuare altri due cambi di tampone, con incubazioni di dieci minuti ciascuna.Un intervallo di 30 minuti e uno di 60 minuti. Aspirare l'ultimo lavaggio di tampone acido meico dalle pozzette e scartare la pipetta. Aggiungere da 1,5 a due millilitri di tampone fosfatasi alcalina nelle pozzette e incubare per cinque minuti.Ripetere questo processo due volte. Rimuovere il tampone della fosfatasi alcalina e aggiungere da 1,5 a due millilitri di soluzione colorante nei pozzetti. Avvolgere l'intera piastra con pellicola di alluminio per proteggerla dalla luce e agitare delicatamente a intervalli di 20 minuti.Interrompere l'agitazione e osservare gli embrioni al microscopio stereoscopico per verificare se è stata raggiunta una colorazione sufficiente. Una volta che la colorazione appare sufficiente, prelevare con una pipetta la soluzione di colorazione dalle pozzette e scartarla. Sostituirla con PBST per arrestare la reazione di colorazione.Ripetere il processo di lavaggio con un altro volume di PBST, aspirare il PBST dalle pozzette e scartarlo per disidratare gli embrioni. Pipettare da 1,5 a 2 millilitri di metanolo al 25% in PBST nelle pozzette e incubare per 10 minuti. Ripetere il processo due volte con metanolo al 50% in PBST, per ulteriori 10 minuti per ogni lavaggio. Successivamente, trasferire gli embrioni in metanolo al 100% e incubare per almeno due ore per ridurre la colorazione non specifica.Dopo l'incubazione, aspirare il metanolo dai pozzetti ed eliminarlo per reidratare gli embrioni. Lavare due volte con metanolo al 50% in PBST, seguito da metanolo al 25% in PBST per 10 minuti ciascuno. Quindi lavare due volte con PBST al 100% per 10 minuti ogni volta.Infine, trasferire gli embrioni colorati in una soluzione di glicerolo al 80% in PBST mediante una serie progressiva di lavaggi e conservarli a quattro gradi Celsius fino all'osservazione, quando l'operazione viene eseguita correttamente. L'espressione del gene di interesse è indicata dalla comparsa di una colorazione viola sull'embrione di pesce zebra. Questa immagine mostra un embrione di pesce zebra a 24 ore post-fertilizzazione, ibridato con sonde RIBA specifiche per AAL DH one A2; una colorazione specifica è visibile negli occhi, nell'encefalo posteriore, nell'abbozzo della pinna pettorale, nel rene e nei somiti.Questa immagine mostra un embrione di pesce zebra allo stadio di 13 somiti che è stato ibridato con una sonda specifica per FGF eight A. In questo caso, la colorazione specifica è visibile nel tline kelon, nel Dion dorsale, nel kelon mesencefalo, al confine tra metencefalo e mielencefalo, nei somiti e nel bottone caudale. Questa immagine mostra un embrione di pesce zebra a 22 ore post fecondazione che è stato ibridato con la sonda specifica per PAX two A. Un marcatore robusto utile per la visualizzazione del sistema nervoso.Una colorazione specifica può essere osservata nella fessura coroidea, al confine tra mesencefalo e romboencefalo, nella vescicola otica e nei neuroni del midollo spinale, una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica può essere modificata per essere eseguita in diverse sessioni di laboratorio, a seconda del programma del corso. Potrebbe essere richiesto all'insegnante un impegno di tempo e di sforzo al di fuori dell'aula.Dopo aver visto questo video, speriamo che l'idea di introdurre l'ibridazione con montaggio integrale e C due in un laboratorio per studenti universitari vi risulti più familiare. Mentre gli studenti sviluppano queste competenze, la conoscenza di questa tecnica può facilitare il loro passaggio a esperienze di ricerca nei corsi avanzati o nei programmi di dottorato.

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Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Una combinazione di tecniche differenti per massimizzare la raccolta dati dal tessuto del mouse è presentato.

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