Un modo semplice per misurare sensibilità etanolo in Flies

Ciao, sono Thomas Maples del laboratorio del Dottor Adrian Rothen flu del Dipartimento di Psichiatria presso il centro medico UT Southwestern a Dallas. Oggi illustrerò una semplice procedura per determinare la sensibilità delle mosche alla sedazione indotta dall'etanolo. Questo test si basa sulla perdita, nelle mosche, del riflesso posturale e della capacità di camminare dopo l'esposizione all'etanolo.

Questa misura può essere utilizzata per determinare le differenze di sensibilità all'alcol tra diversi ceppi di drosophila e mutanti. Possiamo inoltre utilizzare questo saggio per indurre tolleranza nelle mosche, intendendo con tolleranza una risposta ridotta all'alcol dopo esposizioni ripetute. Cominciamo.

Per questo esperimento, saranno necessarie le seguenti provette. Con otto moscerini della frutta, un campione che è stato raccolto uno o due giorni prima. È possibile effettuare le esposizioni sia con maschi che con femmine.

Tuttavia, ogni provetta dovrebbe contenere un solo sesso. Una provetta vuota che non contiene moscerini, un rasoio, due tappi per provette fatti di un materiale simile al cotone. Se non si dispone di questo tipo di tappi, si possono utilizzare anche palline di cotone, una micropipetta da 1000 microlitri con punte, etanolo al 200 proof contenente colorante alimentare reperibile in qualsiasi negozio di alimentari e un timer.

La prima cosa che dobbiamo fare è creare una camera di esposizione in cui esporremo le mosche all'etanolo e monitoreremo la loro mobilità. Per realizzare questa camera, tagliare innanzitutto un tappo per provetta a metà utilizzando una lametta. Quindi spingere una delle due metà sul fondo di una provetta, coprendo il cibo.

Questo crea una superficie livella e non appiccicosa su cui i moscerini possono camminare. Se si utilizza una pallina di cotone, premere delicatamente per appiattirla e cercare di renderla il più possibile priva di pelucchi, in modo che i moscerini non rimangano intrappolati tra i filamenti di cotone. Se si preparano più camere, assicurarsi che il cibo e il tappo del vial occupino la stessa quantità di spazio in ciascuna camera.

Questo garantisce che le mosche in ogni camera siano esposte all'etanolo in volume uguale. Con un po' di pratica, è facile esporre in parallelo tre provette di mosche. Una volta preparate le camere di esposizione, possiamo ora esporre le mosche all'etanolo.

Trasferire innanzitutto una provetta contenente otto moscerini in una camera di esposizione, sigillando la camera con il tappo della provetta che conteneva inizialmente i moscerini. Successivamente, pipettare 500 microlitri di etanolo colorato della concentrazione scelta su un'estremità di un tappo di ovatta simile a quello di una provetta. Quindi sostituire il tappo della camera di esposizione con il tappo rivestito di etanolo, inserendo nell'apposita camera l'estremità ricoperta di etanolo.

Immediatamente dopo aver aggiunto la capsula rivestita di etanolo alla camera di esposizione, avviare un cronometro. Il colorante presente nell'etanolo aiuta a garantire che l'etanolo sia rivolto verso l'interno della camera di esposizione e non verso la parete della provetta. Questo è particolarmente importante se si utilizzano palline di cotone anziché tappi specifici, poiché qualsiasi lato di una pallina di cotone può essere orientato verso l'interno della provetta.

In questa esposizione, stiamo utilizzando alcol al 100%, che ora si diffonde nella camera di esposizione dove le mosche lo inalano dall'aria. Ogni minuto dopo aver aggiunto il tappo rivestito di etanolo alla camera di esposizione, conteremo quante mosche sono diventate immobili, ovvero non sono più in grado di girarsi e camminare. Più a lungo le mosche rimangono mobili, maggiore sarà la loro resistenza a ogni intervallo di un minuto.

Sorprendete i moscerini dandogli un colpetto sulla camera del banco in modo che tutti i moscerini che possono muoversi inizino a farlo. Osservate i moscerini per 10 secondi dopo aver dato il colpetto, concedendo loro il tempo di iniziare a muoversi o di girarsi, per ogni intervallo di un minuto. Documentate quanti dei otto moscerini sono immobili all'inizio dell'esperimento.

La maggior parte delle mosche correrà rapidamente lungo il lato della provetta dopo essere stata spaventata. Dopo circa sei minuti di esposizione a etanolo al 100%, inizieranno a muoversi con lentezza e talvolta in modo irregolare entro i 12 minuti. La maggior parte delle mosche rimarrà immobile, incapace di camminare o di rialzarsi se distesa supina.

Solo le mosche in grado di rialzarsi e camminare devono essere considerate mosche mobili; quelle che si limitano a muovere le zampe o le ali sul posto devono essere considerate mosche stazionarie. Le mosche che rimangono supine per l'intero periodo di osservazione devono essere anch'esse considerate stazionarie, poiché l'incapacità di rialzarsi è un segno di intossicazione. Le mosche che vibrano energeticamente le ali per tutta la durata dei dieci secondi di osservazione devono essere considerate stazionarie, anche se cambiano posizione. La stragrande maggioranza di queste mosche è stazionaria tra i periodi di movimento rapido delle ali.

In sintesi, le mosche in grado di girarsi e camminare sono mosche mobili; quelle incapaci di girarsi, muovere le zampe e le ali sul posto o vibrare rapidamente le ali sono stazionarie. Applicando queste regole, osserviamo che un numero maggiore di mosche di tipo selvatico diventa stazionario all'aumentare dei minuti di esposizione ai vapori di etanolo. Il valore che questo saggio utilizza per quantificare la sensibilità all'etanolo è il tempo mediano di sedazione, o MST.

Definiamo MST i minuti di esposizione all'etanolo necessari affinché quattro delle otto mosche nella camera di esposizione diventino immobili. Questo valore è facilmente determinabile se esattamente quattro mosche sono immobili in un determinato periodo di osservazione. Ad esempio, se esattamente quattro mosche sono immobili dopo 11 minuti di esposizione, allora 11 è il MST.

Se esattamente quattro mosche sono immobili dopo 11 minuti di esposizione e lo stesso vale dopo 12 minuti, allora si consideri il primo valore come il momento in cui le mosche raggiungono per la prima volta la loro ST. Se quattro mosche non sono immobili in un determinato intervallo di osservazione, è necessario interpolare linearmente il tempo in cui quattro mosche diventano immobili. Ad esempio, se il numero di mosche immobili passa da tre a cinque tra i nove e i dieci minuti di esposizione, si può determinare graficamente che la ST è 9,5. I seguenti dati raccolti utilizzando questo saggio mostrano che questo disegno sperimentale rappresenta un metodo accurato per misurare la sensibilità all'etanolo.

Nei seguenti esperimenti è stato utilizzato un numero N di sei-otto provette, come indicato all'interno delle barre. Il tempo di sopravvivenza medio (MST) delle mosche di tipo selvatico maschili esposte all'etanolo al 100% è di circa 11 minuti, con un basso errore standard. La variabilità da un giorno all'altro è ridotta e per lo più non statisticamente significativa, ma raccomandiamo comunque di misurare i campioni sperimentali e i controlli in parallelo nello stesso giorno.

Si noti inoltre che le mosche esposte il giorno A e il giorno B non sono gli stessi individui. Si tratta di soggetti della stessa linea genetica. Le mosche maschio e femmina esposte a Etanolo al 100% non mostrano differenze nel MST. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare un solo sesso.

Se esponiamo moscerini maschi e femmine a dosi crescenti di etanolo, otteniamo una chiara curva dose-risposta che mostra una diminuzione statisticamente significativa del MST in funzione dell'aumento della concentrazione di etanolo. Questo saggio riproduce anche fenotipi precedentemente pubblicati, misurati con un apparato più complesso di vaporizzazione dell'etanolo: moscerini con la mutazione *right rabbit one* hanno mostrato un aumento significativo del MST. Questo aumento è stato osservato sia all'100% che al 90% di etanolo.

Utilizzando questo saggio, possiamo anche indurre e misurare la tolleranza all'etanolo nelle mosche. La tolleranza è definita come una riduzione della risposta all'alcol dopo un'esposizione preliminare all'alcol per indurre tolleranza. Esporre un'ampolla di mosche all'etanolo per circa il doppio del loro MST.

Ad esempio, esponiamo questi maschi del ceppo selvatico di Berlino all'etanolo al 100% per 24 minuti. Dopo l'esposizione, battere leggermente il tubo per far rientrare le otto mosche nel loro vial contenente alimento, dove le lascerete riprendersi per quattro ore. Registrare il tempo di perdita di movimento (MST) iniziale delle mosche sul vial dopo quattro ore di recupero, quindi esporre nuovamente esattamente le stesse mosche alla stessa dose di etanolo e registrare il loro secondo MST.

Come si può osservare da questo grafico, il tempo di perdita di movimento (MST) della seconda esposizione all'etanolo è significativamente più alto rispetto al tempo di perdita di movimento (MST) della prima esposizione, indicando che i moscerini hanno sviluppato tolleranza agli effetti sedativi dell'etanolo. Un indice di tolleranza viene calcolato dividendo il secondo MST di un determinato contenitore di moscerini per il primo MST degli stessi moscerini e sottraendo uno; il valore viene espresso come percentuale di tolleranza, che nel nostro caso è di circa il 50%. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.