Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All'interno della Gut Tick
14 febbraio 2011
Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare e localizzare cellule di Borrelia burgdorferi nell'intestino del tick. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto aghi capillari di vetro e riempiendoli con cellule di B. burgdorferi. Successivamente, le cellule di B. burgdorferi vengono trasferite nell'intestino del tick mediante microiniezione.
Successivamente, la zecca viene dissezionata e i tessuti intestinali sono rimossi. Infine, viene eseguita l'etichettatura mediante immunofluorescenza di beberg defer nell'intestino della zecca. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano la localizzazione di beberg in ferry nell'intestino della zecca mediante microscopia confocale.
Ciao, sono la dottoressa Ruth Paul Paul, professoressa associata presso l'Università del Maryland nel Dipartimento di Medicina Veterinaria. Oggi due membri del mio laboratorio, Toro Cairo, ricercatore post-dottorato, e Adam Coleman, studente laureato, vi mostreranno la procedura per l'infezione artificiale delle zecche mediante microiniezione, che eseguiamo regolarmente in laboratorio. Dopo la microiniezione, disseccheremo la zecca e osserveremo i batteri nell'intestino della zecca utilizzando un microscopio confocale CE.
Il principale vantaggio della microiniezione in zecche per la generazione di zecche naturalmente infette è la durata della procedura. La microiniezione riduce l'intero processo da settimane a ore, poiché sono necessarie circa cinque settimane per generare zecche infette mediante il processo naturale di alimentazione. Questa tecnica può inoltre essere adattata per iniettare altri reagenti utili, come RNA a doppio filamento per l'RNAi o antisieri per l'interferenza specifica di anticorpi all'interno della zecca.
Per iniziare, fabbricare diversi aghi per microiniezione riscaldando e tirando tubi capillari di vetro da un millimetro in un dispositivo per la trazione di micropipette di vetro. Rimuovere con attenzione i tubi capillari fragili. Conservare gli aghi raccolti con la punta rivolta verso l'alto su nastro adesivo all'interno di una piastra di Petri.
Successivamente, coltivare B. burgdorferi in mezzo di coltura BSK fino a una concentrazione di circa 10⁷ cellule per millilitro. Pellettare B. burgdorferi mediante centrifugazione a 3000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il sopranatante ed sospendere completamente il pellet nel mezzo BSK passandolo delicatamente attraverso una micropunta sterile da 200 µL, ottenendo una concentrazione finale di 10⁹ cellule per millilitro.
Considerato che le cellule vengono risospese ad alta densità e potrebbero aggregarsi, la sospensione cellulare deve essere utilizzata immediatamente per la microiniezione per preparare le zecche; posizionare un nastro adesivo trasparente bifacciale su un vetrino lavorando su un tappetino adesivo, rimuovere con attenzione le zecche dal contenitore e, utilizzando un piccolo pennello, posizionare il numero richiesto di zecche da iniettare sul nastro adesivo con il lato ventrale rivolto verso l'alto e orientate tutte nella stessa direzione. Caricare cinque microlitri della coltura di beberg de ferry nell'ago capillare raggruppato. Utilizzando una punta da pipetta microload da 20 microlitri, ispezionare l'ago alla ricerca di bolle d'aria intrappolate e ricaricare l'ago con la coltura batterica.
Se necessario, osservare la zecca al microscopio stereoscopico e mettere a fuoco l'area dell'apertura anale della zecca. Toccare delicatamente la punta dell'ago capillare per rompere il tubo nella zona in cui il diametro è leggermente inferiore a quello dell'apertura anale della zecca, formando così l'ago per microiniezione. Questo passaggio è fondamentale, poiché qualsiasi tentativo di iniettare zecche con punte di aghi non adeguate provoca lesioni e possibili decessi.
Per il tique iniettato. Posizionare i tiques immobilizzati sotto il microscopio stereoscopico e mettere a fuoco l'apertura anale, che è coperta da due piastre anali mobili. Utilizzando pinzette fini, toccare delicatamente e applicare una pressione molto leggera in qualsiasi area vicina all'apertura anale.
Questo permetterà la separazione delle piastre anali e l'apertura del poro anale che si collega all'intestino. Inserire con attenzione la punta dell'ago leggermente nell'apertura anale attraverso la forzata separazione delle piastre anali. L'inserimento dell'ago deve essere mantenuto al minimo, poiché la punta di vetro potrebbe danneggiare il retto semitrasparente che si collega al retto.
Utilizzando un microinjector dotato di un controllo automatico a pedale, iniettare la soluzione di beberg de ferry utilizzando i seguenti parametri: pressione di iniezione di 1000 hettopascal, tempo di iniezione di 0,2 secondi e pressione di compensazione di otto hettopascal. Ogni campione riceve una singola iniezione dopo la microiniezione.
La zecca dovrebbe mostrare segni di movimento o strisciare in risposta a stimoli simili a quelli precedenti l'iniezione. Per dissezionare le zecche per la microscopia a fluorescenza, posizionare prima una goccia di soluzione salina tamponata al fosfato su un vetrino pulito per la dissezione e un'altra su un vetrino rivestito di poli-L-lisina. Per la microscopia, preparare un altro vetrino con nastro adesivo doppio faccia. Successivamente, rimuovere la zecca dal contenitore e posizionarla sul nastro adesivo doppio faccia.
Utilizzando un piccolo pennello sotto la vista del microscopio stereoscopico, mettere a fuoco la zecca e posizionare una lama affilata di rasoio sulla zecca tra la prima e la seconda coppia di zampe. Premere con decisione per tagliare la zecca in due parti, esponendo l'addome, che va immediatamente immerso in una goccia di PBS utilizzando pinzette fini. Afferrare l'esoscheletro dorsale e ventrale intorno al sito del taglio.
Sollevare con attenzione lo scudo dorsale allontanandolo dalla zecca, esponendo il diverticolo intestinale di colore bruno. Prestare attenzione a mantenere sempre le zecche in dissezione immersi nel PBS. I grappoli di ghiandole salivari semitrasparenti si trovano ai lati della regione anteriore dell'intestino e possono essere rimossi in questo momento, se desiderato.
Tenendo fermo il resto dell'esoscheletro con una pinzetta, estrarre con cura l'intestino dall'addome. Pulire attentamente l'intestino rimuovendo eventuali tessuti intrappolati, come le trachee. Utilizzando la punta di una pinzetta fine, trasferire rapidamente l'intestino della zecca in una goccia di PBS su un vetrino di vetro rivestito con poli-L-lisina.
Separare l'intestino in pezzi più piccoli utilizzando lame sottili o premendo delicatamente con la punta di pinzette fini. Aspirare con attenzione l'eccesso di PBS intorno ai tessuti intestinali. Lasciare asciugare all'aria i tessuti intestinali a temperatura ambiente.
Fissare l'intestino della zecca immergendolo in acetone per 10 minuti. Lasciarlo asciugare all'aria a temperatura ambiente. I vetrini possono essere conservati a questo stadio per mesi a meno 20 gradi Celsius in un contenitore ermetico. Per l'etichettatura mediante immunofluorescenza dell'intestino, tracciare un cerchio intorno all'intestino della zecca fissato con una penna Pap o un altro dispositivo per creare barriere idrofobe.
Questo aiuterà a mantenere le soluzioni di colorazione durante i successivi passaggi di incubazione. Coprire l'intestino della zecca con una o alcune gocce di buffer bloccante per 30 minuti, a temperatura ambiente.
Il siero utilizzato per il blocco dipende dalla specie di provenienza dell'animale ospite per l'anticorpo. Non permettere che il vetrino si asciughi da questo momento in poi. Aspirare lentamente il buffer di blocco.
Incubare l'intestino con soluzioni di anticorpi primari e/o secondari appropriati. Utilizziamo fluoresceina, isotiocianato o FXI coniugati anti B berg. Diluire l'anticorpo in rapporto 1:100 nel buffer di blocco per un'ora.
A temperatura ambiente, coprire il contenitore con della carta d'alluminio per limitare l'esposizione alla luce. Rimuovere la soluzione di anticorpo mediante aspirazione delicata. Incubare l'intestino con un colorante fluorescente per etichettare i tessuti della zecca, come DPI o ioduro di propidio.
Normalmente utilizziamo 20 microgrammi per millilitro di ioduro di peridinio in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente, laviamo tre volte con 0,05% di tween 20 in PBS per cinque minuti. Infine, montiamo il vetrino in glicerolo tamponato contenente un reagente Antifa e copriamo con attenzione con un coprioggetto di vetro. I vetrini possono essere conservati a questo stadio per alcuni mesi a quattro gradi Celsius in un contenitore ermetico, quindi osservati e localizzati b berg de ferry mediante microscopio confocale.
Un'iniezione microscopica in una zecca è mostrata qui con un ago riempito di blu brillante kumasi per una migliore visibilità. Pinzette fini vengono utilizzate per applicare una leggera pressione sul corpo, permettendo la separazione delle piastre anali e l'apertura del poro anale per la microiniezione. Qui, la regione anteriore di un diverticolo intestinale è mostrata con beberg ferry all'interno dell'intestino.
I nuclei intestinali e gli spirochete sono marcati rispettivamente con ioduro di propidio o con anti beberg ferry coniugato a fitzy. Una volta acquisita padronanza della tecnica, abbiamo riscontrato che è possibile microiniettare 10 zecche contemporaneamente, ottenendo naturalmente circa centomila zecche sopravvissute e infettate con fer. Sebbene le zecche possano essere utilizzate immediatamente per altri esperimenti, in genere attendiamo uno o due giorni per assicurarci che sopravvivano alla procedura prima di proseguire.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare zecche artificialmente infette mediante microiniezione e barriera localizzata all'interno dell'intestino della zecca utilizzando flussi immunoconfocali. Lavorare con zecche e sottili aghi di vetro riempiti con un patogeno umano come Borrelia burgdorferi può essere pericoloso durante l'esecuzione delle operazioni. Presta attenzione alla posizione delle zecche e degli aghi e applica in ogni momento le precauzioni previste per il livello di sicurezza biologica due.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un metodo basato sulla microiniezione per infettare le zecche con Borrelia burgdorferi, riducendo in modo significativo il tempo necessario per l'infezione delle zecche. Inoltre, viene dimostrata una tecnica di immunofluorescenza per localizzare l'agente patogeno nei tessuti delle zecche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia dei vettori
- Localizzazione dei patogeni
Sfondo
- La malattia di Lyme è causata dal batterio Borrelia burgdorferi.
- Le zecche sono i vettori principali per la trasmissione di questo patogeno.
- I metodi tradizionali per infettare le zecche sono lunghi e laboriosi.
- Metodi di infezione rapida possono migliorare l'efficienza della ricerca.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo più rapido per infettare le zecche con B. burgdorferi.
- Consentire la localizzazione in situ dell'agente patogeno nei tessuti delle zecche.
- Migliorare la comprensione delle interazioni zecca-patogeno.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di aghi in capillare di vetro per la microiniezione.
- Microiniezione di cellule di B. burgdorferi nell'intestino delle zecche.
- Dissezione delle zecche per isolare i tessuti intestinali.
- Etichettatura con immunofluorescenza di B. burgdorferi nei tessuti intestinali.
Risultati principali
- Microiniezione riuscita di B. burgdorferi nell'intestino delle zecche.
- Localizzazione efficace del patogeno dimostrata mediante immunofluorescenza.
- Risultati visualizzati utilizzando microscopia confocale.
- Il metodo riduce in modo significativo il tempo necessario per l'infezione delle zecche.
Conclusioni
- La tecnica di microiniezione rappresenta un'alternativa valida per l'infezione delle zecche.
- La immunofluorescenza permette una localizzazione precisa dei patogeni.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche sulla trasmissione della malattia di Lyme.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'infezione rapida e controllata dei vettori zecche con Borrelia burgdorferi permette uno studio efficiente delle interazioni patogeno-vettore fondamentali per la ricerca sulla malattia di Lyme. Questo approccio di microiniezione riduce i tempi di infezione da settimane a ore, favorendo schermate ad alto rendimento e la riduzione meccanicistica dei rischi nelle fasi iniziali della scoperta. Il metodo garantisce un rilascio riproducibile del patogeno, migliorando l'affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo di saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni tra Borrelia burgdorferi e l'intestino della zecca per validare bersagli terapeutici coinvolti nella persistenza e trasmissione del patogeno.
- Valore operativo: Garantisce carichi patogeni standardizzati tra diversi gruppi di zecche, riducendo la variabilità nei modelli di infezione e migliorando la riproducibilità dei saggi.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio funzionale dei bersagli permettendo un'esposizione controllata a ceppi patogeni, inclusi quelli attenuati nei modelli murini.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera tessuti di zecche infette adatti a saggistica successiva di immunofluorescenza e imaging confocale per quantificare la localizzazione e il carico del patogeno.
- Valore operativo: Produce risultati quantificabili e pronti per la microscopia, che permettono la standardizzazione delle letture di rilevamento del patogeno in campagne di screening.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di un elevato numero di zecche uniformemente infette, sostenendo la riproducibilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma in sistemi di screening basati su vettori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce un sistema rilevante per lo studio della localizzazione di Borrelia burgdorferi nell'intestino della zecca, collegando risultati ottenuti in vitro alla patofisiologia associata al vettore.
- De-risking meccanicistico: Permette la visualizzazione della distribuzione dell'agente patogeno nei tessuti della zecca, fornendo informazioni per formulare ipotesi sui fattori di virulenza specifici del tessuto e sui meccanismi di trasmissione.
- Perfezionamento del modello preclinico: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato fornendo un'esposizione costante all'agente patogeno per valutare l'efficacia di interventi nei modelli di malattie trasmesse da zecche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, consentendo la rapida generazione di vettori di zecche infette e letture standardizzate della localizzazione dell'agente patogeno.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni patogeno-vettore somministrando quantità controllate di Borrelia burgdorferi nell’intestino della zecca per un’analisi meccanicistica.
- Screening: Produce tessuti di zecca infetti standardizzati, adatti per saggi di immunofluorescenza quantitativa, migliorando la riproducibilità nei protocolli di rilevamento del patogeno.
- Analisi: Genera letture basate sulla microscopia confocale per la localizzazione e il carico del patogeno, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali e interventi.
- Ricerca traslazionale: Collega la coltura in vitro del patogeno alla localizzazione nei tessuti della zecca, favorendo l’allineamento di biomarcatori e la rilevanza fisiopatologica nei modelli di malattie trasmesse da vettori.
- Riutilizzo su scala aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per infettare zecche con diversi agenti biologici, inclusi anticorpi e reagenti per RNAi, ampliando l’applicabilità oltre gli studi su Borrelia burgdorferi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni patogeno-vettore mediante la rilevazione localizzata del patogeno.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità dei modelli di infezione da zecche, riducendo i tempi e l'impegno di risorse rispetto ai metodi di alimentazione naturale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione nella fase iniziale di scoperta fornendo modelli standardizzati e rapidi di esposizione al patogeno per la riduzione del rischio degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle iniziative di ricerca sulla malattia di Lyme attraverso modelli di infezione affidabili e ad alta fedeltà che riducono la variabilità biologica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di microiniezione, nella manipolazione delle zecche e nella microscopia confocale con immunofluorescenza.
- È dipendente dalla preparazione degli aghi capillari in vetro, dagli strumenti per microiniezione e dall'infrastruttura per microscopia a fluorescenza.
- Necessita della standardizzazione dei parametri di iniezione e dei protocolli di dissezione dell'intestino tra i diversi gruppi di lavoro, al fine di garantire un rilascio del patogeno e letture di localizzazione coerenti.
- L'adattamento a diverse specie di zecche o ceppi di patogeni potrebbe richiedere un'ottimizzazione della dimensione dell'ago, della pressione di iniezione e della concentrazione batterica.
- I limiti pratici includono l'abilità tecnica necessaria per eseguire con successo la microiniezione e la dissezione dell'intestino, nonché la necessità di contenimento di livello di sicurezza biologica 2 quando si manipolano patogeni umani.
