Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All'interno della Gut Tick
February 14th, 2011
Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare e localizzare le cellule di borrelia berg de ferry nell'intestino della zecca. Ciò si ottiene preparando prima gli aghi capillari di vetro e riempiendoli con cellule di beberg de ferry. Successivamente, le cellule differenti di beberg vengono trasferite nell'intestino della zecca tramite microiniezione.
La zecca viene quindi sezionata e i tessuti intestinali vengono rimossi. Infine, viene eseguita la marcatura in immunofluorescenza del rinvio di beberg nell'intestino della zecca. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano la localizzazione di beberg nel traghettamento nell'intestino della zecca utilizzando la microscopia confocale.
Ciao, sono la dottoressa Ruth Paul Paul, assistente professore presso l'Università del Maryland nel Dipartimento di Medicina Veterinaria. Oggi due membri del mio laboratorio, Toro Cairo, un borsista post-dottorato e Adam Coleman, uno studente laureato, vi mostreranno la procedura per l'infezione artificiale delle zecche tramite microiniezione che facciamo abitualmente in laboratorio. Dopo la microiniezione, sezioniamo la zecca e immaginiamo i batteri nell'intestino della zecca utilizzando il microscopio CE confocale.
Il vantaggio principale della microiniezione di zecche di una generazione di zecche infette naturali è la durata della procedura. La microiniezione accorcia l'intera procedura da settimane a ore, poiché sono necessarie circa cinque settimane per generare zecche infette mediante un processo di alimentazione naturale. Questa tecnica può anche essere adattata per iniettare altri reagenti utili come l'RNA a doppio filamento per l'RNAi o gli antisieri per l'interferenza anticorpale specifica all'interno della zecca.
Per iniziare, fabbricare diversi aghi per microiniezione riscaldando e tirando tubi capillari di vetro da un millimetro in un dispositivo di estrazione per micropipette di vetro. Rimuovere con cautela i fragili tubi capillari. Conservare gli aghi raggruppati con la punta rivolta verso l'alto sul nastro adesivo in una capsula di Petri.
Successivamente, cresci il berg de ferry nella cultura BSK. Medio ad una concentrazione di circa 10 alle sette celle per millilitro di pellet b berg de ferry mediante centrifugazione a 3000 volte G per 10 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere la staffetta e risospendere completamente il pellet in terreno BSK passando delicatamente attraverso una micropunta sterile da 200 microlitri fino a una concentrazione finale di 10-nove cellule per millilitro.
Poiché le cellule sono risospese ad alta densità cellulare e potrebbero aggregarsi, la sospensione cellulare deve essere utilizzata immediatamente per la microiniezione per preparare le zecche, posizionare del nastro biadesivo trasparente su un vetrino lavorando su un tappetino appiccicoso, rimuovere con cura le zecche dal contenitore Utilizzando un pennellino posizionare il numero richiesto di zecche da iniettare sul nastro adesivo con il lato ventrale rivolto verso l'alto rivolto nella stessa direzione. Caricare cinque microlitri della coltura beberg de ferry nell'ago capillare raggruppato. Utilizzando un micro carico da 20 microlitri di punta della pipetta, ispezionare l'ago per verificare la presenza di bolle d'aria intrappolate e ricaricare l'ago con coltura batterica.
Se necessario, osservare la zecca con il microscopio binoculare da dissezione e concentrarsi sull'area dell'apertura anale della zecca. Toccare delicatamente la punta dell'ago capillare in modo da rompere il tubo dove il diametro è leggermente inferiore a quello dell'apertura anale della zecca che forma l'ago per microiniezione. Questo passaggio è fondamentale in quanto qualsiasi tentativo di iniettare zecche con punte d'ago non appropriate provoca lesioni e possibile morte.
Alla zecca iniettata. Posiziona le zecche immobilizzate sotto il microscopio binoculare da dissezione e metti a fuoco l'apertura anale, che è coperta da due piastre anali mobili. Usando una pinza sottile, tocca delicatamente e applica una pressione molto leggera su qualsiasi area vicino all'apertura anale.
Ciò consentirà la separazione delle placche anali e l'apertura del poro anale che si collega all'intestino. Inserire con cautela la punta dell'ago nell'apertura anale attraverso l'apertura forzata delle piastre anali. L'inserimento dell'ago deve essere ridotto al minimo in quanto la punta di vetro potrebbe danneggiare l'intestino posteriore semitrasparente che si collega al retto.
Utilizzando un micro iniettore dotato di un comando a pedale automatizzato, iniettare la soluzione beberg de ferry utilizzando i seguenti parametri: 1000 Hector Pascals, pressione di iniezione 0,2 secondi, tempo di iniezione e otto Hector Pascal, pressione di compensazione. Ogni zecca riceve una singola iniezione dopo la microiniezione.
La zecca dovrebbe mostrare segni di movimento o strisciare in risposta a stimoli simili a prima dell'iniezione. Per sezionare le zecche per la microscopia a immunofluorescenza, posizionare prima una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato su un vetrino pulito per la dissezione e un'altra su un vetrino rivestito di poli-L lisina Per la microscopia, preparare un altro vetrino con nastro biadesivo. Quindi, rimuovi la zecca dal contenitore e posizionala su del nastro biadesivo.
Usando un piccolo pennello sotto la vista del microscopio di dissezione e concentrandosi sulla zecca, posizionare una lama di rasoio affilata sulla zecca tra il primo e il secondo paio di zampe. Premere con decisione tagliando la zecca in due pezzi, esponendo l'addome e immergere immediatamente l'addome in una gocciolina di PBS usando una pinza fine. Afferra l'esoscheletro dorsale e ventrale attorno al sito del taglio.
Tirare con cautela lo scudo dorsale verso l'alto e allontanarlo dalla zecca, esponendo il diverticolare intestinale di colore brunastro. Fare attenzione a tenere sempre le zecche di dissezione sotto il PBS. I fasci semitraslucidi della ghiandola salitale si trovano su entrambi i lati della regione anteriore dell'intestino e possono essere rimossi a questo punto se lo si desidera.
Tenendo in posizione l'esoscheletro rimanente con una pinza, estrarre con cautela l'intestino dall'addome. Pulisci accuratamente l'intestino rimuovendo tutti i tessuti intrappolati come la trachia. Usando la punta di una pinza fine, trasferire rapidamente l'intestino della zecca in una gocciolina di PBS su un vetrino di vetro di poli-lisina L.
Separare il budello in pezzi più piccoli usando lame sottili o premendo delicatamente con la punta di una pinza fine. Aspirare con cura l'eccesso di PBS intorno ai tessuti intestinali. Lasciare asciugare i tessuti intestinali all'aria a temperatura ambiente.
Ripara l'intestino della zecca immergendolo nell'acetone per 10 minuti. Lasciarlo asciugare all'aria, i vetrini a temperatura ambiente possono essere conservati in questa fase per mesi a meno 20 gradi Celsius in un contenitore ermetico. Per l'etichettatura immunofluorescente dell'intestino, disegna un cerchio attorno all'intestino fisso della zecca con una pap pen o un altro dispositivo di rivestimento barriera idrofobico.
Ciò contribuirà a trattenere le soluzioni coloranti durante le successive fasi di incubazione. Coprire l'intestino della zecca con una o poche gocce di tampone bloccante per 30 minuti. A temperatura ambiente.
Il siero utilizzato per il blocco dipende dalla fonte dell'anticorpo dell'animale ospite. Non lasciare che il carrello si asciughi da questo punto in poi. Aspirare lentamente il tampone di bloccaggio.
Incubare l'intestino con appropriate soluzioni di anticorpi primari e/o secondari. Usiamo fluoresceina, isotiocianato o anti Bberg marcato con FXI. Differire l'anticorpo a una diluizione da uno a 100 nel tampone bloccante per un'ora.
A temperatura ambiente, coprire il contenitore con un foglio di alluminio per limitare l'esposizione alla luce. Rimuovere la soluzione anticorpale mediante aspirazione delicata. Incubare l'intestino con un colorante fluorescente per etichettare i tessuti delle zecche come DPI o ioduro di propidio.
Normalmente usiamo 20 microgrammi per millilitro di ioduro di peridio in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente, laviamo tre volte con lo 0,05% tra 20 in PBS per cinque minuti. Infine, montare il vetrino in glicerolo tamponato contenente un reagente Antifa e coprire accuratamente con un coperchio di vetro. I vetrini possono essere conservati in questa fase per alcuni mesi a quattro gradi Celsius in un'immagine ermetica del contenitore e localizzati al microscopio confocale.
Qui viene mostrata una microiniezione di zecche con un ago riempito di blu brillante kumasi per la visibilità. Le pinze sottili vengono utilizzate per applicare una leggera pressione sul corpo, che consente la separazione delle placche anali e l'apertura del poro anale per la microiniezione. Qui, la regione anteriore di un diverticolo intestinale è mostrata con il traghetto di beberg all'interno dell'intestino.
I nuclei intestinali e le spirochete sono marcati rispettivamente con ioduro di propidio o con Fitzy coniugato anti beberg Ferry. Una volta padroneggiato, abbiamo scoperto che 10 zecche possono essere micro iniettate con naturalmente centomila sopravvissuti e infettati da fer. Sebbene le zecche possano essere utilizzate immediatamente per altri esperimenti, in genere aspettiamo uno o due giorni per assicurarci che le zecche sopravvivano alla procedura prima di procedere.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare zecche infette artificiali da micro e insetti barriera localizzati all'interno dell'intestino della zecca utilizzando flussi immunologici confocali. Micro Lavorare con zecche e aghi di vetro sottili riempiti con un agente patogeno umano come gli avannotti di brelia brior può essere pericoloso durante il lavoro. Sii consapevole della posizione di zecche e aghi e pratica sempre le precauzioni di biosicurezza di livello due.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo basato sulla microiniezione per infettare le zecche con Borrelia burgdorferi, riducendo significativamente il tempo richiesto per l'infezione delle zecche. Inoltre, viene dimostrata una tecnica di immunofluorescenza per localizzare il patogeno all'interno dei tessuti delle zecche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microbiologia
- Biologia dei vettori
- Localizzazione del patogeno
Sfondo
- La malattia di Lyme è causata dal batterio Borrelia burgdorferi.
- Le zecche sono i principali vettori per la trasmissione di questo patogeno.
- I metodi tradizionali per infettare le zecche sono lunghi.
- I metodi di infezione rapidi possono migliorare l'efficienza della ricerca.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo più rapido per infettare le zecche con B. burgdorferi.
- Consentire la localizzazione in situ del patogeno nei tessuti delle zecche.
- Migliorare la comprensione delle interazioni tra zecche e patogeni.
Metodi utilizzati
- Preparazione di aghi capillari di vetro per la microiniezione.
- Microiniezione di cellule di B. burgdorferi nell'intestino delle zecche.
- Sezione delle zecche per isolare i tessuti intestinali.
- Marcatura immunofluorescente di B. burgdorferi nei tessuti intestinali.
Risultati principali
- Microiniezione di successo di B. burgdorferi nell'intestino delle zecche.
- Localizzazione efficace del patogeno dimostrata attraverso l'immunofluorescenza.
- Risultati visualizzati utilizzando la microscopia confocale.
- Il metodo riduce significativamente il tempo per l'infezione delle zecche.
Conclusioni
- La tecnica di microiniezione è un'alternativa praticabile per l'infezione delle zecche.
- L'immunofluorescenza permette una localizzazione precisa dei patogeni.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche sulla trasmissione della malattia di Lyme.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
