Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere un'immagine quantitativa di un'infezione in animali vivi che possa consentire la localizzazione dell'organismo infettante all'interno dei tessuti e degli organi dell'ospite. I topi anestetizzati vengono prima infettati per via intratracheale con batteri bioluminescenti. Ai topi infetti viene quindi iniettato Luciferian, che consente di eseguire l'imaging dal vivo nel sistema IVIS.

Una volta ottenute le immagini di tutto il corpo, i polmoni infetti vengono raccolti. L'imaging degli organi isolati può essere eseguito per dimostrare la vera localizzazione dell'agente patogeno. Dopo l'imaging, i polmoni vengono omogeneizzati e diluiti su terreno di crescita batterico per la quantificazione della carica microbica.

In definitiva, si ottengono risultati che mostrano in tempo reale la posizione e il numero di agenti patogeni presenti all'interno dell'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che gli agenti patogeni possono essere visualizzati e monitorati negli animali vivi mediante imaging in tempo reale, fornendo informazioni sui tic spaziali dell'infezione microbica. A dimostrare questa procedura saranno il Dr.Mihi Chang, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio, e SWAT Cillo, un ricercatore nel mio laboratorio.

Inizia con l'iniezione intraperitoneale, iniettando topi con valvola C di età compresa tra sei e 12 settimane con una soluzione anestetica premiscelata contenente 100 microgrammi di ketamina e 10 microgrammi di xilazina per grammo di peso del topo. Rimetti i topi nelle loro gabbie fino a quando l'anestetico non fa effetto. Per determinare se l'anestesia è completa, premere il poggiapiedi di ciascun mouse e assicurarsi che non si verifichi alcuna reazione riflessa del pedale.

Una volta che gli animali sono completamente anestetizzati, prendi un topo e posizionalo sull'intubazione. Stai sdraiato sulla schiena. Usa del nastro adesivo per fissare le gambe e le braccia del mouse sul supporto.

Fissare un elastico al supporto per intubazione. Quindi posizionalo sotto gli incisivi superiori del topo. Una volta che il topo è immobilizzato, usa una pinza per estrarre delicatamente la lingua dalla bocca.

Successivamente, inserisci delicatamente lo speculum con l'otoscopio all'interno della bocca del topo e trova l'apertura della laringe, che si trova davanti all'esofago sul lato ventrale dell'orofaringe. Una volta identificata l'apertura della laringe, inserire un catetere da 22 pollici contenente un filo guida nella trachea fino a quando il mozzo del catetere raggiunge gli incisivi. Rimuovere il filo guida e collegare il catetere alla pompa di plastica.

Quindi spingere l'aria nel catetere. Il torace del topo si gonfierà se l'intubazione è corretta. Una volta confermato il corretto posizionamento del catetere, pipettare 50 microlitri di soluzione batterica bioluminescente alla concentrazione desiderata nel catetere e inserire una siringa da un millilitro con 50 microlitri d'aria per spingere la soluzione nei polmoni del topo.

Due o tre volte, rimuovere il catetere e riposizionare il topo nella sua gabbia per consentirgli di riprendersi dall'anestesia. Prima di eseguire l'imaging a bioluminescenza, anestetizzare i topi utilizzando isoflurano. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, rimuoverli dalla camera di induzione e applicare delicatamente un unguento ottico per proteggere gli occhi dell'animale.

Durante l'imaging, posizionare i topi nella camera di imaging ciascuno e uno dei coni del naso sul collettore di anestesia. Utilizzare un deflettore luminoso tra i topi per evitare il riflesso della luce tra soggetti animali adiacenti. Infine, iniettare in ciascun topo intraperitoneale 150 microgrammi per grammo di peso corporeo di Lucifer.

Lascia che il Lucifero si disperda in tutto il corpo dell'animale per 10 minuti. Quindi inizia l'imaging. Avviare il software di imaging vivente e inizializzare il sistema di imaging IVIS.

Per impostare prima i parametri, fare clic su impostazione sequenza. Quindi selezionare la luminescenza e la modalità di imaging della fotografia. Seleziona immagini fotografiche luminescenti e di luce strutturale come parte della sequenza di immagini per consentire la ricostruzione 3D DLIT.

Quindi, impostare il tempo di esposizione su un minuto. Quindi regolare il binning su medio e l'F-stop su uno. Impostare il filtro di eccitazione su Blocco e i filtri di emissione su Aprirsi per la ricostruzione 3D abilitano più filtri di diverse lunghezze d'onda.

Per consentire una localizzazione accurata della sorgente del segnale, selezionare il FOV corrispondente al numero di topi visualizzati. Una volta definite tutte le impostazioni, fare clic su Aggiungi nella procedura guidata immagine nel pannello di controllo dell'acquisizione per aggiungere l'impostazione della sequenza e fare clic su Acquisisci per avviare la sequenza di imaging durante l'acquisizione. Registra i dettagli e le condizioni sperimentali nella finestra di modifica dell'immagine e salva le immagini.

Infine, rimuovi i topi dalla camera di imaging e rimettili nelle loro gabbie. Monitorare costantemente gli animali fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Per l'imaging dei tessuti, sopprimere umanamente i topi.

A questo punto, prelevare asetticamente i polmoni di ciascun topo e trasferire gli organi in una capsula di Petri sterile. Posizionare la capsula di Petri contenente i polmoni infetti all'interno della camera di imaging e acquisire immagini di bioluminescenza nello stesso modo descritto in precedenza in questo video. Una volta ottenute le immagini, rimuovere la capsula di Petri dalla camera di imaging e, utilizzando una pinza sterile, trasferire i polmoni in una provetta contenente un millilitro di PBS sterile utilizzando un omogeneizzatore omogeneizzare i polmoni per due-cinque minuti.

Preparare la diluizione seriale degli omogeneizzati polmonari in PBS sterile. Quindi impiattare 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di Petri contenenti terreno selettivo. Incubare le colture a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie batteriche sono chiaramente visibili.

Quindi contare le CFU per valutare il livello di infezione. Avvia il software di immagini viventi e apri i file di immagine desiderati dal browser dei file. Nella tavolozza degli strumenti.

Fare clic su Regola immagine per modificare le impostazioni di correzione e filtraggio, nonché le soglie della scala di colori. Per quantificare l'intensità della luminescenza, utilizzare gli strumenti regione di interesse o ROI dall'elenco a discesa, selezionare il numero e la dimensione della forma ROI. Quindi fare clic su Misurazione del ROI e salvare l'output dei dati quantitativi per ricostruire le immagini 3D.

Innanzitutto, carica la sequenza di immagini, comprese le immagini a luce strutturata. Fare clic su topografia della superficie nella tavolozza degli strumenti. Quindi, nell'elenco a discesa, selezionare la scheda Ricostruisci per generare una topografia della superficie.

Quindi, selezionare Ricostruzione DILT 3D dalla tavolozza degli strumenti. Fare clic sulla scheda delle proprietà nell'elenco a discesa e impostare le proprietà del tessuto e lo spettro di origine su muscolo. Fare clic sulla scheda Analizza e selezionare la lunghezza d'onda per l'analisi.

Quindi fare clic su Start. Una volta regolate tutte le impostazioni, fare clic su ricostruisci per avviare l'analisi 3D. Al termine della ricostruzione 3D, selezionare la vista 3D per visualizzare i risultati facendo clic sulla scheda dei risultati, è possibile visualizzare la densità dei fotoni, i voxel dei dati e i parametri dell'algoritmo, salvare i risultati ed esportare i dati e le immagini per ulteriori analisi.

Come mostrato in questa figura, i due topi a destra che sono stati infettati intratrachealmente con 10-6 CFU di batteri bioluminescenti producono un forte segnale dall'area polmonare, mentre il topo non infetto a sinistra non lo fa. Un'analisi simile che utilizza polmoni sezionati da topi infetti da soli conferma che la luminescenza emana dai polmoni piuttosto che da qualche altro tessuto strettamente giustapposto. Il segnale emesso dal campione può essere facilmente quantificato come flusso totale all'interno di una regione di interesse.

Un'analisi tomografica conferma che la posizione della luminescenza visualizzata in queste immagini sotto forma di caselle rosse rientra nell'area contenente i polmoni del topo, come determinato dalla ricostruzione 3D. Infine, la somiglianza tra la curva di densità dei fotoni misurata a sinistra e la curva di densità dei fotoni simulata a destra attesta la buona qualità della ricostruzione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare animali infetti da precedenti e analizzare le immagini per la localizzazione e la quantificazione della reminiscenza.