Name: Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri l'imaging bioluminescente per infezioni batteriche in vivo utilizzando topi modificati con luciferasi. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale della progressione dell'infezione e la localizzazione dei patogeni nei tessuti ospite.

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Gli autori ringraziano i membri Cirillo laboratorio per le discussioni di valore e di assistenza in tutto questo studio. Ringraziamo il Dr. Joshua Hill e il laboratorio del Dr. James Samuel per assistenza durante le riprese di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla borsa 48523 dalla Bill &amp; Melinda Gates Foundation e concedere AI47866 dal National Institutes of Health.

1. Infezione polmonare da intubazione intratracheale <ol><li> Pesare topi e, opzionalmente, i marchi possono essere fatti sulle orecchie per una facile identificazione. </li><li> Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg per g di peso del mouse) e xilazina (10 mg per g di peso del mouse) per inoculazione intraperitoneale. </li><li> Topi posto nelle gabbie fino completamente anestetizzato. Spremere le pastiglie dei loro piedi per controllare pedale riflesso. I topi dovrebbe visualizzare ridotta o nessuna reazione riflessa. </li><li> Posizionare il mouse sul supporto intubazione sdraiato sulla schiena. </li><li> Fissare un elastico a stare intubazione e poi metterlo sotto gli incisivi superiori del mouse. Utilizzare del nastro per fissare le gambe e le braccia sul supporto intubazione. </li><li> Spostare delicatamente tougue dalla bocca con pinze. </li><li> Inserire speculum con octoscope all'interno della bocca e guardare in orofaringe fino all'apertura della laringe è visibile. </li><li> Filo guida anticipo coperto con cathether in trachea fino catether hub è al incisivi. Rimuovere il filo guida. Mettere in aria cathether per osservare l'espansione del torace e confermare l'intubazione corretta. </li><li> Iniettare 50 ml di batteri (nelle immagini mostrate abbiamo usato bacillo di Calmette Guerin (BCG) che esprime clicca scarabeo rosso luciferasi (CBRLuc), costruito nel nostro laboratorio, ma ogni sforzo luminescenti batterica può essere utilizzato) soluzione attraverso cathether usando una siringa da 1 ml. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia e osservarlo durante il recupero dall'anestesia. </li></ol> 2. Animali anestesia e preparazione per l'imaging bioluminescenza I topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando il XGI-8 Sistema Gas Aneshesia. <ol><li> Prima di utilizzare il sistema-8 XGI anestesia, pesare ogni canestro filtro al carbone e scrivere il peso e la data su di esso. Se il peso è di 50 grammi sopra del peso iniziale, sostituirlo con un nuovo contenitore. </li><li> Controllare il livello isoflurano nel vaporizzatore e riempire se necessario. </li><li> Accendere la pompa di evacuazione nella parte anteriore del XGI-8 sistema di anestesia e impostato su 8 lpm (litri per minuite). </li><li> Accendere la fornitura di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psig. </li><li> Accendere l'ossigeno passare (in verde) sulla parte anteriore del sistema-8 XGI anestesia. </li><li> Accendere il flusso di gas alla camera di imaging per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 0,25 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas. </li><li> Accendere il flusso di gas alla camera di induzione dell'anestesia per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 1,5 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas. </li><li> Accendere il isoflurano con il vaporizzatore e si mise al 2-2,5 per cento. Il livello di isoflurano può essere regolata a seconda del numero di animali utilizzati e il peso. </li><li> Luogo topi nella camera di induzione e chiudere il coperchio. Accendere il flusso di gas alla camera di induzione. Topi posto nella camera per 5 - 10 minuites fino a quando sono anestetizzare completamente. </li><li> Applicare una pomata ottico agli occhi per proteggere gli occhi del mouse durante l'imaging e posizionare il mouse nella camera di imaging in uno dei coni naso sul collettore di anestesia. Usa deflettore luce tra i topi per evitare il riflesso della luce su soggetti animali adiacenti. </li><li> Iniettare luciferina (150 mcg / grammo di peso corporeo) per inoculazione intraperitoneale. </li></ol> 3. Bioluminescenza Imaging <ol><li> Avviare il software di imaging Living. </li><li> Se il sistema non è stato inizializzato, inizializzare il sistema di Imaging IVIS. </li><li> Impostare i parametri per l'imaging, cliccando configurazione sequenza nel pannello di controllo acquisizione IVIS. Seleziona luminescenza e fotografare in modalità Imaging. Se l'opzione per effettuare DLIT ricostruzione 3D è desiderata, selezionare le immagini luce fotografica, luminescenti e strutturale come parte della sequenza di immagini. Impostare tempo di esposizione da 0,5 sec a 10 minuti. Impostare Binning e F / stop sulla base di luminosità prevista di campione. Impostare eccitazione filtro per bloccare e filtrare le emissioni di aprire, a meno che progettando di acquisire specifiche lunghezze d'onda solo di luce. Nel caso di costituzione DLIT 3D, impostare filtri di emissioni multiple di diverse lunghezze d'onda per permettere la localizzazione precisa della fonte. Set FOV da A a D a seconda del numero di topi o della regione di animali da acquisire. Selezionare A e B per 1 mouse, C per 2-3 topi, e D per 4-5 topi. </li><li> Clicca aggiungere nella procedura guidata immagine nel Pannello di controllo di acquisizione per aggiungere la sequenza di setup. </li><li> Avviare la sequenza di immagini, cliccando acquisire. In caso di costruzione DLIT 3D, immagini luminescenti saranno acquisite per i filtri delle emissioni a diverse lunghezze d'onda multiple. Immagini fotografiche della luce e strutturati saranno acquisite anche. </li><li> Durante l'acquisizione dell'immagine e modificare i livelli di immagine pannelli saranno visibili. Compila il più possibile dettagliate per ciascun esperimento in modifica immagine per assicurare un facile monitoraggio di immagini in tempi successivi e salvare le immagini. </li><li> ReRemove i topi da IVIS immagini da camera e restituirli alle loro gabbie. Osservare il recupero da unesthesia per assicurare i topi non sono state influenzate dalla procedura. Gli animali devono essere monitorati costantemente fino a quando non riprendersi completamente da anestesia (di solito 1-2 minuti). </li></ol> 4. Ex vivo Imaging e Analisi CFU per la quantificazione dei batteri nei polmoni <ol><li> Iniettare topi con luciferina intraperitoneale nello stesso modo come per l'imaging, appena prima di eutanasia. </li><li> Euthanize i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg pentobarbitol 5 minuti dopo l'iniezione luciferina. </li><li> Espianto i polmoni dei topi e il luogo in sterili petri-piatti con pinza sterile e forbici. </li><li> Luogo petri-piatto contenente organo espiantato in camera di imaging e di acquisire immagini bioluminescenza nello stesso modo come per il mouse tutto. </li><li> Dopo l'imaging, rimuovere organi espiantati da Petri con pinze sterili e omogeneizzare in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire e del tessuto piatto sul supporto più appropriato selettivo. Tessuto omogeneizzato può essere conservato -80 ° C per la ri-placcatura se fosse necessario. In alternativa, il tessuto omogeneizzato può essere utilizzato per l'estrazione del DNA o RNA per quantificare i numeri batterica da qPCR. </li></ol> 5. Analisi di Imaging Luminescenza <ol><li> Start "Imaging Software Vivere" e sfogliare i file di immagine. </li><li> Usare "Tool Palette 'per regolare le immagini. Clicca l'immagine Regolare di modificare la correzione / filtraggio impostazioni e min / max per le scale di colore individuali. </li><li> Utilizzare strumenti di ROI nella lista a tendina per la quantificazione dell'intensità luminosa. Seleziona il ROI forma, numero e dimensioni. Trascinare il ROI cornice alla regione di interesse sull'immagine. Assicurarsi che tutte le ROI sono della stessa dimensione e forma. Clicca ROI misura e salvare, copiare e / o esportare dati quantitativi. </li><li> Nel caso di DLIT ricostruzioni 3D, caricare sequenza di immagini tra cui l'immagine luce strutturata. Clicca topografia superficiale nello strumento Platte. Nella lista a discesa, fare clic sulla scheda Ricostruire per generare la topografia della superficie. Un pasticcio superficie apparirà nella finestra. </li><li> Seleziona ricostruzione 3D DLIT nello strumento Platte. Nella lista a tendina, selezionare la scheda Proprietà per impostare le proprietà dei tessuti e lo spettro sorgente. Muscolare è consigliato nella maggior parte delle circostanze. Nell'elenco a discesa, fare clic sulla scheda Analizza per selezionare la lunghezza d'onda per l'analisi. Fare clic sulla scheda Parametri e confermare i valori di default o regolare i parametri DLIT se necessario. Clicca sulla scheda Ricostruire per iniziare l'analisi 3D. </li><li> Quando la ricostruzione 3D è finito, la vista 3D mostrerà i risultati della ricostruzione 3D. Fare clic sulla scheda dei risultati per visualizzare i dati di analisi per la densità di fotoni, voxel e parametri dell'algoritmo DLIT. </li><li> Salvare e / o esportare i risultati delle analisi ricostruzione 3D in figure e file di dati. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Le immagini bioluminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti insieme ad un controllo del mouse non infetti sono mostrati in Figura 1. Il polmonare topi infettati con batteri bioluminescenti produrre segnale significativo dai polmoni (Figura 1). L'intensità di luminescenza è quantificato come flusso totale in un ROI (regione di interesse) (Figura 2). I dati quantitativi per l'intensità della luce è normalizzato per unità formanti colonia (CFU) di batteri ottenuti da polmoni per confermare che il segnale viene prodotto dai batteri bioluminescenti e può essere paragonato al controllo negativo. La posizione e l'intensità del segnale può essere ulteriormente analizzato da DLIT ricostruzione 3D della sorgente luminescente basata su tomografia della superficie del mouse 11. Queste analisi permettono la quantificazione e la localizzazione del segnale bioluminescente prodotto. I risultati di ricostruzione 3D di una fonte luminescente in topi infettati dimostra che la luce è prodotta dai polmoni del mouse (Figura 3). Le immagini ex vivo dei polmoni del mouse risultante confermare che luminescenza emessa dai polmoni, piuttosto che qualche altro tessuto o organo strettamente giustapposti (Figura 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Di imaging polmonare luminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti taggati con CBRluc. Controllo del mouse non infetti è a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. I topi sono stati infettati con batteri che esprimono CBRluc (n = 2) per via intratracheale. 10 minuti dopo l'iniezione luciferina, luminescenza immagini sono state acquisite per 10 minuti a 4 posizioni: dorsale, ventrale, lato sinistro e lato destro. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. L'intensità della luce quantitative da topi infettati con batteri che esprimono CBRluc. (A, B) le immagini di luminescenza di analisi del ROI e il flusso totale di luce quantificati dal ROI in posizione dorsale e ventrale, rispettivamente. Topi infetti sono a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. Luminescenza immagini sono state acquisite dai polmoni of topi infetti e non infetti con CBRlux (n = 2). L'intensità della luce intorno polmoni è stata quantificata mediante l'analisi del ROI. C) Immagini ex vivo di polmoni da non infetti (in alto) e infettati (in basso due set di polmoni) topi. Luciferina è stato iniettato 5 miniuts prima di eutanasia e le immagini sono state poi acquisite. I valori quantificati sono normalizzati a CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La ricostruzione 3D della fonte bioluminescenza (s) da un topo polmonare infettato. Il mouse è stato infettato da batteri che esprimono CBRluc per iniezione intratracheale. La sequenza di immagini è stata acquisita utilizzando filtri di emissione diversi di lunghezze d'onda di serie da 540 nm a 700 nm. Una sequenza di immagini è stato utilizzato per la ricostituzione 3D per fonte di luminescenza in soggetti animali che conteneva un imag strutturato. A) La tomografia per mouse è mostrato in diverse posizioni: davanti, dietro, destra e sinistra. Le sorgenti luminose sono mostrati come voxel (caselle rosse all'interno del mouse 3D) che si trovano all'interno del polmone come determinato dalla ricostruzione. B) Photon mappa densiy dei dati misurati e simulati. Confrontando i misurati e simulati curve di densità di fotoni fornire le informazioni di qualità della ricostruzione. Buon risultato di qualità ricostruzioni in simili densità misurati e simulati fotone.

<ol><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li>
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</ol>

Studi su animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Texas A &amp; M University.

Anche se dopo questi protocolli di solito provoca immagini di alta qualità, è importante prendere in considerazione alcuni punti chiave per ottenere dati precisi e coerenti da studi di imaging. Luminescenza immagini dovrebbero essere acquisite che hanno conti da 600 a 60.000 per assicurare che il segnale è al di sopra di fondo e la fotocamera non è saturo. Se il segnale ottenuto è minore di 600 le condizioni di esposizione deve essere regolata per incrementare la conta. Se il segnale ottenuto è di oltre 60.000 la fotoca...

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>Chetamina </td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina </td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Fetal plus</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catetere (22G x 1&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>Filo guida </td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>Otoscopio con speculum </td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Xenogen IVIS</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia gassosa XGI-8</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Living Imaging</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coni nasali trasparenti</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Divisore deflettore di luce </td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule tumorali, cellule staminali, specifici tipi di cellule immunitarie, agenti patogeni virali, parassiti e batteri possono essere seguiti in tempo reale all&#39;interno di animali viventi 1-2. Applicazione di imaging bioluminescenza per lo studio di agenti patogeni presenta vantaggi rispetto alle strategie tradizionali per l&#39;analisi delle infezioni in modelli animali 3-4. Le infezioni possono essere visualizzati all&#39;interno di un singolo animale, nel tempo, senza richiedere l&#39;eutanasia per determinare la posizione e la quantità del patogeno. L&#39;imaging ottico permette la visione completa di tutti i tessuti e organi, piuttosto che il campionamento dei siti precedentemente nota l&#39;infezione. Inoltre, l&#39;accuratezza della inoculazione in tessuti specifici possono essere direttamente determinato prima di portare gli animali in avanti che sono stati inoculati senza successo in tutto l&#39;intero esperimento. Variabilità tra gli animali possono essere controllati per, dal momento che l&#39;imaging permette ad ogni animale da seguire individualmente. Imaging ha il potenziale per ridurre notevolmente il numero degli animali necessari a causa della possibilità di ottenere dati da numerosi punti di tempo, senza dover tessuti campione per determinare il carico patogeno 3-4. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le infezioni negli animali vivi utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza di ceppi di batteri ricombinanti che esprimono luciferasi. Lo scarabeo clic (CBRLuc) e luciferases lucciola (FFluc) utilizzano come substrato luciferina 5-6. La luce prodotta da entrambe le CBRluc e FFluc ha una lunghezza d&#39;onda largo da 500 nm a 700 nm, rendendo questi giornalisti luciferases eccellente per l&#39;imaging ottico in modelli animali che vivono 7-9. Ciò è dovuto soprattutto lunghezze d&#39;onda della luce superiore a 600 nm sono necessari per evitare l&#39;assorbimento da parte dell&#39;emoglobina e, quindi, i viaggi attraverso il tessuto dei mammiferi in modo efficiente. Luciferasi è geneticamente introdotto i batteri per produrre segnale luminoso 10. I topi sono polmonare inoculati con batteri bioluminescenti intratracheally per consentire il monitoraggio delle infezioni in tempo reale. Dopo l&#39;iniezione luciferina, le immagini sono acquisite con il Imaging System IVIS. Durante l&#39;imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando un XGI-8 Sistema Gas Anethesia. Le immagini possono essere analizzati per localizzare e quantificare la sorgente del segnale, che rappresenta il sito di infezione batterica (s) e il numero, rispettivamente. Dopo l&#39;imaging, la determinazione CFU viene effettuata sul tessuto omogeneizzato per confermare la presenza di batteri. Diverse dosi di batteri vengono utilizzati per correlare numeri batterica con luminescenza. L&#39;imaging può essere applicato allo studio della patogenesi e la valutazione dell&#39;efficacia di composti antibatterici e vaccini.

Metodi per l&#39;imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l&#39;imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

L'imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule cancerose, cellule staminali, specifici...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere un'immagine quantitativa di un'infezione in animali vivi che consenta la localizzazione dell'organismo infettante nei tessuti e negli organi dell'ospite. I topi anestetizzati vengono innanzitutto infettati per via intratraqueale con batteri bioluminescenti. Successivamente, ai topi infetti viene somministrato Luciferina, che permette l'imaging in vivo mediante il sistema IVIS.Dopo aver ottenuto immagini dell'intero organismo, i polmoni infetti vengono prelevati. L'analisi degli organi isolati può essere eseguita per dimostrare la reale localizzazione dell'agente patogeno. Dopo l'acquisizione delle immagini, i polmoni vengono omogeneizzati e sottoposti a diluizione su terreno di coltura batterica per la quantificazione del carico microbico.In definitiva, si ottengono risultati che mostrano in tempo reale la localizzazione e il numero di patogeni presenti all'interno dell'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i patogeni possono essere visualizzati e monitorati in animali vivi mediante imaging in tempo reale, fornendo informazioni sulle caratteristiche spaziali dell'infezione microbica. A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Mihi Chang, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio, e SWAT Cillo, un ricercatore nel mio laboratorio.Iniziare con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione anestetica pre-miscelata contenente 100 microgrammi di chetamina e 10 microgrammi di xilazina per grammo di peso del topo, in topi valve C di età compresa tra le sei e le dodici settimane. Riposizionare i topi nelle loro gabbie fino a quando l'anestesia non fa effetto. Per verificare che l'anestesia sia completa, premere la pianta del piede di ciascun topo e accertarsi che non si verifichi alcuna reazione riflessa del piede.Una volta che gli animali sono completamente anestetizzati, prendere un topo e posizionarlo sul dispositivo di intubazione. Disporre il topo in posizione supina. Utilizzare del nastro adesivo per fissare le zampe e le braccia del topo sul supporto.Fissare un elastico al supporto per intubazione. Quindi posizionarlo sotto gli incisivi superiori del topo. Una volta immobilizzato il topo, utilizzare la pinzetta per estrarre delicatamente la lingua dalla bocca.Successivamente, inserire delicatamente lo specillo con l'otoscopio all'interno della bocca del topo e individuare l'apertura della laringe, situata anteriormente all'esofago sul lato ventrale dell'orofaringe. Una volta identificata l'apertura della laringe, inserire un catetere da 22 gauge lungo un pollice contenente un filo guida nella trachea fino a quando il connettore del catetere raggiunge gli incisivi. Rimuovere il filo guida e collegare il catetere alla pompa di plastica.Quindi spingere aria nel catetere. Il torace del topo si gonfierà se l'intubazione è corretta. Una volta confermata la corretta posizione del catetere, pipettare 50 microlitri di soluzione batterica bioluminescente alla concentrazione desiderata all'interno del catetere e collegare una siringa da un millilitro contenente 50 microlitri di aria per spingere la soluzione nei polmoni del topo.Due o tre volte, rimuovere il catetere e riposizionare il topo nella sua gabbia per permettergli di riprendersi dall'anestesia. Prima di eseguire l'immagine bioluminescente, anestetizzare i topi utilizzando isoflurano. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, rimuoverli dalla camera di induzione e applicare delicatamente un unguento oftalmico per proteggere gli occhi dell'animale.Durante l'acquisizione delle immagini, posizionare i topi nella camera di imaging, collegando ciascuno a un boccaglio presente sul manifold per l'anestesia. Utilizzare un paraluce tra i topi per evitare la riflessione della luce tra soggetti animali adiacenti. Infine, iniettare a ciascun topo per via intraperitoneale 150 microgrammi per grammo di peso corporeo di Lucifer.Lasciare che la luciferina si disperda per 10 minuti all'interno del corpo degli animali. Quindi iniziare l'acquisizione delle immagini. Avviare il software di imaging in vivo e inizializzare il sistema di imaging IVIS.Per impostare prima i parametri, fare clic su configurazione della sequenza. Quindi selezionare la modalità di imaging a luminescenza e fotografico. Selezionare immagini luminose fotografiche e a luce strutturale come parte della sequenza di immagini per abilitare la ricostruzione tridimensionale DLIT.Successivamente, impostare il tempo di esposizione su un minuto. Quindi regolare il binning su medio e il diaframma su uno. Impostare il filtro di eccitazione su blocco e i filtri di emissione su aperto per abilitare la ricostruzione 3D mediante l'utilizzo di più filtri a diverse lunghezze d'onda.Per consentire una localizzazione accurata della sorgente del segnale, selezionare il campo visivo (FOV) corrispondente al numero di topi da visualizzare. Una volta definiti tutti i parametri, fare clic su aggiungi nella procedura guidata dell'immagine nel pannello di controllo dell'acquisizione per aggiungere la configurazione della sequenza e fare clic su acquisisci per iniziare la sequenza di acquisizione. Registrare i dettagli e le condizioni sperimentali nella finestra di modifica dell'immagine e salvare le immagini.Infine, rimuovere i topi dalla camera di imaging e riportarli nelle loro gabbie. Monitorare costantemente gli animali fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Per l'imaging dei tessuti, eutanasizzare umanamente i topi.A questo punto, prelevare asetticamente i polmoni di ogni topo e trasferire gli organi in una piastra di Petri sterile. Posizionare la piastra di Petri contenente i polmoni infetti all'interno della camera di imaging ed acquisire le immagini di bioluminescenza nello stesso modo descritto precedentemente in questo video. Una volta ottenute le immagini, rimuovere la piastra di Petri dalla camera di imaging e, utilizzando pinze sterili, trasferire i polmoni in un tubo contenente un millilitro di PBS sterile; omogeneizzare i polmoni per due-cinque minuti utilizzando un omogeneizzatore.Preparare diluizioni seriali degli omogenati polmonari in PBS sterile. Successivamente, piastrare 100 microlitri di ogni diluizione su piastre di Petri contenenti mezzo selettivo. Incubare le colture a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie batteriche diventano chiaramente visibili.Quindi conta le UFC per valutare il livello di infezione. Avvia il software di imaging in tempo reale e apri i file di immagine desiderati dal browser dei file. Nella barra degli strumenti.Fare clic su "adjust image" per modificare le impostazioni di correzione e filtraggio, nonché le soglie della scala cromatica. Per quantificare l'intensità della luminescenza, utilizzare gli strumenti di regione di interesse (ROI) presenti nel menu a tendina, selezionare la forma, il numero e le dimensioni dell'ROI. Quindi fare clic su "ROI measurement" e salvare l'output dei dati quantitativi per ricostruire le immagini 3D.Caricare innanzitutto la sequenza di immagini, inclusi i fotogrammi con luce strutturata. Fare clic su topografia superficiale nella barra degli strumenti. Quindi, nell'elenco a discesa, selezionare la scheda ricostruzione per generare una topografia superficiale.Successivamente, selezionare la ricostruzione 3D DILT dalla tavolozza degli strumenti. Fare clic sulla scheda proprietà nell'elenco a discesa e impostare le proprietà del tessuto e lo spettro della sorgente su muscolo. Cliccare sulla scheda analisi e selezionare la lunghezza d'onda per l'analisi.Quindi fare clic su "start". Una volta regolati tutti i parametri, fare clic su "reconstruct" per avviare l'analisi 3D. Al termine della ricostruzione 3D, selezionare la "3D view" per visualizzare i risultati, cliccando sulla scheda dei risultati; è possibile esaminare la densità di fotoni, i voxel dei dati e i parametri dell'algoritmo, salvare i risultati ed esportare i dati e le immagini per ulteriori analisi.Come mostrato in questa figura, i due topi a destra, infettati per via intratracheale con 10 alla sesta UFC di batteri bioluminescenti, producono un segnale intenso proveniente dalla zona polmonare, mentre il topo non infetto a sinistra non ne produce alcuno. Un'analisi simile, effettuata su polmoni dissecati provenienti esclusivamente da topi infetti, conferma che la luminescenza proviene dai polmoni e non da qualche altro tessuto strettamente adiacente. Il segnale proveniente dal campione può essere facilmente quantificato come flusso totale all'interno di una regione di interesse.Un'analisi di tomografia conferma che la posizione della luminescenza mostrata in queste immagini come riquadri rossi si trova all'interno dell'area contenente i polmoni del topo, come determinato dalla ricostruzione 3D. Infine, la somiglianza tra la curva di densità dei fotoni misurata a sinistra e la curva di densità dei fotoni simulata a destra attesta la buona qualità della ricostruzione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come effettuare l'immagine di animali infettati con precedent e analizzare le immagini per la localizzazione e la quantificazione della reminiscenza.

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