Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e valutare in vivo l'arteria di alimentazione del linfonodo inguinale. Questo risultato si ottiene innanzitutto creando un lembo cutaneo mediante accurata dissezione della cute nella regione inguinale del topo, sovrastante il linfonodo inguinale. Successivamente, il tessuto connettivo che ricopre l'area del linfonodo viene staccato.

Successivamente, il tessuto adiposo circostante deve essere rimosso per esporre la vascolarizzazione arteriosa di afflusso del linfonodo. Infine, i cambiamenti nella vascolarizzazione del linfonodo vengono visualizzati e valutati mediante microscopia intravitale P. Sebbene, la preparazione che vedrete oggi riguardi la microcircolazione del linfonodo inguinale, le tecniche chirurgiche possono essere utilizzate anche per altre preparazioni, come il muscolo scheletrico e il cervello.

Generalmente, quando si esegue questa tecnica, i principianti incontrano difficoltà per due motivi principali. Il primo è che si ha a che fare con un animale vivo, e il secondo è che, poiché si sta eseguendo un intervento chirurgico su un'area molto piccola, qualsiasi tipo di disturbo al vaso stesso o alla zona circostante potrebbe avere un impatto negativo, compromettendo l'esperimento che si intende condurre. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale per il successo.

Esistono diversi passaggi complessi che risultano difficili da comprendere passando semplicemente dal testo all'applicazione pratica della tecnica. È fondamentale osservarla per eseguirla correttamente. Con grande successo.

Il topo viene prima anestetizzato e l'area chirurgica viene rasata. Per i dettagli, consultare il manoscritto. Successivamente, il topo può essere posizionato su un piano chirurgico trasparente in posizione supina.

Fissare il mouse alla tavola chirurgica bloccando ogni zampa con del nastro adesivo. Il giorno prima dell'esperimento, preparare il composto ThermoS 180 4 seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, utilizzando una normale piastra di Petri monouso come stampo, versare il composto ad uno spessore di circa un quarto di pollice e lasciarlo polimerizzare tutta la notte. Rimuovere il composto dalla piastra di Petri ed appoggiarlo sulla tavola chirurgica.

Posizionare il topo anestetizzato e depilato sotto la lente stereoscopica. Eseguire un'incisione mediana lungo la superficie ventrale della cavità addominale utilizzando pinze in acciaio inossidabile numero cinque e forbici a lama dritta con molla. Proseguire quindi l'incisione mediana in modo diagonale verso gli arti e retrarre la pelle verso la colonna vertebrale.

Una volta che il ln è chiaramente visibile, fissare la pelle retratta utilizzando spilli da entomologia in acciaio inossidabile e pinzette rivestite in epossidico inox sul supporto per sigaro 180 4. Aggiungere soluzione salina fisiologica o PSS sulla zona.

Successivamente, rimuovere il sottile strato di tessuto connettivo che ricopre la zona intorno al linfonodo. Utilizzando pinzette, sollevare con cura piccole porzioni di tessuto connettivo ed escinderle dal linfonodo. Usando forbici a molla, quindi rimuovere il tessuto adiposo sovrastante e circostante il linfonodo fino a esporre il letto microvascolare.

Per questo passaggio, è fondamentale fare attenzione a non entrare mai in contatto con la vascolarizzazione di interesse mediante strumenti chirurgici né a danneggiare i vasi esercitando una pressione eccessiva su di essi durante la manipolazione dei tessuti circostanti. Il grasso viene rimosso meglio dal ln allentando il tessuto connettivo, tenendo insieme l'adipe con una pinza e quindi rimuovendo delicatamente il tessuto adiposo fino a quando il campo visivo non risulta libero. Una volta rimossi i tessuti connettivo e adiposo, si possono visualizzare il segmento arterioso principale adiacente al LN e la vena accompagnante sovrastante.

Dopo aver esposto il segmento vascolare di interesse sotto la lente del microscopio stereoscopico, fissare il preparato sul microscopio intravitale. Configurare le linee di superfusione e di aspirazione. Durante questa fase della procedura, è essenziale che il tessuto esposto venga sempre mantenuto in superfusione con la soluzione PSS equilibrata.

La sovrafusione di PSS avviene per gravità. Il flusso proviene da un serbatoio iniziale verso un serbatoio riscaldato a bagno maria, che viene perfuso con una miscela di 5% di anidride carbonica in azoto, quindi lungo una linea di gocciolamento a una velocità di 10 millilitri al minuto. Deve essere utilizzata una linea di aspirazione per continuare a rimuovere il PSS sovrafuso dalla preparazione posizionandola alla base della lemba cutanea; successivamente, si devono verificare e regolare la temperatura del bagno d'acqua circolante e la velocità della sovrafusione di PSS per raggiungere una temperatura ottimale di circa 36 gradi Celsius.

Durante tutta la preparazione, lasciare che la vascolarizzazione si equilibri con la PSS per almeno 60 minuti. Accertarsi che l'animale non diventi ipotermico utilizzando un termometro rettale e fornire una lampada riscaldante esterna. Mentre la PSS si sta equilibrando, quantificare il diametro del vaso.

Utilizzare i calibri video in diversi momenti per assicurarsi che il vaso si sia stabilizzato: la stabilizzazione è definita come la dimensione del diametro che rimane costante entro cinque micrometri per un periodo di 20 minuti. Le misurazioni del diametro vengono registrate su un computer utilizzando il software Chart Lab. Al termine del periodo di equilibrazione, valutare lo stato di salute del vaso mediante un agonista specifico per il muscolo liscio, come la fenilefrina, come mostrato qui con la fenilefrina.

Aggiungere l'agonista alla suse. Otto agonisti devono essere valutati a ogni log, con incremento della concentrazione cumulativa dell'agonista man mano che viene aggiunto al destino SUP tra le somministrazioni di ciascun agonista. Una fase di lavaggio utilizzando PSS deve essere eseguita per 30 minuti o fino a quando il vaso non ritorna al diametro di riposo.

Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di un linfonodo inguinale dopo il periodo di equilibrio. L’alimentazione dell’arteria con soluzione salina fisiologica consente di ottenere un’immagine chiara che permette l’identificazione sia dell’arteria di alimentazione, indicata dalla freccia rossa, sia della vena, indicata dalla freccia verde, che irrora il linfonodo inguinale. Il grafico mostra una risposta vasocostrittoria tipica di un’arteriola linfonodale inguinale all’aggiunta cumulativa di fenilefrina SUP fusa in soluzione salina fisiologica.

Da una concentrazione di 10 alla meno nove moli a 10 alla meno cinque moli, la presenza di una marcata vasocostrizione suggerisce una normale funzione del muscolo liscio presente nell'arteria. In questo grafico, si osserva una tipica risposta vasocoattiva all'aggiunta cumulativa di acetilcolina nel sale fisiologico. È mostrata una concentrazione da 10 alla meno nove moli a 10 alla meno cinque moli.

La presenza di una vasodilatazione robusta suggerisce una normale funzione endoteliale presente nell'arteria. Nel tentativo di eseguire questa preparazione, una delle cose fondamentali da ricordare è ridurre al minimo il disturbo al vaso e alla zona circostante per massimizzare il successo. Dopo questa procedura, possono essere introdotti altri metodi, come la fluorescenza, per esplorare altre funzioni cellulari, quali il traffico cellulare.

Dopo lo sviluppo di questa tecnica, essa ha aperto la strada a un nuovo campo di studio, l'immunologia vascolare, collegando le discipline dell'immunologia e della biologia vascolare.