Name: La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri la tecnica di trapianto di tessuto per creare embrioni chimerici e studiare le proprietà di segnalazione dell'ectoderma cefalico superficiale durante lo sviluppo craniofacciale.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla R01-R01-DE018234 e DE019638.

1. Preparazione del tessuto del donatore <ol><li> Preparare terreni di coltura, affinare le spine di vetro, affilare gli aghi di tungsteno. </li><li> Raccogliere embrione dal guscio, lavare in gelide PBS. <ol class="lalpha"><li> Usando una siringa da 10 ml e 18 gauge rimuovere 1,0 ml di albumina da l'estremità appuntita del guscio d'uovo. </li><li> Fai un piccolo foro sulla parte superiore del guscio utilizzando il punto di forbici, e poi tagliare un'apertura circolare per esporre l'embrione </li></ol></li><li> Togliere la testa e il luogo in DMEM (siero libero, temperatura ambiente) </li><li> Sezionare processo fronto-nasale dall'embrione (o sito altri donatori, come processo mascellare o mandibolare) </li><li> Digest in 2.4U / mL dispasi in PBS in ghiaccio per 20 minuti </li><li> Coprire i tessuti con DMEM con BSA 1% per fermare la digestione </li><li> Utilizzare l'ago di tungsteno appuntito per ectoderma separati, mesenchima, e neuroectoderma </li><li> Conservare il tessuto innesto in DMEM BSA 1% in ghiaccio fino host è pronto per i trapianti </li></ol> 2. Preparare l'Ostia <ol><li> Esporre l'embrione <ol class="lalpha"><li> Usando una siringa da 10 ml e 18 gauge rimuovere 1,0 ml di albumina da l'estremità appuntita del guscio d'uovo. </li><li> Fai un piccolo foro sulla parte superiore del guscio utilizzando il punto di forbici. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sul foro, e poi tagliare un'apertura circolare per esporre l'embrione. </li></ol></li><li> Con 2 coppie di pinze, afferrare la amnios e delicatamente strappare a fare un buco. </li><li> Ruotare la testa mettendo una coppia di pinze sull'occhio destro e pressione. Tenendo la testa ferma, utilizzare un ago di tungsteno per rimuovere l'ectoderma ospitare per accogliere l'innesto. </li><li> Trasferire l'innesto per l'host utilizzando una pipetta di vetro. </li><li> Posizionare l'innesto di sostituire l'ectoderma rimosso. Inserire un perno di vetro in ogni angolo del tessuto innestato al pin l'innesto in posizione. Per rendere pin vetro, tirare un tubo microcapillare ad un punto preciso su una fiamma alcol. </li><li> Luogo nastro saldamente sopra il buco e tornare embrione per l'incubatore per la lunghezza di tempo adeguato per l'analisi. </li><li> vedi anche: 9 </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Per valutare chimere, gli embrioni devono essere raccolti ed elaborati per l'analisi della distribuzione di host e dei tessuti del donatore. Per il rilevamento di cellule quaglia, immunoistochimica con l'anticorpo QcPN (descritto in: 3) è impiegata, e per l'individuazione di cellule di topo, ibridazione in situ su sezioni di paraffina viene utilizzata 6. Cellule del donatore deve essere limitato al epitelio, e ci dovrebbe essere alcuna prova donatore di tessuti mesenchimali (Figura 1). La presenza di cellule del donatore isolate nel mesenchima indica la presenza di contaminazione da cellule della cresta neurale, che si confondono ogni interpretazione morfologica per l'influenza di queste cellule in molti aspetti dello sviluppo del viso (per esempio, 10). Una volta convinto che la tecnica dell'innesto è libero di contaminare mesenchima, misure di ulteriore esito morfologico o molecolare può essere utilizzata per valutare le chimere. Per i nostri scopi, abbiamo rilevato la presenza di cartilagini e ossa ectopica che corrispondevano a duplicazioni della mascella superiore, che sono state indotte dai tessuti trapiantati (Figura 2), e cambiamenti molecolari nei tessuti mesenchimali in risposta alla ectoderma innestati (Figura 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Valutazione del chimerismo (A) Anti-QcPN colorazione è usato per rilevare le cellule di quaglia quaglia-chick chimere. Non ci sono prove di colorazione nel mesenchima. (B) L'ibridazione in situ è utilizzato per rilevare l'espressione di trascrizioni B2 SINE nel topo-chick chimere. Espressione è limitata alla ectoderma che comprende l'innesto. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Colorazione Figura 2. Tricromica mostra duplicazione dello scheletro mascellare superiore in (A) quaglia-chick chimera, e (B) topo-chick chimere. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. L'ectoderma regultes espressione genica nel mesenchima. (A) Normale Bmp7 espressione nel mesenchima di un embrione di pollo (radioattive ibridazione in situ con positivo segnale pseudo-colore rosso in Adobe Photoshop). (B) Bmp7 espressione è indotta nel mesenchima adiacente al trapianto (Freccia) in embrioni chimerici.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Usando questo metodo di trapianto ha permesso di determinare che l&#39;ectoderma contiene informazioni di segnalazione che regola la polarità dorso-ventrale e l&#39;estensione prossimo-distale della mascella superiore. La somiglianza dei risultati quando si usa quaglia o ectoderma mouse e la conservazione dei segnali molecolari in questo tessuto tra le molte specie 6,11 indica che questo è un centro altamente conservato di segnalazione tra i vertebrati. Inoltre, altri ricercatori hanno usato tecniche simili p...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Università della California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di Petri da 35x10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per ago</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Ago in tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcapillare</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Porta-lama</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Lama da rasoio</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

la valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

L&#39;accessibilità degli embrioni aviaria ha aiutato embriologi sperimentali capire il destino delle cellule durante lo sviluppo e il ruolo delle interazioni tessuti che regolano patterning e la morfogenesi dei vertebrati (ad esempio, 1, 2, 3, 4). Qui, illustrare un metodo che sfrutta questa accessibilità per testare la segnalazione e le proprietà patterning dei tessuti durante lo sviluppo ectodermica del viso. In questi esperimenti, creiamo quaglia-chick 5 o topo-chick 6 chimere trapiantando l&#39;ectoderma cefalico superficie che copre la mascella superiore da quaglia o mouse sulla entrambi della stessa regione o di una regione ectopica di embrioni di pollo. L&#39;uso di quaglia come tessuto del donatore per il trapianto in pulcini è stato sviluppato per trarre vantaggio da un marker nucleolare presente in quaglie, ma non le cellule pulcino, permettendo così agli investigatori di distinguere host e tessuti del donatore 7. Allo stesso modo, un elemento ripetitivo è presente nel genoma del topo ed è espressa ubiquitariamente, che ci permette di distinguere host e tessuti del donatore nel topo-chick chimere 8. L&#39;uso di ectoderma mouse come tessuto del donatore amplieranno enormemente la nostra comprensione di queste interazioni dei tessuti, perché questo ci permetterà di testare le proprietà di segnalazione di ectoderma derivate da embrioni mutanti vari.

Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stato progettato per verificare la segnalazione e le proprietà di patterning ectoderma cefalico superficie durante lo sviluppo cranio-facciale.

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

L'accessibilità degli embrioni aviari ha aiutato gli embriologi sperimentali a comprendere il destino delle cellule durante lo sviluppo e il ruolo dei tessuti...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare embrioni chimerici trapiantando l'ectoderma da embrioni donatori nella mascella superiore in via di sviluppo di embrioni di pollo. Questo viene realizzato innanzitutto rimuovendo l'ectoderma donatore per il trapianto. Successivamente, il sito ospite viene preparato per l'innesto. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel posizionare il tessuto donatore sul sito ospite e fissare innesto in sede. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'innesto esclusivo dell'ectoderma donatore e, attraverso analisi molecolari e morfologiche, è possibile determinare la funzione del derma ricostituito del donatore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come l'identificazione del ruolo di vari tessuti durante la morfogenesi.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Diane, un'investigatrice senior del nostro laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, preparare i mezzi e assicurarsi che tutte le soluzioni necessarie siano disponibili e alla temperatura corretta. Successivamente, indossando un'adeguata protezione oculare, tirare le micropipette capillari fino a formare una punta fine sopra una fiamma di alcol.Per realizzare perni di vetro, affilare le punte di tungsteno tenendole nella fiamma di una torcia a propano. Iniziare l'estrazione dell'embrione donatore dal guscio posizionando un pezzo di nastro adesivo su una estremità dell'uovo. Quindi utilizzare la punta di un ago da dissezione per creare un piccolo foro al centro del nastro.Inserire una siringa da 10 millilitri e un ago ipodermico da 18 gauge nel foro ed estrarre un millilitro di albume dall'uovo. Quindi, utilizzando un ago da dissezione, praticare un piccolo foro nella parte superiore del guscio. Apporre un secondo pezzo di nastro per coprire questo foro.Praticare un'apertura circolare nell'uovo utilizzando due paia di pinzette. Afferrare l'embrione e posizionarlo in una piastra contenente PBS ghiacciato per il lavaggio. Dopo aver rimosso la testa dell'embrione, collocarla in una piastra per colture cellulari contenente DMEM senza siero a temperatura ambiente.Posizionare la piastra sotto il microscopio stereoscopico tenendo la testa con una pinzetta. Utilizzare forbici a molla per dissezionare grossolanamente la mascella superiore e il lagon dal resto della testa. Successivamente, utilizzando un portalametta con una lama di rasoio affilata, rimuovere il processo nasale frontale dalla mascella superiore.Utilizzare una pipetta per trasferire il processo nasale frontonale in una piastra Petri da 30 millimetri contenente un volume sufficiente di diss in PBS e incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare la soluzione dispa senza disturbare il tessuto. Quindi coprire completamente i tessuti con DMEM contenente 1% BSA.Per arrestare la digestione, trasferire il tessuto in una nuova piastra di coltura. Quindi, lavorando al microscopio stereoscopico, tenere il tessuto con un ago di tungsteno non affilato utilizzando un ago di tungsteno affilato.Separare l'ectoderma staccandolo dagli altri tessuti. Una volta preparato, conservare il tessuto da trapiantare in DMEM con BSA su ghiaccio fino a quando l'ospite non sarà pronto per il trapianto. Utilizzando il metodo precedentemente dimostrato, creare una finestra nell'uovo di pollo.Posizionare l'uovo contenente l'embrione sotto il microscopio stereoscopico utilizzando due paia di pinzette. Afferrare la membrana IGN e l'amnios e strappare delicatamente per creare un'apertura ed esporre l'embrione ospite. Ruotare la testa posizionando un paio di pinzette sull'occhio destro ed esercitando pressione mentre si tiene ferma la testa.Utilizzare un paio di pinze e un ago per rimuovere il derma dell'ospite al fine di accogliere l'innesto. Aggiungere due microlitri di rosso neutro alla piastra di Petri contenente gli innesti preparati. Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire l'innesto nell'ospite.Posizionare l'innesto al posto dell'ectoderma rimosso. Inserire un perno di vetro in ogni angolo del tessuto innestato per fissare l'innesto in posizione dopo l'innesto. Chiudere accuratamente la finestra con del nastro adesivo.Riportare l'embrione nell'incubatrice fino allo stadio di sviluppo richiesto per l'analisi; questa immagine mostra un tessuto proveniente da un embrione di quaglia URA che è stato colorato con un anticorpo specifico per la quaglia anti Q-C-P-N-A. Il tessuto trapiantato si trova tra le due frecce. Non vi è evidenza di colorazione QCPN nel tessuto di tipo selvatico proveniente da un chimera topo-quaglia qui mostrato. Ancora una volta, il tessuto trapiantato si trova tra le due frecce in C, ibridazione con una sonda specifica per la sequenza ripetitiva segnale B due.L'analisi dei geni della classe uno rivela che l'espressione del marcatore B due è limitata all'ome che comprende l'innesto mostrato qui come immagine di un chimera quaglia-pulcino, colorata con la tecnica della tri-cromatura che rende il collagene e l'osso di colore blu. La duplicazione dello scheletro della mascella superiore è visibile come indicato dalla freccia. Questa immagine mostra una chimera topo-pulcino, nuovamente colorata con la tecnica della tri-cromatura.Si osserva una duplicazione dello scheletro della mascella superiore. Questa immagine mostra l'ibridazione radioattiva in situ dell'espressione normale di BMP7 nel mesenchima di un embrione di pollo trapiantato, mostrato qui come tessuto proveniente da un chimera topo-pollo. È possibile osservare che l'espressione di BMP7 è indotta nel mesenchima adiacente al trapianto, come indicato dalla freccia.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare embrioni di pollo per valutare i meccanismi che regolano lo sviluppo della regione frontale e del processo nasale.

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L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

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