La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare embrioni chimerici trapiantando l'ectoderma da embrioni di donatori alla mascella superiore in via di sviluppo di embrioni di pollo. Ciò si ottiene rimuovendo prima il derma del donatore per il trapianto. Quindi il sito ospite viene preparato per l'attecchimento.

La fase finale della procedura consiste nel posizionare il tessuto del donatore sul sito ospite e fissare l'innesto in posizione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'attecchimento esclusivo dell'ectoderma del donatore e, attraverso l'analisi molecolare e morfologica, è possibile determinare la funzione del derma recod del donatore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come l'identificazione del ruolo di vari tessuti durante la morfogenesi.

A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Diane, che è una ricercatrice senior del nostro laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, preparare il terreno e assicurarsi che tutte le soluzioni necessarie siano accessibili e alla temperatura corretta. Quindi, indossando un'adeguata protezione per gli occhi, tirare i microtubi capillari fino a una punta fine su una fiamma di alcol.

Per fare i perni di vetro, affilare gli aghi di tungsteno tenendoli nella fiamma di una torcia a propano. Inizia l'estrazione dell'embrione donatore dal guscio posizionando un pezzo di nastro adesivo sull'estremità dell'ovulo. Shell quindi utilizzare la punta di un ago di dissezione per creare un piccolo foro al centro del nastro.

Inserire una siringa da 10 millilitri e un ago ipodermico calibro 18 nel foro e rimuovere un millilitro di albumina dall'uovo. Quindi, utilizzando un ago da dissezione, praticare un piccolo foro sulla parte superiore del guscio. Metti un secondo pezzo di nastro adesivo per coprire questo buco.

Taglia un'apertura circolare nell'uovo usando due paia di pinze. Afferra l'embrione e mettilo in un piatto di PBS ghiacciato per lavarlo. Dopo che la testa dell'embrione è stata rimossa, metterla in una piastra di coltura tissutale contenente DMEM a temperatura ambiente, privo di siero.

Posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione tenendo la testa con una pinza. Usa le forbici a molla per sezionare grossolanamente la mascella superiore e il lagon dal resto della testa. Quindi, utilizzando un portalama con una lama di rasoio affilata, tagliare il processo nasale frontale dalla mascella superiore.

Utilizzare una pipetta per trasferire il processo nasale frontone in una piastra di Petri da 30 millimetri contenente un volume sufficiente di diss in PBS e incubare su ghiaccio per 20 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare la soluzione dispa senza disturbare il tessuto. Quindi coprire completamente i tessuti con DMEM contenente l'1% di BSA.

Per fermare la digestione, trasferire il tessuto in un nuovo piatto di coltura. Quindi lavorare al microscopio da dissezione. Tenere il fazzoletto con un ago di tungsteno non affilato utilizzando un ago di tungsteno affilato.

Separare l'ectoderma staccandolo dagli altri tessuti. Una volta preparato, conservare il tessuto dell'innesto in DMEM con BSA su ghiaccio fino a quando l'ospite non è pronto per il trapianto. Utilizzando il metodo precedentemente dimostrato, crea una finestra nell'uovo di gallina.

Posizionare l'ovulo contenente l'embrione al microscopio da dissezione utilizzando due paia di pinze. Afferrare la membrana IGN e l'amnio e strappare delicatamente per fare un buco ed esporre l'embrione ospite. Ruota la testa posizionando un paio di pinze sull'occhio destro e applicando pressione tenendo ferma la testa.

Usa una lingua e un ago per rimuovere il derma ospite per accogliere l'innesto. Aggiungere due microlitri di rosso neutro alla capsula di Petri contenente gli innesti preparati. Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire l'innesto nell'ospite.

Posizionare l'innesto in posizione per sostituire l'ectoderma rimosso. Inserire uno spillo di vetro in ogni angolo del tessuto innestato per fissare l'innesto in posizione Dopo l'attecchimento. Chiudi bene la finestra con del nastro adesivo.

Riportare l'embrione nell'incubatrice fino allo stadio di sviluppo richiesto per l'analisi, questa immagine mostra il tessuto di un pulcino di quaglia URA che è stato colorato con anticorpi specifici per quaglia anti Q-C-P-N-A. Il tessuto innestato si trova tra le due frecce. Non ci sono prove di colorazione QCPN nel tessuto di tipo meen da uno specchio di carillon di pollo di topo è visto qui Ancora una volta, il tessuto innestato si trova tra le due frecce in C due ibridazione con approvazione specifica per il segno B due sequenza ripetitiva.

Nei geni di classe uno speculari rivela che l'espressione del segno B due è limitata all'ome che comprende l'innesto mostrato qui come un'immagine di un pulcino di quaglia che è stato tinto in tricromia, la colorazione in tricromo rende il collagene e l'osso di colore blu. La duplicazione dello scheletro della mascella superiore è visibile come indicato dalla freccia. Questa immagine mostra uno specchio per carillon di pulcino di topo che è stato nuovamente tinto in tricromia.

Si osserva una duplicazione dello scheletro della mascella superiore. Questa immagine mostra l'ibridazione radioattiva in C 2 dell'espressione normale di BMP sette nel mechy di un embrione di pollo zatterato mostrato qui è il tessuto di uno specchio di carillon di pollo di topo. Si può vedere che l'espressione di BMP sette è indotta nel mechim adiacente all'innesto, come indicato dalla freccia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare gli embrioni di pollo per valutare i meccanismi che regolano lo sviluppo del processo frontale e nasale.