Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare se un agente terapeutico candidato inibisce efficacemente la crescita delle cellule M-P-N-S-T innestate nel nervo sciatico di topi immunodeficienti. Ciò si ottiene rimuovendo prima le cellule tumorali da un pallone di tessuto, lavandole e sospendendole nuovamente alla giusta concentrazione. Il secondo passo della procedura consiste nell'esporre chirurgicamente il nervo sciatico e quindi iniettare il nervo con 5.000 cellule.

Il passo successivo consiste nel determinare il successo dell'innesto utilizzando l'imaging in vivo, basato sulla luce, randomizzando il CIN ai gruppi di studio e all'inizio della terapia con l'agente terapeutico candidato. La fase finale della procedura consiste nel raccogliere i tumori 30 giorni dopo l'innesto e analizzare gli effetti che l'agente terapeutico candidato ha avuto sul tumore. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano se l'agente terapeutico ha diminuito la crescita tumorale attraverso metodi come il confronto dei pesi tumorali, l'osservazione dei tassi relativi di proliferazione tramite immunocolorazione per KI 67 e la valutazione dei livelli di morte delle cellule tumorali nei topi di controllo e trattati con saggi a tunnel.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'innesto sottocutaneo, è che modella il normale microambiente, che modella meglio la crescita M-P-N-S-T dimostrando che questa tecnica sarà Amy Turk, un tecnico del mio laboratorio. I topi immunodeficienti non nudi vengono preparati il giorno prima dell'innesto. Usa le tosatrici per radere i peli da un mouse anestetizzato che lavora su un termoforo per mantenere la temperatura corporea.

Utilizzare un agente depilatorio chimico per rimuovere i peli rimanenti. Una volta rimossi tutti i peli, posizionare il mouse su un termoforo in una gabbia di isolamento senza lettiera fino a quando non si sarà completamente ripreso. Il giorno dell'innesto, centrifugare le cellule a 3000 giri/min per cinque minuti.

Rimuovere con cautela la boccola e risospendere il pellet di cella in DMEM 10 senza micina pur a una concentrazione finale di cinque volte 10 per le terze cellule per tre microlitri. Conservare le celle in ghiaccio fino al momento dell'uso. Per iniziare, posiziona un animale anestetizzato su un termoforo e applica un unguento oftalmico su ciascun occhio.

Agganciare un marchio auricolare con un numero di identificazione univoco all'orecchio destro di ciascun mouse. Per facilitare l'identificazione durante lo studio, posizionare l'animale a pancia in giù e allargare le zampe posteriori. Coprire il topo con un telo sterile ed esporre una finestra chirurgica dove avverrà l'innesto.

Applicare Betadine sul sito chirurgico con un applicatore con punta di cotone, iniziando dal centro del fianco e procedendo gradualmente a spirale verso l'esterno fino ai bordi della finestra chirurgica. L'etanolo al 70% viene quindi applicato al sito chirurgico allo stesso modo. Le applicazioni consecutive di Betadine seguite da etanolo vengono ripetute altre due volte.

Rimuovere le cellule dal ghiaccio e agitare delicatamente o far scorrere il tubo per risospendere le cellule depositate. Utilizzare una pipetta per rimuovere 3,2 microlitri della sospensione cellulare ed espellerla su un pezzo di paraforma. Estrarre tre microlitri della sospensione cellulare in una siringa Hamilton da 10 microlitri.

Dotato di ago calibro 33. Tenere le cellule e la cella contenente la siringa sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Utilizzare un manico di bisturi numero quattro, dotato di una lama di bisturi numero 22 per praticare un'incisione attraverso la pelle del fianco appena sotto e parallela al femore.

Aprire l'incisione cutanea con la pinza chirurgica per esporre il muscolo sottostante. Usa un paio di forbici affilate per sezionare la fascia che corre lungo la lunghezza della gamba ed esporre il nervo sciatico che si trova sotto una struttura lineare bianca dello spessore di un filo spesso lavorando al microscopio. Usa un paio di pinze curve a punta affilata per sezionare con cura sotto il nervo, allentandolo dal muscolo sottostante.

Lasciare il forcipe in posizione per mantenere il nervo sollevato e isolato con attenzione Inserire l'ago della siringa di Hamilton nel nervo cercando di mantenere l'angolo di iniezione il più parallelo possibile al nervo, in modo da non perforare la parte inferiore. Una volta che l'ago è posizionato correttamente nel nervo, rilassare la tensione prodotta dalla pinza e iniettare lentamente le cellule nel corso di 45-60 secondi. Un'iniezione lenta è essenziale per prevenire un controlavaggio delle cellule tumorali con conseguente perdita.

Dopo che tutte le cellule sono state iniettate con successo, ritirare lentamente l'ago per ridurre al minimo la perdita di materiale iniettato. Al termine dell'iniezione, rimuovere la pinza chirurgica e la pinza. Quindi riposizionare con cura il nervo nella sua posizione originale.

Chiudere l'incisione con la colla chirurgica vet bond, tenendola insieme con una pinza per circa 20 secondi per consentire alla colla di asciugarsi. Metti l'animale in una gabbia riscaldata priva di lettiere fino a quando non si sarà completamente ripreso. Monitora la salute dei topi.

I topi giornalieri vengono rimossi dallo studio. Se il carico tumorale supera il 10% del peso corporeo normale dell'animale o la perdita di peso supera il 20%Per determinare il successo della procedura, eseguire l'imaging a bioluminescenza uno e tre giorni dopo l'innesto. Iniettare in un topo 2,5 milligrammi di Lucifer e posizionare l'animale anestetizzato sulla piattaforma di imaging riscaldata.

L'emissione di luce dalla luciferasi della lucciola espressa dal tumore viene rilevata 10 minuti dopo l'iniezione del substrato. L'utilizzo del software Xeno Gen imposta i tempi di acquisizione delle immagini in un intervallo compreso tra un secondo e 10 minuti. Quindi, scatta fotografie in bianco e nero dei topi Pseudocolor.

Il ridimensionamento della bioluminescenza viene sovrapposto a queste immagini per fornire una misura dell'intensità dell'emissione luminosa. Per essere idonei per l'inclusione in una coorte di studi preclinici, i topi devono avere un segnale di bioluminescenza rilevabile, sia uno che tre giorni dopo l'innesto, e l'intensità del segnale deve aumentare tra il primo e il terzo giorno. Qui è mostrato un tipico aumento progressivo della bioluminescenza osservato da uno a 18 giorni dopo l'innesto in uno xenotrapianto ortotopico correttamente stabilito in un topo nudo.

Si noti la somiglianza nei segnali rilevati all'interno della regione di interesse di diversi topi. Il re-imaging 10 giorni e 18 giorni dopo l'innesto mostra che i segnali bioluminescenti aumentano progressivamente nel sito di innesto nei singoli topi. La quantificazione dei segnali bioluminescenti osservati da uno a 24 giorni dopo l'innesto mostra che, sebbene questi segnali aumentino progressivamente, la crescita tumorale accelera notevolmente nelle fasi successive del periodo di studio.

Data la crescita aggressiva di M pns ts, le cellule tumorali innestate spesso violano le normali barriere del nervo e invadono i tessuti adiacenti. Questa micrografia fotografica del sito di innesto mostra la crescita del tumore e l'invasione focale nel muscolo scheletrico adiacente Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un topo in 10 minuti se eseguita correttamente.