Name: Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Impara la trasformazione efficiente dei protoplasti di Physcomitrella patens mediante PEG. Questo metodo semplificato consente espressione proteica affidabile e supporta studi di RNAi transitorio e knockout genici.

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1. Rendere il protoplasti <ol><li> Aggiungere 9 ml di mannitolo 8% a una piastra di Petri. </li><li> Con una spatola, mettere 7 giorni muschio vecchio 2-3 PPNH4 lastre di 5 - nella capsula di Petri contenente mannitolo. </li><li> Aggiungere 3 ml del 2% Driselase (Sigma D9515-25G) per la piastra di Petri. </li><li> Incubare la piastra Petri a temperatura ambiente agitando delicatamente per 1 ora. </li><li> Filtrare la sospensione di protoplasti attraverso una maglia di 100 micron (BD Falcon 352350). </li><li> Spin la sospensione filtrata a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il protoplasti molto delicatamente con 500 ml di mannitolo 8%. </li><li> Aggiungere 9,5 ml di mannitolo 8% nel tubo di cultura. Assicurarsi protoplasti sono completamente sospesi. </li><li> Ripetere la filtrazione e la risospensione passi (1,6, 1,7 e 1,8) altre due volte. </li><li> Prendere 10 microlitri della soluzione del protoplasti e contare i protoplasti in un emocitometro. </li><li> Moltiplicare il numero di protoplasti in una zona con 16 quadrati da 10.000 a ottenere il numero di protoplasti per ml (vedi figura 1). </li></ol> 2. Trasformazione <ol><li> Spin la sospensione di protoplasti a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere protoplasti MMG in soluzione alla concentrazione di 1,6 milioni di protoplasti / mL. </li><li> Incubare la sospensione di protoplasti a temperatura ambiente per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 600 ml di sospensione di protoplasti in un tubo cultura del DNA contenente 60 mcg. Agitare delicatamente il tubo. </li><li> Aggiungere 700 ml di PEG / Ca soluzione nel protoplasti / DNA miscela. Agitare delicatamente fino a quando il tubo miscela è omogenea. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Durante questo periodo di attesa, copertura PRM-B piatti con cellophane (80 mm di diametro cerchi, AA Packaging Limited, UK); permettono cellophane per idratare sulla superficie della piastra per almeno 5 minuti. </li><li> Con una spatola, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra il cellophane e la piastra. </li><li> Diluire il composto con 3 ml di soluzione W5. </li><li> Spin la miscela a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere protoplasti nel fuso 2 ml di PRM-T (prima di aggiungerlo al protoplasti questa soluzione può essere mantenuta liquida a 42 ° C). Tavola 1 ml di risospendere protoplasti per PRM-B piatto coperto da cellophane. Avvolgere le piastre con Micropore (3M, Health Care). Tenere le piastre a 25 ° C in una camera di crescita. </li><li> In alternativa, protoplasti può essere risospeso in 1 ml di terreno liquido e placcato placcatura 0,5 ml su un PRM-B piatto coperto da cellophane. Questo permette una più veloce rigenerazione, ma il numero di impianti di rigenerazione è più basso. </li><li> Camera di crescita è impostato per un ore 16. luce e 8 ore. ciclo scuro. </li><li> Spostare il cellophane su di una piastra nuova selezione 4 giorni dopo la trasformazione. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Un esempio di trasformazione è mostrato nella Figura 2. Il DNA utilizzato in questo esempio è stato un superavvolto 7,8 kb plasmide porta una cassetta resistente Hygromycin. La quantità di protoplasti placcato è stata ridotta al 50% per la fotografia. Le foto sono state scattate due settimane dopo che le piante sono state spostate le piastre di selezione. L'efficienza di trasformazione non è influenzata dalla concentrazione di DNA fino a 60 mcg. Concentrazioni più elevate di DNA sono dannose per l'efficienza della trasformazione. I dati hanno mostrato che questo metodo fornisce risultati coerenti in un ampio intervallo di quantità di DNA. Questo metodo può anche generare trasformanti stabili in modo efficace, come illustrato nella tabella 1, possiamo ottenere circa 4 trasformanti stabili per microgrammo di DNA linearizzato, che è molto più alta di quanto è stato riportato in precedenza 14. Abbiamo anche testato l'effetto dello shock termico sulla efficienza della trasformazione, trasformando un plasmide superavvolto portatrice di un gene per una proteina fluorescente come marcatore. Lo shock termico è stata effettuata 10 minuti dopo l'incubazione a temperatura ambiente (entro Passo 2.6) incubando la miscela in un bagno d'acqua a 45 ° C per 3 minuti. La miscela è stata incubata in un bagno di acqua a temperatura ambiente subito dopo la scossa di calore per 17 min. I risultati sono stati registrati 22 ore dopo la trasformazione. I rapporti di trasformanti ottenuti con e senza shock termico erano molto simili (~ 25%), ma abbiamo osservato un effetto negativo di shock termico sulla redditività dei protoplasti (dati non riportati). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista di protoplasti in emocitometro. La sezione necessaria per il conteggio di protoplasti è indicata da un quadrato rosso. Si noti il ​​16 quadrati necessari per il conteggio protoplasti (vedi 1.11), l'immagine mostra un conteggio di 24 protoplasti (240.000 cellule / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Foto di 18 giorni trasformanti vecchio transitori. Protoplasti sono stati transformato con la quantità indicata di plasmide superavvolto. A: 15μg; B: 30 mcg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità di DNA (mg) </td><td> Efficienza (tranformants / DNA mcg) </td></tr><tr><td> 15, superavvolto plasmide </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, superavvolto plasmide </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, superavvolto plasmide </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, superavvolto plasmide </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, plasmide linearizzato </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Efficienza di trasformazione del DNA in quantità diverse.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato qui permette una trasformazione del DNA lineare e coerente in Physcomitrella protoplasti patene. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per Arabidopsis 1, ma qui abbiamo dimostrato che si comporta bene con protoplasti di Physcomitrella patene, un impianto più semplice e diverso. Pertanto, questo metodo può essere applicato ad altre specie di piante, con piccole modifiche. Possibili modifiche per l&#39;ottimizzazione comprendono concentrazione di protoplasti in MMG, tempo di incubazione in soluzione MMG e PEG / Ca. Abbiamo scelto di utilizzare il DNA 60 mg nei nostri esperimenti di routine perché il numero di trasformanti cresce linearmente con la concentrazione di DNA fino a questo punto (Tabella 1). Potremmo avere circa 7000 trasformanti transitori o 200 trasformanti stabili su un singolo 60 mcg trasformazione del DNA, che permette per lo screening e analisi di una vasta popolazione di piante. Il protoplasti trasformato può essere diffuso con il mezzo liquido o placcatura PRM-T. Sebbene l&#39;efficienza di rigenerazione è più bassa quando medie placcatura liquida è utilizzato, abbiamo scelto questo metodo quando il protoplasti sono stati trasformati con plasmidi superavvolto. Come mostrato nella tabella 1, le trasformazioni fatto con superavvolto DNA plasmidico generare trasformanti molti altri e, quindi, possiamo ancora ottenere un gran numero di impianti di media placcatura liquido. Inoltre, la diffusione protoplasti con placcatura medio liquido permette una più veloce rigenerazione, che è importante per gli esperimenti che coinvolgono fenotipi transitoria, come RNAi abbattere esperimenti 9,15. Inoltre l&#39;assenza di agar in alto permette di isolamento pianta facile per immunoistochimica e RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Ingrediente </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mm di Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM di tartrato di diammonio 54 mM FeSO4 0,7 H 2 O 9,93 mM H 3 BO 3 1,97 mM MnCl 2 .4 H 2 O 0,23 mM CoCl 2 .6 H 2 O 0,19 mM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 mM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 mM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 mM KI Aggiungere 0,7% agar per terreno solido. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 con il 6% mannitolo e 0,8% agar. Aggiungere 10 ml 1M CaCl 2 a 1 L prima di versare piatti. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 con il 6% mannitolo e 0,6% agar. Aggiungere 0,5 ml 1M CaCl 2 a 50 ml prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Placcatura Media liquido </td><td> PPNH 4 con 8,5% di mannitolo senza agar. Aggiungere 0,5 ml 1M CaCl 2 a 50 ml prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Aggiungere 4 g di Driselase (Sigma D9515-25G) a 200 ml di mannitolo 8%. Mescolare delicatamente per 30 min. a temperatura ambiente, incubare 30 min. a 4 ° C, e mescolare delicatamente per 5 minuti. a temperatura ambiente. Spin 2.500 g per 10 minuti, scartare pellet. Filtro con 0,22 micron, e conservare congelato aliquote da 10 ml. Scongelare in un bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M di mannitolo 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2,5 ml 0,8 M mannitolo 1 ml 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

efficiente polietilene glicole (peg) trasformazione mediata della moss physcomitrella patene</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Un metodo semplice ed efficace per trasformare<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplasti e<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesofillo trasformazione di protoplasti<sup&gt; 1</sup&gt;. Grazie alla sua capacità di subire mitosi efficiente ricombinazione omologa<em&gt;, Physcomitrella patene</em&gt; È emerso come un sistema modello importante negli ultimi anni<sup&gt; 2</sup&gt;. Questa capacità consente di alte frequenze del gene targeting<sup&gt; 3-9</sup&gt;, Che non si vede nelle piante altri modelli come ad esempio<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Per trarre il massimo vantaggio di questo sistema, abbiamo bisogno di un metodo efficace e semplice per fornire il DNA nelle cellule muschio. I modi più comuni di trasformare questo muschio sono bombardamento di particelle<sup&gt; 10</sup&gt; E PEG-mediata del DNA uptake<sup&gt; 11</sup&gt;. Anche se bombardamento di particelle in grado di produrre una elevata efficienza di trasformazione<sup&gt; 12</sup&gt;, Pistole gene non sono prontamente disponibili per molti laboratori e il protocollo è difficile da standardizzare. D&#39;altra parte, la trasformazione PEG mediata non richiede attrezzature specializzate, e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio, con un cappuccio sterile. Qui vi mostriamo un metodo semplice ed altamente efficiente per la trasformazione di protoplasti muschio. Questo metodo può generare più di 120 trasformanti transitoria per microgrammo di DNA, che è un miglioramento rispetto al protocollo più efficiente precedentemente riportato<sup&gt; 13</sup&gt;. Grazie alla sua semplicità, efficienza e riproducibilità, questo metodo può essere applicato a progetti che richiedono grande numero di trasformanti così come per la trasformazione di routine.</p

Un metodo semplice ed efficace per trasformare<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplasti e<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mesofillo trasformazione di protoplasti<sup&gt; 1</sup&gt;.

Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene</em

Viene descritto un metodo semplice ed efficiente per trasformare i protoplasti di Physcomitrella patens. Questo metodo è adattato dai protocolli per Physocmitrella...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare i protoplasti di SCO Metre. Questo viene ottenuto innanzitutto digerendo le piante con Drizly. Successivamente, i protoplasti vengono lavati con mannitolo per rimuovere il Drizly e quindi incubati con DNA e PEG.Infine, i protoplasti trasformati vengono seminati su piastre e incubati. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano protoplasti trasformati che esprimono proteine marcate con fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza. A dimostrare la procedura sarà Y. Lu, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio.Il principale vantaggio di questa tecnica è che è efficace e genera in modo costante protoplasti che esprimono la proteina di interesse. Per isolare i protoplasti di muschio, iniziare aggiungendo nove millilitri di mannitolo all'8% in una piastra di Petri utilizzando una spatola. Aggiungere muschio di cinque o sette giorni di età proveniente da due o tre piastre PP NH4 nel mannitolo. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per questo e ulteriori ricette dei reagenti. Successivamente, aggiungere tre millilitri di Drizly al 2% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per un'ora.Filtrare la miscela attraverso una maglia da 100 micron per ottenere una sospensione verde omogenea. Successivamente, centrifugare il filtrato a 250 G per cinque minuti. Scartare con molta delicatezza il soprannatante.Risospendere i protoplasti in 500 microlitri di mannitolo all'8%. Quindi aggiungere ulteriori 9,5 millilitri di mannitolo all'8%. Assicurarsi che i protoplasti siano completamente risospesi.Eseguire altri due passaggi di lavaggio centrifugando nuovamente la soluzione a 250 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere i protoplasti, prima in 500 microlitri.Quindi, 9,5 millilitri di mannitolo all'8% utilizzando un citometro ematico. Contare il numero di protoplasti in 10 microlitri della sospensione per trasformare il DNA nei protoplasti isolati. Per prima cosa, centrifugare la miscela di protoplasti a 250 G per cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e risospendere i protoplasti a 1,6 milioni per millilitro in soluzione MMG. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 600 microlitri della soluzione di protoplasti in un tubo da coltura contenente 60 microgrammi di DNA. Agitare.Aggiungere delicatamente 700 microlitri di soluzione di calcio PEG e agitare. Incubare bene il campione a temperatura ambiente per 30 minuti durante questo periodo di attesa. Coprire le piastre PRMB con carta trasparente.Quindi diluire la sospensione con tre millilitri di soluzione W5 e centrifugare a 250 ×g per cinque minuti. Per rimuovere il PEG, risospendere i protoplasti in due millilitri di PRMT e piastrare un millilitro per piastra PRMB coperta con carta da forno. Mantenere le piastre a 25 gradi Celsius in una camera di crescita.Infine, quattro giorni dopo la trasformazione, trasferire la pellicola di cellophane su piastre di selezione fresche. Questa figura mostra un esempio di piante di 18 giorni rigenerate da protoplasti, trasformati con 15 microgrammi di DNA plasmidico superavvolto, contenente un cassetto di resistenza all'igromicina. In questo caso, 30 microgrammi dello stesso plasmide superavvolto, DNA, sono stati trasformati nei protoplasti.60 microgrammi di DNA plasmidico sono stati trasformati in questo campione. E infine, queste piante sono state rigenerate da protoplasti che sono stati trasformati con 120 microgrammi dello stesso DNA plasmidico in forma superavvolta, contenente la cassetta di resistenza all'igromicina. L'efficienza di trasformazione non è influenzata da concentrazioni di DNA fino a 60 microgrammi.Tuttavia, concentrazioni più elevate di DNA sono dannose per questa procedura. I dati indicano che questo metodo fornisce risultati costanti su un'ampia gamma di quantità di DNA Una volta semestre. Questa tecnica può essere eseguita in tre ore se viene effettuata correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori metodi come l'RNAi transitorio e gli knockout genici per rispondere ad altre domande riguardo alla funzione genica.

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