Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene
19 aprile 2011
Un metodo semplice ed efficace per trasformare Physcomitrella pantens Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per Physocmitrella Protonemal protoplasti e Arabidopsis Mesofillo trasformazione di protoplasti 1.
L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare i protoplasti SCO Metre Protoplasts. Ciò si ottiene digerendo prima le piante con Drizly. Successivamente, i protoplasti vengono lavati con mannitolo per rimuovere il drizly e vengono quindi incubati con DNA e peg.
Infine, i protoplasti trasformati vengono sparsi su piastre e incubati. In definitiva, i risultati possono essere ottenuti. Che mostrano protoplasti trasformati che esprimono proteine marcate in fluorescenza attraverso la microscopia a fluorescenza A dimostrare la procedura sarà Y lu, un postdoc del mio laboratorio.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è efficace e genera costantemente protoplasti che esprimono la proteina di interesse Per isolare il muschio I protoplasti iniziano aggiungendo nove millilitri di 8% di mannitolo in una capsula di Petri usando una spatola Posizionare il muschio di cinque o sette giorni da due a tre piastre PP NH quattro nel mannitolo. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per questa e altre ricette di reagenti. Successivamente, aggiungere tre millilitri di 2% di essiccazione e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente per un'ora.
Filtrare la miscela attraverso maglie da 100 micron fino ad ottenere una sospensione verde omogenea. Quindi centrifugare il filtrato a 250 g per cinque minuti. Scartare il surnatante molto delicatamente.
Risospendere i protoplasti in 500 microlitri di mannitolo all'8%. Quindi aggiungere altri 9,5 millilitri di mannitolo all'8%. Assicurarsi che i protoplasti siano completamente sospesi.
Eseguire le fasi di lavaggio altre due volte centrifugando nuovamente la soluzione a 250 G per cinque minuti. Scarto del surnatante e sospensione dei protoplasti. Primo in 500 microlitri.
Quindi 9,5 millilitri di mannitolo all'8% utilizzando un emocitometro. Contare il numero di protoplasti in 10 microlitri di sospensione per trasformare il DNA nei protoplasti isolati. Per prima cosa, centrifugare la miscela di protoplasti a 250 G per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante, risospendere i protoplasti a 1,6 milioni per millilitro in soluzione di MMG. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 600 microlitri della soluzione di Protoplasts in una provetta di coltura contenente 60 microgrammi di DNA. Scuotere.
Aggiungere delicatamente 700 microlitri di soluzione di calcio PEG e agitare. Incubare bene il campione a temperatura ambiente per 30 minuti durante questo periodo di attesa. Coprire le lastre PRMB con cellophane.
Quindi diluire la sospensione con tre millilitri di W cinque soluzione centrifugare a 250 G per cinque minuti. Per rimuovere il PEG risospeso, i protoplasti in due millilitri di piastra PRMT un millilitro per piastra PRMB ricoperta di cellophane. Conservare le piastre a 25 gradi Celsius in una camera di crescita.
Infine, quattro giorni dopo la trasformazione, trasferire il cellophane su piastre di selezione fresche. Questa figura mostra un esempio di piante di 18 giorni rigenerate da protoplasti, trasformate con 15 microgrammi di plasma super arrotolato, DNA, che trasportano una cassetta resistente all'igromicina. Qui, 30 microgrammi dello stesso plasmide super avvolto, il DNA, sono stati trasformati in protoplasti.
In questo campione sono stati trasformati 60 microgrammi di DNA scozzese. E infine, queste piante sono state rigenerate da protoplasti che sono stati trasformati con 120 microgrammi dello stesso DNA di plasma super avvolto che trasporta la cassetta di resistenza all'igromicina. L'efficienza di trasformazione non è influenzata da concentrazioni di DNA fino a 60 microgrammi.
Tuttavia, concentrazioni più elevate di DNA sono dannose per questa procedura. I dati indicano che questo metodo fornisce risultati coerenti su un'ampia gamma di quantità di DNA Una volta semestrale. Questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come l'RNAi transitorio e il knockout genico per rispondere a ulteriori domande sulla funzione genica.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo semplice ed efficiente per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens. La tecnica è adattata da protocolli esistenti per la trasformazione di protoplasti e mira a produrre risultati costantemente efficaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Ingegneria genetica
- Biologia cellulare
Sfondo
- I protoplasti sono cellule vegetali prive della parete cellulare.
- Le tecniche di trasformazione sono essenziali per lo studio della funzione genica nelle piante.
- Physcomitrella patens è un organismo modello nella ricerca vegetale.
- I metodi esistenti per la trasformazione dei protoplasti possono essere complessi e dispendiosi in termini di tempo.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo semplificato per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens.
- Migliorare l'efficienza e l'affidabilità della trasformazione dei protoplasti.
- Facilitare ulteriori studi genetici nel muschio.
Metodi Utilizzati
- Digerire il tessuto del muschio con Drizly per isolare i protoplasti.
- Lavare i protoplasti con mannitolo per rimuovere i contaminanti.
- Trasformare i protoplasti isolati con DNA utilizzando PEG.
- Incubare i protoplasti trasformati su terreno selettivo.
Risultati principali
- I protoplasti trasformati hanno espresso con successo proteine fluorescenti.
- Il metodo ha mostrato un'efficienza di trasformazione costante a diverse concentrazioni di DNA.
- Concentrazioni elevate di DNA si sono rivelate dannose per il successo della trasformazione.
- L'intera procedura può essere completata in circa tre ore.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens.
- Permette esperimenti successivi come l'RNAi transitorio e gli knockout genici.
- Il protocollo può contribuire in modo significativo alla comprensione della funzione genica nei muschi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La trasformazione mediata da PEG di protoplasti di Physcomitrella patens consente un trasferimento genico efficiente e riproducibile, supportando la genomica funzionale ad alto rendimento nei sistemi vegetali. Questa capacità è fondamentale per i team di scoperta iniziale che mirano a indagare la funzione genica, validare bersagli e accelerare l'elucidazione di percorsi metabolici in un modello geneticamente accessibile. La scalabilità del metodo e il suo potenziale di standardizzazione lo rendono prezioso per schermate genetiche su larga scala e per la riduzione del rischio meccanicistico nell'intero portafoglio di ricerca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'analisi rapida della funzione genica mediante un efficiente trasferimento di DNA nelle cellule di muschio.
- Permette un'elevata frequenza di targeting genico per la validazione funzionale delle proteine bersaglio e l'analisi dei percorsi metabolici.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici consentendo modifiche genetiche precise in un sistema modello.
- Migliora l'affidabilità predittiva delle ipotesi biologiche successive.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un protocollo standardizzato per la generazione di un elevato numero di trasformanti da utilizzare in saggi di screening.
- Garantisce un'efficienza di trasformazione riproducibile, favorendo l'affidabilità e la scalabilità dei saggi.
- Consente la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione di composti e lo screening fenotipico.
- Riduce la dipendenza da attrezzature specializzate, aumentando l'accessibilità per i team impegnati nello sviluppo di saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Consente applicazioni successive come studi di silenziamento transitorio dell'RNAi e di knockout genico rilevanti per la modellizzazione delle malattie.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta genica alla validazione preclinica in sistemi a base vegetale.
- Fornisce una piattaforma per l'esplorazione di biomarcatori traslazionali quando abbinata a vie metaboliche rilevanti per le malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di trasformazione si inserisce nel percorso continuo che va dalla scoperta iniziale all'identificazione del capostazione, consentendo la manipolazione genetica, la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi nei modelli vegetali.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante un efficiente trasferimento genico e l'analisi dell'espressione genica.
- Screening: Supporta la preparazione e la riproducibilità dei saggi generando popolazioni di trasformanti costanti.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi come l'efficienza di trasformazione e l'espressione proteica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Permette studi genetici che contribuiscono allo sviluppo di modelli preclinici e all'identificazione di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di trasformazione standardizzata e ampiamente applicabile per svariati studi genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla funzione genica.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità nei flussi di lavoro di trasformazione genetica.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo la generazione di dati solidi in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di bersagli e percorsi genetici adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare vegetale e nella tecnica asettica per l'isolamento e la trasformazione di protoplasti.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture di laboratorio di base, inclusi centrifugazione e microscopia a fluorescenza per la validazione dei risultati.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di trasformazione per garantire la riproducibilità tra progetti.
- Potrebbe richiedere adattamenti per essere utilizzato in altre specie vegetali o sistemi modello diversi da Physcomitrella patens.
- L'efficienza di trasformazione è sensibile alla concentrazione del DNA, con quantità elevate che potrebbero risultare dannose.
