Name: NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri la quantificazione degli acidi nucleici con i sistemi NanoDrop 2000 C e 3.300. Questi metodi a microvolume permettono misurazioni accurate con solo un microlitro di campione, migliorando l'efficienza in biologia molecolare.

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Richard W. Beringer e David L. Ash, gli scienziati le applicazioni, prodotti Thermo NanoDrop scientifico, per l&#39;assistenza tecnica e le riprese.

1. Microvolumi Quantificazione degli acidi nucleici Utilizzando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro <ol><li> Per iniziare, pulire le superfici superiori ed inferiori ottica del sistema di ritenzione spettrofotometro microvolumi campione pipettando 2-3 ml di acqua deionizzata pulita sulla superficie inferiore ottica. </li><li> Chiudere il braccio di leva, assicurandosi che il piedistallo superiore entra in contatto con l'acqua deionizzata. Sollevare il braccio di leva e pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Aprire il software NanoDrop e selezionare l'applicazione di acido nucleico. Utilizzare un piccolo volume, pipettatore calibrato per eseguire una misurazione vuoto dispensando 1 ml di tampone sulla superficie inferiore ottica. Abbassare il braccio di leva e selezionare "vuoto" nella domanda di acido nucleico. </li><li> Una volta che la misura è vuoto completo, pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Scegli la costante appropriata per il campione che deve essere misurato. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di campione </td><td> Selezionare l'opzione </td><td> Costante utilizzata per calcolare la concentrazione </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Costume </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tipici acidi nucleici gamme di concentramento diretto A280 misure assorbanza usando un NanoDrop microvolumi spettrofotometro, un tradizionale cuvetta a base di spettrofotometro usato con un Microcell TrayCell cuvetta, e un fluorospectrometer NanoDrop microvolumi in collaborazione con il saggio PicoGreen. </li><li> Dispensare 1 ml di campione di acido nucleico sul piedistallo più basso ottico e chiudere il braccio di leva. Poiché la misura è volume indipendente, il campione ha solo bisogno di colmare il divario tra le due superfici ottiche per una misura da effettuare. </li><li> Selezionare "misura" nel software applicativo. Il software calcola automaticamente l'acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l'emissione spettrale. </li><li> Il software calcola automaticamente l'acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l'immagine spettrale di valutare la qualità del campione. </li><li> Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. </li><li> Le fonti comuni di contaminanti associati a specifiche tecniche di acidi nucleici isolamento includono l'estrazione fenolo / Trizol e colonna. Nel caso di estrazione fenolo / Trizol, la contaminazione dei reagenti residuo può essere indicato da spettri anomali tra 220-240 nm e dagli spostamenti nella regione 260-280 nm. Al contrario, guanidina residuo dall'estrazione colonna possono contribuire a raggiungere un picco vicino a 230 nm e un cambiamento nella vasca da 230 nm a circa 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. I cambiamenti nella alti e bassi dei campioni B e C rispetto al campione A illustrare come contaminanti possono influenzare gli spettri di campioni di acidi nucleici. </li><li> Per valutare accuratamente la qualità del campione, 260/280 o 260/230 rapporti devono essere analizzati in combinazione con la complessiva qualità spettrale. Pure acidi nucleici tipicamente produrre un rapporto di 260/280 ~ 1,8 e un rapporto di 260/280 ~ 2.0 per DNA e RNA, rispettivamente. Questo rapporto dipende dal pH e forza ionica del tampone usato per fare il vuoto e le misure del campione. Soluzioni acide sarà sotto-rappresentano il rapporto di 0,2-0,3, mentre una soluzione di base si sovra-rappresentare il rapporto di 0,2-0,3. Rapporti di purezza significativamente differenti possono indicare la presenza di proteine, fenolo o altri contaminanti che assorbono fortemente nei pressi o 280 nm. Il rapporto di 260/230 purezza è una seconda misura di purezza del DNA con i valori di un acido "puro" nucleici comunemente nel range di 1,8-2,2. Rapporti di purezza che sono significativamente inferiori ai valori attesi possono indicare la tecnica di isolamento utilizzato può richiedere un'ulteriore ottimizzazione. </li><li> Spettrofotometri NanoDrop può anche essere utilizzato per quantificare le proteine ​​mediante assorbanza direttamente o tramite test colorimetrici proteine. Per garantire una corretta formazione della colonna e riproducibilità, 2-microlitri campioni si consiglia di campioni di proteine. Fare riferimento al seguente video jove: Determinazione delle proteine ​​microvolumi Concentrazione Utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Per dimostrare ad alta sensibilità quantificazione degli acidi nucleici microvolumi utilizzando il NanoDrop 3300, un kit PicoGreen fluorescenza viene utilizzato. Per iniziare, equilibrare gli standard kit e tutti i campioni di acidi nucleici a temperatura ambiente. Campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e deve essere conservato in ambra o tubi avvolti in alluminio. </li><li> Preparare abbastanza 1x tampone TE per tutti gli standard ed i campioni da misurare, nonché per la soluzione PicoGreen di lavoro che saranno necessarie. Preparare tampone 1xTE diluendo il fornita 20x TE buffer con acqua priva di nucleasi per protocollo del produttore. Volumi di reazione può variare da 200 ul a un minimo di 10 ul. In questo esempio, 10 volumi di reazione microlitri sarà preparato. </li><li> Preparare in serie standard diluita dsDNA a 2x la concentrazione finale desiderata nucleasi-free fiale o provette. Trasferire 5 ml di ciascuna soluzione standard di dsDNA diluito in un individuo etichettato nucleasi-free ambra o alluminio coperto di tubo. </li><li> Aliquota 5 ml di ogni campione dsDNA di interesse in adeguatamente etichettati nucleasi-free ambra o foglio coperto di tubi. </li><li> Preparare la soluzione PicoGreen di lavoro secondo il protocollo del produttore. Trasferire un volume uguale della soluzione PicoGreen di lavoro ad ogni provetta contenente sia uno standard o campione di interesse (5 microlitri in questo esempio). </li><li> Combina volumi uguali di 1x tampone TE e PicoGreen soluzione di lavoro per preparare il controllo negativo, che serve come soluzione di riferimento. </li><li> Mescolare il contenuto di ogni provetta accuratamente pipettando dolce e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Tutti gli standard ed i campioni devono essere equilibrati per la stessa temperatura prima della misurazione come segnale di fluorescenza è influenzata dalla temperatura. </li><li> Per preparare lo strumento e di eseguire le misurazioni, in primo luogo la pulizia delle superfici inferiore e superiore del sistema di ritenzione del campione. Pipettare 2-3 ml di acqua deionizzata sulla superficie inferiore ottica, chiudere quindi aprire il braccio di leva, e cancella i piedistalli superiore e inferiore con un panno pulito, privo di lanugine, pulire laboratorio. Assicurarsi che le superfici siano prive di lanugine prima di procedere come niente può esibire fluorescenza in presenza di una fonte di eccitazione e possono interferire con la misurazione. </li><li> Aprire il software dello strumento, selezionare l'opzione "Nucleic Acids" applicazione e selezionare l'opzione "PicoGreen-dsDNA". </li><li> Al vuoto dello strumento, aggiungere 2 ml di TE 1x al piedistallo più basso, vicino al braccio, e selezionare "Vuoto" nel campo del software dello strumento. Una volta vuota è completo, macchia al largo della prova in bianco su entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione. </li><li> Mescolare la soluzione di riferimento pipettando gentile. Utilizzando punte bassa ritenzione, pipetta 2 microlitri sul piedistallo più basso e chiudere il braccio. </li><li> Selezionare "di riferimento" nel tipo di misura, e selezionare le unità desiderate. Fare clic su "misura" per avviare il ciclo di misurazione. </li><li> Quando il ciclo di misura, aprire completamente il braccio e macchia le superfici Sistema di ritenzione del campione. Misura fino a cinque repliche di riferimento, su una nuova aliquota per ogni replica. </li><li> Ripetere la procedura per gli standard aggiuntivi per costruire una curva standard. Fino a sette norme possono essere utilizzati. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque repliche per ogni standard. Replica degli standard viene calcolata la media per generare una curva standard da cui concentrazioni del campione sono determinati automaticamente. </li><li> Una volta che la curva standard è completo, selezionare la scheda "Campioni", inserire le rispettive informazioni ID campionamento e la misurazione di ogni campione sconosciuto. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins e Debra Conklin sono dipendenti di Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.

I protocolli di quantificazione qui presentati sono basati sul più diffuso dei sistemi microvolumi. Tali sistemi offrono alternative pratiche per la tradizionale metodologia di quantificazione acidi nucleici, che si basano su maggiori volumi di campione e l'impiego di attrezzature di contenimento. NanoDrop microvolumi tecnologia si avvale di un sistema di ritenzione del campione che si basa sulle proprietà tensione della superficie del campione da misurare a formare una colonna di liquido. E 'essenziale che il campione entra in contatto con le superfici superiori ed inferiori misura ottica per la formazione di colonna corretta. Se in qualsiasi momento i risultati delle misurazioni sembrano imprecisi o non riproducibili, è probabilmente il risultato di eterogeneità del campione o la rottura della colonna liquida. Detergenti e alcool isopropilico non sono consigliati detergenti in quanto potrebbero uncondition le superfici piedistallo di misura. Un piedistallo incondizionata si verifica quando le proprietà di superficie idrofoba del piedistallo sono stati compromessi, con un conseguente appiattimento della goccia campione. Piedistalli incondizionato può portare alla rottura della colonna di liquido durante la misurazione. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Superficie Figura 3. Incondizionato è caratterizzata da un appiattimento di una goccia d'acqua. Superfici piedistallo Uncondtioned possono essere revisionati con Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1, Thermo Scientific Prodotti NanoDrop). Un sottile strato di composto ricondizionamento viene applicata alle superfici piedistallo superiore e inferiore, lasciato asciugare per circa 30 secondi, poi strofinando con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. Uno stato con successo ricondizionati è caratterizzato da una goccia d'acqua perline quando applicato sulla superficie in basso piedistallo. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ricondizionati Una superficie è caratterizzata da una bordatura di una goccia d'acqua. Sistemi di quantificazione microvolumi ridurre notevolmente il consumo di campione e aumentare notevolmente il range di concentrazione rispetto ai più tradizionali sistemi di quantificazione. Anche se la quantificazione microvolumi è diventato spesso una tecnologia abilitante per le circostanze che coinvolgono la massa limitata di cellule, come le biopsie ago e laser-capture microdissezione, l'efficienza e la facilità d'uso di questa metodologia ha reso un ampiamente accettato alternativa ai tradizionali metodi di quantificazione acidi nucleici anche campione quando è abbondante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Analisi biomolecolari sono in costante sviluppo che usano quantità sempre più piccoli di materiale, spesso precludendo l&#39;utilizzo di tradizionali strumenti basati cuvetta per la quantificazione degli acidi nucleici per coloro che possono eseguire quantificazione microvolumi. Il NanoDrop microvolumi Sistema di ritenzione del campione (Thermo Prodotti NanoDrop Scientifica) le funzioni unendo tecnologia delle fibre ottiche e le proprietà naturali della tensione superficiale di catturare e trattenere piccole quantità di campione indipendente di apparecchi di contenimento tradizionali come cuvette o capillari. Inoltre, il sistema impiega lunghezze di percorso più breve, che si traducono in una vasta gamma di misure di concentrazione di acidi nucleici, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Riduzione del volume di campione per l&#39;analisi spettroscopica facilita anche l&#39;inserimento di ulteriori passi di controllo di qualità in molti flussi di lavoro molecolare, aumentando l&#39;efficienza e, in definitiva portando ad una maggiore fiducia nei risultati a valle. La necessità di alta sensibilità di analisi a fluorescenza di massa limitata è anche emerso con i recenti progressi sperimentali. Utilizzando la stessa tecnologia di ritenzione del campione microvolumi, misure fluorescenti possono essere eseguite con 2 ml di materiale, permettendo fluorescente requisiti volume di saggi di essere significativamente ridotta. Microreactions tale di 10 L o meno sono ora possibili utilizzando un fluorospectrometer dedicato microvolumi. Due microvolumi acidi nucleici protocolli di quantificazione sarà dimostrato che l&#39;uso integrato di sistemi di ritenzione del campione come alternative alle tradizionali pratiche cuvetta protocolli basati su. In primo luogo, un metodo diretto A260 assorbanza con uno spettrofotometro microvolumi è descritto. Questa è seguita da una dimostrazione di un metodo basato fluorescenza, che consente le reazioni fluorescenza ridotto volume con un fluorospectrometer microvolumi. Queste nuove tecniche permettono la valutazione delle concentrazioni degli acidi nucleici che vanno da 1 pg / mL a 15.000 ng / mL con un consumo minimo di campione.

L&#39;uso di sistemi NanoDrop microvolumi come alternativa pratica ed efficace ai tradizionali metodologia di quantificazione acidi nucleici è descritto attraverso la dimostrazione di due protocolli di acido nucleico quantificazione microvolumi.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Vengono continuamente sviluppati saggi biomolecolari che utilizzano quantità di materiale progressivamente inferiori, spesso precludendo l'uso di metodi convenzionali...

Il sistema di ritenzione del campione NanoDrop è una tecnologia innovativa che sfrutta la tensione superficiale intrinseca dei liquidi per trattenere e misurare campioni in microvolume tra due supporti ottici, senza l'uso di QTS o capillari. Basta prelevare direttamente con una pipetta un microlitro di campione e depositarlo sulla superficie ottica inferiore. Chiudendo il braccio dello spettrometro, si forma una colonna di liquido tra i supporti ottici superiore e inferiore.Formando una tensione superficiale che crea un percorso ottico verticale, la lunghezza del percorso può cambiare automaticamente in tempo reale durante la misurazione. L'accorciamento del percorso ottico consente la misurazione di concentrazioni più elevate, eliminando efficacemente la necessità di effettuare diluizioni per la maggior parte dei campioni di acidi nucleici. Inoltre, il sistema di ritenzione del campione accelera il processo sperimentale grazie a una rapida pulizia, che consiste semplicemente nello strofinare le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio.Oggi illustreremo due procedure per determinare la concentrazione di acidi nucleici utilizzando strumentazione termica a microvolume. Il primo protocollo consiste in una misurazione diretta degli acidi nucleici mediante lo spettrofotometro NanoDrop 2000 C. Il secondo protocollo è una misurazione indiretta degli acidi nucleici mediante fluorescenza, effettuata con lo spettrofluorimetro NanoDrop 3,300.Per iniziare, pulire le superfici ottiche superiore e inferiore del sistema di ritenzione del campione dello spettrofotometro a volume microellettrico pipettando due o tre microlitri di acqua deionizzata pulita sulla superficie ottica inferiore. Chiudere il braccio leva assicurandosi che il perno superiore entri in contatto con l'acqua deionizzata. Sollevare il braccio leva e asciugare entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio pulito, asciutto e senza pelucchi.Successivamente, aprire il software NanoDrop e selezionare l'applicazione per acidi nucleici. Utilizzare una pipetta calibrata a volume ridotto per eseguire una misurazione del bianco, dispensando un microlitro di tampone sulla superficie ottica inferiore. Abbassare il braccio della leva e selezionare "bianco" nell'applicazione per acidi nucleici.Una volta completata la misurazione del bianco, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio. Come in precedenza, selezionare la costante appropriata per il campione da misurare. Successivamente, dispensare un microlitro di campione di acido nucleico sul piedistallo ottico inferiore e chiudere il braccio della leva.Poiché la misurazione è indipendente dal volume, il campione deve semplicemente coprire l'intervallo tra le due superfici ottiche. Per effettuare una misurazione, selezionare "misura" nel software applicativo; il software calcolerà automaticamente la concentrazione dell'acido nucleico e i rapporti di purezza. Dopo la misurazione del campione, esaminare l'output spettrale. Un campione tipico di acido nucleico presenta un profilo molto caratteristico.Gli indicatori spettrali di un campione di scarsa qualità includono picchi di lunghezza d'onda nel minimo e nel picco a 260 nanometri. Le comuni fonti di contaminanti associate a specifiche tecniche di isolamento degli acidi nucleici comprendono fenolo, triolo ed estrazione su colonna. Nel caso dell'estrazione con fenolo-triolo, una contaminazione residua del reagente può essere indicata da spettri anomali compresi tra 220 e 240 nanometri, nonché da spostamenti nella regione compresa tra 260 e 280 nanometri.Al contrario, i residui di guanidina provenienti dall'estrazione su colonna possono contribuire a un picco vicino a 230 nanometri e a uno spostamento del minimo da 230 nanometri a circa 240 nanometri. Per valutare accuratamente la purezza del campione, il rapporto 2 62 80 e il rapporto 2 62 30 devono essere analizzati in combinazione con la qualità spettrale complessiva. Gli acidi nucleici puri producono tipicamente un rapporto 2 62 80 di circa 1,8 per il DNA e di circa 2,0 per l'RNA.Questo rapporto dipende dal pH e dalla forza ionica del tampone utilizzato per effettuare le misurazioni del bianco e del campione. Lo spettrofluorimetro Banana Drop 3, 300 impiega lo stesso sistema brevettato di ritenzione del campione a microvolume utilizzato dallo spettrofotometro NanoDrop 2000 C. Con misurazioni di fluorescenza eseguite utilizzando appena un microlitro di campione, l'utente seleziona uno dei tre LED come sorgente di eccitazione, che emette radiazione orizzontalmente sul campione.La fluorescenza del campione successivo viene quindi raccolta ad un angolo di 90 gradi verticalmente in uno spettrometro interno. Per dimostrare la quantificazione di acidi nucleici in volume micro con elevata sensibilità utilizzando il NanoDrop 3300, si utilizza un kit di fluorescenza pico green per iniziare l'equilibrazione, portando gli standard del kit e tutti i campioni di acidi nucleici alla temperatura ambiente. I campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e devono essere conservati in provette di colore ambrato o avvolte in alluminio.Preparare una quantità sufficiente di buffer 1X TE per tutti gli standard e i campioni da misurare, nonché per la soluzione lavorativa di Pico Green necessaria. Preparare il buffer 1X TE diluendo il buffer 20X TE fornito con acqua priva di nucleasi seguendo il protocollo del produttore. I volumi di reazione possono variare da 200 microlitri fino a soli 10 microlitri.In questo esempio, prepareremo volumi di reazione di 10 microlitri. Successivamente, preparare standard di DNA a doppio filamento diluiti in serie e provette o vial libere da nucleasi. Questo coprirà l'intervallo di concentrazione previsto dei campioni di DNA sconosciuti.Trasferire cinque microlitri di ciascuno degli standard di DNA a doppio filamento diluiti in un tubo etichettato individualmente, privo di nucleasi e di colore ambrato o coperto con carta stagnola. Successivamente, aliquotare cinque microlitri di ciascun campione di DNA a doppio filamento di interesse nel tubo corrispondente protetto dalla luce. Dopo aver preparato la soluzione di lavoro Pico Green seguendo il protocollo del produttore, trasferire un volume uguale di tale soluzione in ciascun tubo contenente lo standard di DNA a doppio filamento o il campione di DNA a doppio filamento, in questo caso cinque microlitri.Combinare volumi uguali di un buffer XTE e della soluzione lavorativa di Pico Green. Per preparare il controllo negativo, che funge da soluzione di riferimento, mescolare accuratamente il contenuto di ogni provetta mediante pipettaggio delicato e lasciare incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Tutti i campioni e gli standard devono essere portati alla stessa temperatura prima della misurazione, poiché il segnale fluorescente è influenzato dalla temperatura. Per preparare lo strumento ed effettuare le misurazioni, pulire innanzitutto le superfici superiore e inferiore del sistema di ritenzione del campione, quindi pipettare da due a tre microlitri di acqua deionizzata sulla superficie ottica inferiore. Aprire quindi il braccio di leva e asciugare con un panno da laboratorio pulito e senza lanugine i supporti superiore e inferiore.Assicurarsi che le superfici siano prive di pelucchi prima di procedere. I pelucchi possono emettere fluorescenza in presenza di una sorgente di eccitazione e possono interferire con la misurazione. Aprire il software dello strumento.Selezionare l'applicazione per acidi nucleici e scegliere l'opzione DNA a doppio filamento con pico green. Pipettare due microlitri di XTE 1X sul perno inferiore. Chiudere la leva e selezionare "blank" nel campo del software dello strumento. Al termine della lettura del bianco, asciugare con carta da filtro la soluzione del bianco da entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione.Successivamente, mescolare la soluzione di riferimento mediante pipettaggio delicato utilizzando punte a bassa ritenzione. Pipettare due microlitri della soluzione di riferimento sul perno inferiore e chiudere il braccio della leva. Selezionare riferimento nella scheda standard e scegliere le unità desiderate.Fare clic su misura per avviare il ciclo di misurazione. Al termine del ciclo di misurazione, aprire il braccio della leva e asciugare accuratamente le superfici del sistema di ritenzione del campione. Eseguire fino a cinque repliche del campione di riferimento utilizzando un nuovo Eloqua per ciascuna replica.Ripetere il processo per gli standard aggiuntivi al fine di costruire una curva standard. È possibile utilizzare fino a sette standard. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque replicati per ogni standard.Le repliche degli standard vengono mediate per generare una curva standard, sulla base della quale le concentrazioni dei campioni vengono determinate automaticamente. Una volta completata la curva standard, selezionare la scheda dei campioni, inserire le informazioni relative all'ID di ciascun campione e misurare ogni campione sconosciuto. Una curva valida indica che è stato raggiunto il numero minimo di standard richiesto.La concentrazione di DNA è determinata automaticamente in base alla curva standard. Lo strumento a microvolume NanoDrop può determinare la concentrazione di acidi nucleici mediante misurazioni dirette a A260 o metodi fluorometrici indiretti. I fotometri NanoDrop possono inoltre essere utilizzati per quantificare le proteine mediante assorbanza diretta a A280 o tramite saggi colorimetrici per proteine.

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