NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Il sistema di ritenzione del campione NanoDrop è una tecnologia innovativa che sfrutta la tensione superficiale intrinseca dei liquidi per trattenere e misurare campioni in microvolume tra due supporti ottici, senza l'uso di QTS o capillari. Basta prelevare direttamente con una pipetta un microlitro di campione e depositarlo sulla superficie ottica inferiore. Chiudendo il braccio dello spettrometro, si forma una colonna di liquido tra i supporti ottici superiore e inferiore.

Formando una tensione superficiale che crea un percorso ottico verticale, la lunghezza del percorso può cambiare automaticamente in tempo reale durante la misurazione. L'accorciamento del percorso ottico consente la misurazione di concentrazioni più elevate, eliminando efficacemente la necessità di effettuare diluizioni per la maggior parte dei campioni di acidi nucleici. Inoltre, il sistema di ritenzione del campione accelera il processo sperimentale grazie a una rapida pulizia, che consiste semplicemente nello strofinare le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio.

Oggi illustreremo due procedure per determinare la concentrazione di acidi nucleici utilizzando strumentazione termica a microvolume. Il primo protocollo consiste in una misurazione diretta degli acidi nucleici mediante lo spettrofotometro NanoDrop 2000 C. Il secondo protocollo è una misurazione indiretta degli acidi nucleici mediante fluorescenza, effettuata con lo spettrofluorimetro NanoDrop 3,300.

Per iniziare, pulire le superfici ottiche superiore e inferiore del sistema di ritenzione del campione dello spettrofotometro a volume microellettrico pipettando due o tre microlitri di acqua deionizzata pulita sulla superficie ottica inferiore. Chiudere il braccio leva assicurandosi che il perno superiore entri in contatto con l'acqua deionizzata. Sollevare il braccio leva e asciugare entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio pulito, asciutto e senza pelucchi.

Successivamente, aprire il software NanoDrop e selezionare l'applicazione per acidi nucleici. Utilizzare una pipetta calibrata a volume ridotto per eseguire una misurazione del bianco, dispensando un microlitro di tampone sulla superficie ottica inferiore. Abbassare il braccio della leva e selezionare "bianco" nell'applicazione per acidi nucleici.

Una volta completata la misurazione del bianco, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto da laboratorio. Come in precedenza, selezionare la costante appropriata per il campione da misurare. Successivamente, dispensare un microlitro di campione di acido nucleico sul piedistallo ottico inferiore e chiudere il braccio della leva.

Poiché la misurazione è indipendente dal volume, il campione deve semplicemente coprire l'intervallo tra le due superfici ottiche. Per effettuare una misurazione, selezionare "misura" nel software applicativo; il software calcolerà automaticamente la concentrazione dell'acido nucleico e i rapporti di purezza. Dopo la misurazione del campione, esaminare l'output spettrale. Un campione tipico di acido nucleico presenta un profilo molto caratteristico.

Gli indicatori spettrali di un campione di scarsa qualità includono picchi di lunghezza d'onda nel minimo e nel picco a 260 nanometri. Le comuni fonti di contaminanti associate a specifiche tecniche di isolamento degli acidi nucleici comprendono fenolo, triolo ed estrazione su colonna. Nel caso dell'estrazione con fenolo-triolo, una contaminazione residua del reagente può essere indicata da spettri anomali compresi tra 220 e 240 nanometri, nonché da spostamenti nella regione compresa tra 260 e 280 nanometri.

Al contrario, i residui di guanidina provenienti dall'estrazione su colonna possono contribuire a un picco vicino a 230 nanometri e a uno spostamento del minimo da 230 nanometri a circa 240 nanometri. Per valutare accuratamente la purezza del campione, il rapporto 2 62 80 e il rapporto 2 62 30 devono essere analizzati in combinazione con la qualità spettrale complessiva. Gli acidi nucleici puri producono tipicamente un rapporto 2 62 80 di circa 1,8 per il DNA e di circa 2,0 per l'RNA.

Questo rapporto dipende dal pH e dalla forza ionica del tampone utilizzato per effettuare le misurazioni del bianco e del campione. Lo spettrofluorimetro Banana Drop 3, 300 impiega lo stesso sistema brevettato di ritenzione del campione a microvolume utilizzato dallo spettrofotometro NanoDrop 2000 C. Con misurazioni di fluorescenza eseguite utilizzando appena un microlitro di campione, l'utente seleziona uno dei tre LED come sorgente di eccitazione, che emette radiazione orizzontalmente sul campione.

La fluorescenza del campione successivo viene quindi raccolta ad un angolo di 90 gradi verticalmente in uno spettrometro interno. Per dimostrare la quantificazione di acidi nucleici in volume micro con elevata sensibilità utilizzando il NanoDrop 3300, si utilizza un kit di fluorescenza pico green per iniziare l'equilibrazione, portando gli standard del kit e tutti i campioni di acidi nucleici alla temperatura ambiente. I campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e devono essere conservati in provette di colore ambrato o avvolte in alluminio.

Preparare una quantità sufficiente di buffer 1X TE per tutti gli standard e i campioni da misurare, nonché per la soluzione lavorativa di Pico Green necessaria. Preparare il buffer 1X TE diluendo il buffer 20X TE fornito con acqua priva di nucleasi seguendo il protocollo del produttore. I volumi di reazione possono variare da 200 microlitri fino a soli 10 microlitri.

In questo esempio, prepareremo volumi di reazione di 10 microlitri. Successivamente, preparare standard di DNA a doppio filamento diluiti in serie e provette o vial libere da nucleasi. Questo coprirà l'intervallo di concentrazione previsto dei campioni di DNA sconosciuti.

Trasferire cinque microlitri di ciascuno degli standard di DNA a doppio filamento diluiti in un tubo etichettato individualmente, privo di nucleasi e di colore ambrato o coperto con carta stagnola. Successivamente, aliquotare cinque microlitri di ciascun campione di DNA a doppio filamento di interesse nel tubo corrispondente protetto dalla luce. Dopo aver preparato la soluzione di lavoro Pico Green seguendo il protocollo del produttore, trasferire un volume uguale di tale soluzione in ciascun tubo contenente lo standard di DNA a doppio filamento o il campione di DNA a doppio filamento, in questo caso cinque microlitri.

Combinare volumi uguali di un buffer XTE e della soluzione lavorativa di Pico Green. Per preparare il controllo negativo, che funge da soluzione di riferimento, mescolare accuratamente il contenuto di ogni provetta mediante pipettaggio delicato e lasciare incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Tutti i campioni e gli standard devono essere portati alla stessa temperatura prima della misurazione, poiché il segnale fluorescente è influenzato dalla temperatura. Per preparare lo strumento ed effettuare le misurazioni, pulire innanzitutto le superfici superiore e inferiore del sistema di ritenzione del campione, quindi pipettare da due a tre microlitri di acqua deionizzata sulla superficie ottica inferiore. Aprire quindi il braccio di leva e asciugare con un panno da laboratorio pulito e senza lanugine i supporti superiore e inferiore.

Assicurarsi che le superfici siano prive di pelucchi prima di procedere. I pelucchi possono emettere fluorescenza in presenza di una sorgente di eccitazione e possono interferire con la misurazione. Aprire il software dello strumento.

Selezionare l'applicazione per acidi nucleici e scegliere l'opzione DNA a doppio filamento con pico green. Pipettare due microlitri di XTE 1X sul perno inferiore. Chiudere la leva e selezionare "blank" nel campo del software dello strumento. Al termine della lettura del bianco, asciugare con carta da filtro la soluzione del bianco da entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione.

Successivamente, mescolare la soluzione di riferimento mediante pipettaggio delicato utilizzando punte a bassa ritenzione. Pipettare due microlitri della soluzione di riferimento sul perno inferiore e chiudere il braccio della leva. Selezionare riferimento nella scheda standard e scegliere le unità desiderate.

Fare clic su misura per avviare il ciclo di misurazione. Al termine del ciclo di misurazione, aprire il braccio della leva e asciugare accuratamente le superfici del sistema di ritenzione del campione. Eseguire fino a cinque repliche del campione di riferimento utilizzando un nuovo Eloqua per ciascuna replica.

Ripetere il processo per gli standard aggiuntivi al fine di costruire una curva standard. È possibile utilizzare fino a sette standard. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque replicati per ogni standard.

Le repliche degli standard vengono mediate per generare una curva standard, sulla base della quale le concentrazioni dei campioni vengono determinate automaticamente. Una volta completata la curva standard, selezionare la scheda dei campioni, inserire le informazioni relative all'ID di ciascun campione e misurare ogni campione sconosciuto. Una curva valida indica che è stato raggiunto il numero minimo di standard richiesto.

La concentrazione di DNA è determinata automaticamente in base alla curva standard. Lo strumento a microvolume NanoDrop può determinare la concentrazione di acidi nucleici mediante misurazioni dirette a A260 o metodi fluorometrici indiretti. I fotometri NanoDrop possono inoltre essere utilizzati per quantificare le proteine mediante assorbanza diretta a A280 o tramite saggi colorimetrici per proteine.