Name: Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Impara a registrare otticamente l'attività neuronale nel ganglio stomatogastrico del granchio utilizzando coloranti sensibili al voltaggio. Questa tecnica consente di studiare le interazioni sinaptiche senza i limiti degli elettrodi.

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Noi riconosciamo il sostegno della Facoltà di Scienze Informatica e Facoltà di Scienze, Agricoltura e Ingegneria dell&#39;Università di Newcastle, da parte dell&#39;Università di Ulm, e dal SciMedia Ltd (Tokyo, Giappone).

1. Preparazione del Sistema Nervoso Granchio Stomatogastric Adulto Cancer pagurus L. sono stati ottenuti da fonti locali (Università di Newcastle, Colomba Marine Laboratories) e tenuti in filtrata, l'acqua di mare aerata (10 - 12 ° C). Gli animali sono stati anestetizzati da imballaggio in ghiaccio per 20 - 40 min prima della dissezione. Abbiamo utilizzato sistemi isolati stomatogastric nervoso (STNS) 1. Il STNS è stato immobilizzato in un silicone elastomero alberato (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Monaco, Germania) piastra di Petri e continuamente superfused (7 - 12 ml / min) con soluzione fisiologica fredda (10-13 ° C). Soluzione fisiologica composta da (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; trisma di base, 10; acido maleico, 5. Saline è stato mantenuto a una temperatura costante di 11 - 13 ° C ed a pH 7,4-7,6. La procedura dettagliata della dissezione STNS e preparazione, tra cui il desheathing del ganglio stomatoastric (STG), sono presentati in questo articolo JOVE da Guttierez e Grashow 1. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la Direttiva Europea Comunità del Consiglio ° 24 novembre 1986 (86/609/CEE). La figura 1A mostra un diagramma schematico del STNS e Figura 1B mostra un tipico STG desheathed abbia la neuroni disposti a semicerchio pianeggiante nella parte posteriore del ganglio. La piastra di Petri con il STNS è fissato alla piattaforma operativa del microscopio imaging (BW51 WI, Olympus, Tokyo, Giappone) con il pongo. Sia la fase di microscopio e il microscopio sono montate su una tavola vibrante isolato (Scientifica, Uckfield, Regno Unito) per evitare artefatti da movimento durante la registrazione ottica. Gli schemi motori generato nel ganglio stomatogastric (STG) sono monitorati con registrazioni extracellulari 2-4. Questo viene fatto attraverso i seguenti passi: <ol><li> Un compartimento vaselina a base cilindrica è costruito attorno a una sezione del nervo motore principale (LVN) per isolare elettricamente il nervo dal bagno (questo viene fatto sul palco dissezione prima scatola di Petri è posta sulla piattaforma operativa del microscopio di imaging ). </li><li> Uno dei due cavi in ​​acciaio inossidabile elettrodo viene posto in questo comparto, l'altra nella vasca da bagno come un elettrodo di riferimento. </li><li> Il segnale differenziale viene registrato, filtrato e amplificato con un amplificatore differenziale AC (Univ. Kaiserslautern, Germania). </li><li> L'attività motoria del ganglio è controllata mediante un oscilloscopio (DL708E, Yokogawa, Tokyo, Giappone) ed è inoltre registrata usando una scheda di acquisizione dati (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) e il Spike 2 v6.10 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). I file vengono analizzati utilizzando Spike 2 v6.10 (Electronic Design a Cambridge, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Preparazione della soluzione colorante Abbiamo usato la tensione fluorescente sensibile colorante Di-8-ANEPPQ (Bioscience Cambridge) 5, che ha una doppia carica positiva che facilita il caricamento del colorante attraverso microelettrodi utilizzando positivi impulsi di corrente. La soluzione colorante deve essere protetto dalla luce quanto più possibile. La soluzione colorante si prepara come segue: <ol><li> 5 mg di colorante è mescolato con 1 ml di F-127 acido Pluronic in DMSO (Invitrogen) soluzione. </li><li> Il flacone di plastica contenente il colorante dissolto è centrifugato per 20 minuti a 12.000 rotazione / minuto in un Microcentrifuga Sigma 1-14 (Sigma, Osterode, Germania) al fine di separare le particelle del colorante più grande che può intasare il microelettrodo. </li><li> Il supernatante (top 200 mL) della soluzione colorante è separato mediante una pipetta e memorizzati in un flaconcino di plastica separato. Entrambi i flaconi sono avvolti in carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce. </li><li> La soluzione colorante è congelato a -20 ° C. </li><li> Prima di usare la soluzione colorante è fuso ponendo la provetta chiusa e avvolta nel caldo (25 ° C) per 10-15 minuti. </li></ol> 3. Colorante di caricamento mediante iniezione intracellulare mediante microelettrodi Sharp Abbiamo usato microelettrodi forte per caricare i neuroni con il colorante. Per controllare il carico colorante usiamo il sistema di imaging MiCAM02 (SciMedia, Tokyo, Giappone) 6. Il sistema di imaging è dotato di due telecamere CCD: la fotocamera HR ha un chip sensore più grande (6,4 mm x 4,8 mm) che fornisce una migliore risoluzione spaziale con la migliore risoluzione temporale è 1,4 ms, la fotocamera HS è una più piccola (2,9 mm x 2,1 millimetri), ma più veloce chip del sensore consentendo una più rapida immagini aventi 0,7 ms come la sua migliore risoluzione temporale. Le fasi del carico colorante sono i seguenti: <ol><li> Microelettrodi sono tirati con un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) estrattore elettrodo con 10 cm di lunghezza, 1 mm di diametro esterno tubi di vetro con filamento (GB100TF 8P, Prodotti Scienza, Hofheim, Germania). Gli elettrodi sono tirati per avere una resistenza algamma di 25-40 MOhm in 3M KCl (appropriato per le impostazioni dei parametri tirando seguire il libro di cucina pipetta fornita dal creatore del estrattore elettrodo). </li><li> La soluzione colorante congelato è fuso e una quantità molto piccola di essa viene aspirata in un ago Microfil (Microfil - 34G, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA) - il colorante aspirato riempie intorno ° 2 / 3 del l'ago Microfil . </li><li> La soluzione colorante in Microfil l'ago viene iniettato nella punta di un microelettrodo. Il microelettrodo è posto in una scatola scura per 15 minuti. </li><li> Il microelettrodo è riempito con una soluzione 3M KCl. L'elettrodo viene posto nuovamente dentro una scatola buia stoccaggio elettrodo per altri 10-20 minuti per consentire la soluzione di colorante per raggiungere la punta fine dell'elettrodo per l'aspirazione della forza capillare che agiscono in microelettrodo. </li><li> Il microelettrodo pronto viene inserito in un portaelettrodo e fissato sul headstage dell'amplificatore intracellulare (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> L'amplificatore intracellulare è collegato alla scheda di acquisizione dati che fornisce un impulso per guidare impulsi di corrente nel microelettrodo. </li><li> Il microelettrodo è posta delicatamente nella membrana di un neurone STG utilizzando un manipolatore microelettrodo (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK). Dal momento che la distanza di lavoro dell'obiettivo 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 millimetri; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone) del microscopio di imaging è molto piccolo, il microelettrodo deve essere posizionato in posizione obliqua (circa 30 °) e il movimento del microelettrodo nella giusta posizione richiede diversi passaggi di riorientamento del microscopio e l'obiettivo di spostare il microelettrodo. Per avviare il microelettrodo viene spostato in una posizione tale che la sua punta è superiore alla STG. L'obiettivo microscopio si abbassa fino alla punta dell'elettrodo appare a fuoco. Poi si abbassa ulteriormente, ma non così tanto da toccare il microelettrodo. Il microelettrodo si abbassa fino a che non riappare nel fuoco dell'obiettivo. Questi passaggi si ripetono fino a quando i neuroni appaiono chiaramente nel piano di messa a fuoco dell'obiettivo. Poi il microelettrodo si abbassa fino a che tocca e penetra delicatamente la membrana del neurone STG selezionato. Questo è controllata mediante l'oscilloscopio. </li><li> L'elettrodo intracellulare è usato per registrare l'attività del neurone STG selezionati al fine di individuare il neurone dato il suo profilo di attività e il rapporto tra la sua attività e l'attività STG registrato dall'elettrodo extracellulare 2,3,7. </li><li> L'amplificatore intracellulare è impostato in modalità di iniezione di corrente e viene utilizzato per 30 minuti a iniettare 10 nA positivi passi corrente nel microelettrodo che durano per 1 secondo e sono separati da 1 secondo con lacune senza corrente iniettata al microelettrodo. Le unità corrente iniettata le molecole cariche positivamente colorante nel neurone registrato. Se l'equipaggiamento è disponibile neuroni multipli possono essere iniettati contemporaneamente. </li><li> Dieci minuti dopo il periodo di iniezione e dopo la fine dell'iniezione la diffusione colorante all'interno del neurone sia selezionata. Per fare questo usiamo il MiCAM02 sistema di imaging (SciMedia Ltd, Tokyo, Giappone) con l'obiettivo 10x e illuminazione dal bassissimo sorgente luminosa alogena ondulazione (HL-151; MORITEX, Tokyo, Giappone) attraverso il filtro MSWG2 cubo (con 480-550 nm di eccitazione filtro; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone). Il sistema di imaging è impostato per utilizzare la fotocamera HR con 192 x 128 pixel di risoluzione, 40 ms di tempo di imaging, la modalità 'hbin', e 10 fotogrammi al sessione di imaging. Se il ripieno colorante è successo l'imaging dovrebbe mostrare una patch tinto in neurone intorno alla posizione del microelettrodo, e questa patch tinto dovrebbe crescere tra le immagini scattate dopo 10 minuti e dopo 30 minuti. Se la diffusione del colorante è insufficiente dopo 30 min, tempo di iniezione più è concesso. In alternativa, un elettrodo nuovo colorante può essere utilizzato. </li><li> L'elettrodo è tirato fuori del neurone e il neurone è lasciato a rilassarsi per almeno 20-30 minuti. All'interno di questo tempo, il neurone successivo può essere iniettato con colorante. </li></ol> 4. Imaging di neuroni Tinti L'attività dei singoli neuroni possono essere ripreso dopo la procedura di tintura di riempimento. In alternativa due o più neuroni possono essere riempiti immagine l'attività simultanea di diversi neuroni STG. In linea di principio molti e forse tutti i neuroni STG può essere riempito con un colorante. Le immagini dei neuroni è fatto con il sistema 02 MICAM immagini utilizzando la fotocamera HR. La procedura di imaging è la seguente: <ol><li> L'obiettivo microscopio è cambiato e una elevata trasmissione luminosa efficienza obiettivo 20x (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 millimetri; Olympus Corporation, Tokyo, Giappone) è utilizzato per la raccolta dei dati di imaging. Questo obiettivo raccoglie molta più luce che l'obiettivo 10x e dà anche maggiore ingrandimento fornendo un'immagine più dettagliata dei neuroni. Bein g significa più efficiente luce di quel poco di colorante di caricamento è già visibile con questo obiettivo e anche che siamo in grado di utilizzare l'intensità della luce più bassa per l'imaging riducendo il danno potenziale foto che possono essere causati ai neuroni del colorante. </li><li> Fase operativa del microscopio è posizionato in modo tale che i neuroni che sono destinati ad essere ripreso sono nel campo di vista l'obiettivo e l'obiettivo si concentra su di loro. </li><li> I dati di registrazione extracellulare è immessa nel sistema di imaging 02 Micam attraverso il suo canale di ingresso analogico. Questo permette al relativamente facile relative dei segnali ottici e schemi motori corrispondenti o picchi extracellulare registrato nella fase di analisi. </li><li> Il sistema di Micam 02 è impostato per utilizzare 96 x 64 pixel di risoluzione con 2,2 ms di tempo di imaging o 48 x 32 pixel di risoluzione con 1,5 ms di tempo di imaging. In entrambi i casi l'impostazione 'hbin' può essere utilizzata se la tintura dei neuroni non è molto forte. </li><li> Il livello di luce è quanto più basso possibile (cioè il colorante nei neuroni dovrebbe generare ancora sufficiente a fluorescenza per l'imaging) per evitare foto modulazione e danni foto dei neuroni registrati. </li><li> L'illuminazione della stanza e tutte le sorgenti luminose sono rimasti spenti. Inoltre, una tenda nera può essere chiusa attorno alla piattaforma di registrazione per evitare l'esposizione alla luce da fonti esterne. </li><li> Le sessioni di imaging sono impostati per essere tra 4 - 16 secondi di lunghezza. </li><li> L'attività spontanea dei neuroni tinto è registrato nel corso delle sessioni di imaging diverse. </li></ol> 5. Analisi dei Dati Optical Imaging Per analizzare i dati di immagini abbiamo usato il software BVAna (versione 10,08; SciMedia Ltd., Tokyo, Giappone) associati al sistema 02 MICAM di imaging. Il software supporta la visualizzazione dei dati di imaging e offre una gamma di strumenti di analisi pure. Le fasi dell'analisi dei dati e l'interpretazione sono i seguenti: <ol><li> Una regione appropriata circolare di interesse selezionati in ogni neuroni registrati. Di solito usiamo 2-3 regioni pixel raggio di interesse per lo studio dei neuroni a x 48 32 pixel di risoluzione, e 6 - 8 regioni pixel raggio di interesse per lo studio dei neuroni a 96 x 64 risoluzione. </li><li> Il livellamento temporale dei dati può essere necessario, specialmente se il colorante genera quantità relativamente bassa di fluorescenza (valore di fondo basso i dati indicano questo, che può essere dovuto al basso livello di luce che viene utilizzato o basso carico colorante livello, per esempio in una neurite del neurone registrato). Di solito in questi casi abbiamo usato smoothing temporale con 3 - 5 unità di tempo. </li><li> Oltre alle registrazioni ottica abbiamo anche visualizzare la registrazione extracellulare selezionando per visualizzare l'ingresso analogico del sistema di imaging. </li><li> I parametri per la visualizzazione dei dati ottici e l'ingresso analogico deve essere impostato in modo idoneo a vedere tutte le registrazioni sullo schermo del computer. </li><li> Considerando le registrazioni ottiche dei neuroni, la registrazione extracellulare dal LVN, e la classificazione del neurone basato sulla registrazione intracellulare in precedenza, è possibile determinare l'identità del neurone e mettere in relazione la sua attività alle attività neurale registrato dal nervose. </li><li> Si prevede che le registrazioni ottiche mostrano chiaramente, e senza la necessità di una media su più eventi simili, le attività neurale corrispondente ai picchi registrati extracellulare e anche eventi sottosoglia come inibitori post-sinaptico potenziali causati dall'attività di altri neuroni. </li><li> L'esportazione dei dati caratteristiche del software BVAna può essere utilizzato per esportare le registrazioni ottico calcolato per le regioni di interesse selezionati e anche l'ingresso analogico che contiene la registrazione dal LVN. I dati esportati possono essere elaborati e analizzati ulteriormente utilizzando altri software di analisi dei dati, nonché (per esempio, nel caso più semplice di Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) possono essere utilizzati per la visualizzazione e l'elaborazione dei dati aggiuntivi). </li></ol> 6. Rappresentante Risultati La figura 2 mostra la registrazione simultanea di due neuroni (LP, laterale pilorica neurone, PD, pilorica dilatatore neurone) nel generatore pilorica modello centrale di un granchio STG insieme con la registrazione dal LVN. Le registrazioni ottico dei neuroni LP e PD identificati sulla base delle loro registrazioni intracellulari mostrano che effettivamente queste corrispondono bene con le registrazioni extracellulari corrispondenti ai neuroni LP e PD. C'è un consistente ritardo 12 ms tra le registrazioni ottiche e LVN dei picchi di punta (vedi riquadro di Figura 2) a causa del ritardo di trasmissione assonale tra il ganglio e il sito di registrazione extracellulare. I dati presentati mostra anche che l'attività neurale nel soma che corrisponde ai picchi dei neuroni registrati sia chiaramente rilevabile. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/&gt; Figura 1. A) Schema del sistema nervoso stomatogastric (STNS). CoG, commissurali ganglio; OG, ganglio esofageo, STG, ganglio stomatogastric; stn, nervo stomatogastric; LVN, nervo del ventricolo laterale. B) Il ganglio granchio stomatogastric (STG) - l'immagine mostra la disposizione semicircolare posteriore di neuroni STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Simultanea registrazione singola scansione di un PD e un neurone LP con la registrazione del LVN. I dati mostrano che che le registrazioni del nervo ottico e partita molto bene e che siamo in grado di individuare le attività neurale corrispondente ai picchi registrati formare il nervo. L'inserto mostra una sovrapposizione di movimenti diversi di potenziali d'azione LP - sia otticamente che elettricamente registrate - e la loro media dimostrando la corrispondenza tra otticamente e attività elettrica registrata. A causa del fatto che il nostro metodo di registrazione ottica non filtra le componenti a bassa frequenza dei dati siamo anche in grado di registrare i cambiamenti lenti potenziale di membrana caratteristici per PD e LP neuroni 14.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il colorante sensibile tensione di imaging di 8,9 STG neuroni in combinazione con i tradizionali metodi di elettrofisiologia (registrazioni elettrodo intra ed extracellulare) consente una migliore comprensione di come questo piccolo, funziona bene conosciuto e ancora complesso sistema neurale. La STG è un prototipo di centrale modello generatore (CPG) reti neuronali (comprende il piloro e gastriche reti ritmo mulino) 10,, 11, quindi una migliore comprensione delle proprietà emergenti funzionali del STG aiuterà anche a capire come, in generale, reti CPG generare la loro funzionalità a livello di rete. Reti CPG giocano un ruolo critico nel controllo motorio 12 e anche nelle funzioni cognitive superiori 13, di conseguenza, una migliore comprensione delle loro proprietà emergenti possono avere un grande impatto in molte aree delle neuroscienze.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Sistema di imaging</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Software di analisi dati per il sistema di imaging MiCAM02</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokyo, Giappone</td><td></td><td>Sorgente luminosa alogena ad ondulazione ultra-bassa</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Microscopio eretto per imaging in epifluorescenza</td></tr><tr><td>Obiettivo di imaging 20x </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2,0 mm</td></tr><tr><td>Obiettivo di imaging 10x </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0,30, WD 3,3 mm</td></tr><tr><td>Cubo filtro con filtro di eccitazione 480-550 nm e filtro di emissione 590 nm </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrazione</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore di elettrodi PatchStar</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>Manipolatore di microelettrodi</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Scheda di acquisizione dati</td></tr><tr><td>Oscilloscopio DL708E</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Amplificatore intracellulare</td></tr><tr><td>Amplificatore differenziale in corrente alternata</td><td>Università di Kaiserslautern, Germania</td><td></td><td>Amplificatore extracellulare</td></tr><tr><td>P-97 Flaming &amp;#8211; Brown type electrode puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Tiratore di elettrodi</td></tr><tr><td>Centrifuga Sigma Microcentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>Pipette Genex Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>Micropipetta di vetro con filamento</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>Vetro per micro&amp;#8211;elettrodi</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Ago Microfil</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Software di elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>Colorante fluorescente sensibile alla tensione</td></tr><tr><td>Acido Pluronic F-127, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Componente della soluzione salina per granchio</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Componente della soluzione salina per granchio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Componente della soluzione salina per granchio, soluzione elettrolitica</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Componente della soluzione salina per granchio</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Componente della soluzione salina per granchio</td></tr><tr><td>Acido malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Componente della soluzione salina per granchio</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, Monaco, Germania</td><td></td><td>Rivestimento delle piastre di Petri</td></tr></tbody></table>

imaging ottico di neuroni nel ganglio granchio stomatogastric con tensione sensibili coloranti

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltaggio-sensibile di imaging tinta di neuroni è una metodologia chiave per la comprensione del funzionamento delle reti neuronali sono organizzate e come l&#39;attività simultanea di neuroni che partecipano porta alla nascita della funzionalità integrante della rete. Qui vi presentiamo la metodologia di applicazione di questa tecnica per generare neuroni modello individuato nel ganglio granchio stomatogastric. Dimostriamo il caricamento di questi neuroni con la tensione fluorescente sensibile colorante Di-8-ANEPPQ e mostriamo come immagine l&#39;attività dei neuroni colorante caricato utilizzando il MiCAM02 ad alta velocità e ad alta risoluzione CCD sistema di imaging. Dimostriamo l&#39;analisi dei dati di imaging registrati utilizzando il software di imaging BVAna associati al sistema MiCAM02 imaging. La simultanea di tensione-sensibili di imaging colorante dell&#39;attività dettagliati dei neuroni nel ganglio più granchio stomatogastric applicata insieme con le tradizionali tecniche di elettrofisiologia (registrazioni intracellulari ed extracellulari) apre radicalmente nuove opportunità per la comprensione di come centrale generatore di reti neurali lavoro modello.

Qui vi presentiamo la metodologia per una rapida e ad alta risoluzione fluorescenti tensione-sensibili di imaging tintura di attività dettagliata dei neuroni del ganglio stomatogastric granchio.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

L'imaging con coloranti sensibili al voltaggio dei neuroni è una metodologia fondamentale per comprendere come siano organizzate le reti neuronali e come l'attivazione simultanea...

Lo scopo del seguente esperimento è utilizzare coloranti sensibili al voltaggio per registrare otticamente le variazioni del potenziale di membrana e le interazioni sinaptiche tra neuroni nei generatori di pattern centrali del ganglio somatico asterisco del crostaceo St. Questo viene ottenuto caricando neuroni identificati con il DD otto e al PQ mediante iniezione ionoforetica usando microelettrodi affilati e registrando contemporaneamente l'attività nervosa motoria in modo extracellulare. Come secondo passaggio, la fluorescenza del colorante sensibile al voltaggio viene eccitata da luce verde, permettendo l'acquisizione di variazioni di fluorescenza corrispondenti ai cambiamenti nel potenziale di membrana cellulare. Successivamente, i dati di immagine vengono analizzati selezionando una regione di interesse nella membrana del neurone e confrontando il segnale ottico con l'attività biciclica extracellulare registrata al fine di identificare potenziali d'azione e potenziali sinaptici.Nell'immagine si ottengono risultati da neuroni che mostrano come la registrazione ottica di neuroni generatori di pattern che interagiscono sinapticamente possa integrare le tecniche di registrazione tradizionali e aprire nuove opportunità per comprendere il funzionamento delle reti neurali generatrici di pattern centrali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le registrazioni extracellulari e intracellulari, è che dopo il caricamento mediante immersione, è possibile ottenere registrazioni ottiche dei cambiamenti del potenziale di membrana e delle interazioni sinaptiche senza le restrizioni steriche imposte dal posizionamento degli elettrodi e senza ulteriori danni ai neuroni durante registrazioni a lungo termine. Sebbene questo metodo possa fornire ulteriori informazioni sulla generazione del pattern nel ganglio gastrico dello stomaco dei crostacei.Si può applicare anche ad altri sistemi, come la locomozione e la respirazione nei vertebrati. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà poiché l'iniezione e la preparazione della selezione D sono complesse, e i parametri per l'analisi dei dati immagine devono essere impostati adeguatamente per rilevare i cambiamenti del potenziale di membrana. Iniziare i preparativi preparando la soluzione del colorante fluorescente in un flacone di plastica: mescolare cinque milligrammi del colorante fluorescente sensibile al voltaggio D otto e FPQ con un millilitro di acido F1 27 non ionico in soluzione di DMSO.Successivamente, centrifugare il colorante disciolto per 20 minuti a 12.000 giri al minuto. Al fine di separare le particelle D più grandi che potrebbero ostruire il microelettrodo, dopo la centrifugazione l'utente deve aspirare i primi 200 microlitri del soprannatante ed espellerli in una provetta di plastica separata. Avvolgere la provetta con carta d'alluminio per evitare l'esposizione alla luce.Conservare la soluzione D in un congelatore a meno 20 gradi Celsius il giorno dell'esperimento. Scongelare la soluzione del colorante ponendo la provetta avvolta in acqua a 25 gradi Celsius per 10-15 minuti. Per prepararsi alle registrazioni, iniziare isolando il sistema nervoso gastrico somatico STS di un granchio e rimuovendo la guaina dal ganglio gastrico somatico.Applicare vaselina intorno a un tratto del nervo ventricolare laterale o LVN per creare un compartimento elettricamente isolato. Utilizzare argilla modellabile per fissare la piastra di Petri alla piattaforma operativa del microscopio per immagini. Posizionare un filo elettrodo in acciaio inossidabile nel compartimento di vaselina per registrare dal LVN e un altro elettrodo in acciaio inossidabile nel bagno come elettrodo di riferimento.Quando la soluzione D è scongelata, aspirare una quantità sufficiente di soluzione D per riempire circa due terzi di un ago microfill. Iniettare la soluzione D dall'ago microfill nella punta di un microelettrodo di vetro. Coprire l'elettrodo riempito con il colorante con una scatola e attendere 15 minuti.Quindi riempire l'elettrodo microscopico con una soluzione di cloruro di potassio tre molare. Riporre l'elettrodo microscopico in una scatola oscura per il deposito degli elettrodi per 10-20 minuti, in modo che l'azione capillare spinga la soluzione all'interno della punta fine dell'elettrodo. Dopo 10-20 minuti, posizionare l'elettrodo microscopico in un supporto per elettrodi e collegarlo allo stadio di testa dell'amplificatore intracellulare.L'amplificatore intracellulare è collegato alla scheda di acquisizione dati che fornisce un segnale a impulsi per generare impulsi di corrente nell'elettrodo microscopico. Successivamente, regolare l'elettrodo microscopico in modo da formare un angolo obliquo e posizionarne la punta al di sopra del ganglio gastrico somatico. Abbassare l'obiettivo del microscopio finché la punta dell'elettrodo non è a fuoco.Quindi abbassare l'obiettivo, avendo cura di fermarsi prima di toccare il microelettrodo. Successivamente abbassare il microelettrodo finché non riappare. Con l'obiettivo a fuoco e monitorando l'avanzamento sull'oscilloscopio, perforare delicatamente la membrana del neurone somatico del ganglio gastrico selezionato.A questo punto, confrontare i potenziali d'azione registrati intracellularmente ed extracellularmente. Per identificare il neurone impalato, iniziare l'iniezione del colorante commutando l'amplificatore intracellulare in modalità di iniezione di corrente e iniettando 10 passi di corrente positiva da nanoampere nell'elettrodo microscopico. Ogni passo di corrente deve durare un secondo, separato da intervalli di un secondo senza corrente.Continuare questa iniezione di corrente per 30 minuti. Dopo 10 minuti dall'iniezione del colorante, utilizzare il sistema di imaging MYCA zero two per verificare la diffusione del colorante all'interno del neurone. Ripetere questa operazione, effettuando un controllo dopo 30 minuti.Se il caricamento del colorante ha successo, la zona colorata attorno all'elettrodo microscopico dovrebbe aumentare di dimensioni tra l'immagine a 10 minuti e quella a 30 minuti. Estrarre l'elettrodo dal neurone e lasciare che il neurone si rilassi per almeno 20-30 minuti, consentendo al colorante di diffondersi ulteriormente nella cellula. Durante questo periodo, un altro neurone può essere iniettato con il colorante.Passare all'obiettivo da 20 volte per l'efficienza di trasmissione della luce sul sistema di imaging MYAM zero two. Riposizionare il tavolo operatorio del microscopio secondo necessità e mettere a fuoco il neurone del campo D. Inserire i dati della registrazione extracellulare nel sistema di imaging attraverso il suo canale di ingresso analogico.Spegnere l'illuminazione della stanza e tutte le altre fonti luminose. Inoltre, chiudere una tenda nera intorno all'apparato di registrazione per evitare l'esposizione alla luce proveniente da fonti esterne. Impostare il sistema di acquisizione immagini sulla risoluzione in pixel e sul tempo di acquisizione appropriati indicati nel grafico.Se la colorazione nei neuroni non è molto intensa, utilizzare l'impostazione del bin H. Impostare il livello di luce del microscopio il più basso possibile per evitare la modulazione fotonica e i danni fotoindotti nei neuroni registrati. Impostare le sessioni di acquisizione immagini tra i quattro e i sedici secondi di durata.Quindi registrare l'attività spontanea dei neuroni DY in diverse sessioni di acquisizione. Per iniziare l'analisi delle risposte ottiche utilizzando il software di imaging BV A NA, selezionare una regione circolare appropriata su ciascun neurone registrato se è necessario un filtraggio temporale dei dati. Ad esempio, se il D genera una quantità relativamente bassa di fluorescenza, utilizzare il software per applicare un filtraggio temporale con tre a cinque unità di tempo.I due neuroni iniettati con colorante nell'angolo superiore sinistro di questa figura sono identificati come neurone PD e neurone LP sulla base delle loro registrazioni intracellulari. Le tracce di tensione alla loro destra mostrano le risposte ottiche spontanee di ciascun neurone. La registrazione extracellulare del LVN è mostrata nella parte inferiore della figura.I neuroni LP e PD fanno parte del generatore di modelli centrali pilorici di un ganglio gastrico somatico di granchio e sono reciprocamente inibitori. Le loro registrazioni ottiche possono essere ben sovrapposte alle registrazioni extracellulari del LVN. L'ingrandimento in basso mostra la sovrapposizione di diverse tracce dei potenziali d'azione di LP e la loro media, che dimostrano la corrispondenza tra le attività registrate otticamente ed elettricamente.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e mezza se effettuata correttamente. Dopo questo procedimento, altri metodi come l'immunomarcatura possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quale tipo di sinapsi fosse coinvolto nell'indurre i cambiamenti osservati nel potenziale di membrana. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare otticamente più neuroni identificati e interagenti etalmente nei gangli gastrici dello stomaco.

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