FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

Lo scopo di questa procedura è quello di utilizzare la tecnica di ibridazione fluorescente in situ per determinare il cromosoma sessuale o lo stato di traslocazione di embrioni umani in vitro a rischio di anomalie genetiche. Ciò si ottiene mediante lisi, una biopsia di una singola cellula da un embrione del terzo giorno su un vetrino e l'essiccazione all'aria del nucleo. Il secondo passo consiste nel codificare la natura D e ibridare il DNA del nucleo bersaglio con sonde di DNA marcate con fluorocromi di diversi colori.

Successivamente, la sonda in eccesso viene rimossa con un lavaggio rigoroso e il nucleo viene colorato con una colorazione fluorescente specifica per il DNA. Il passo finale consiste nell'osservare il nucleo utilizzando un microscopio a fluorescenza e nell'acquisire immagini digitali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il numero di copie delle regioni cromosomiche bersaglio attraverso la microscopia a fluorescenza.

In generale, gli individui che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché è al limite della tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza. Con 24 ore di anticipo, preparare il tampone di lisi cellulare per la diffusione delle cellule. Filtrare la soluzione ed erogare un millilitro di aliquote in 10-15 provette sterili da 1,7 millilitri per microcentrifuga, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento a meno 20 gradi Celsius appena prima della procedura di biopsia.

Scongelare il tampone di lisi a temperatura ambiente. Incidere un piccolo cerchio di circa cinque millimetri di diametro sul lato inferiore di un vetrino rivestito di ammina utilizzando una penna diamantata, quindi utilizzando una matita dura a quattro H pre-etichettata il vetrino BLO con un guanto di lattice. Per rimuovere la polvere di grafite, utilizzare una slitta separata per ogni specchio blaster in ordine numerico.

Ora posizionare un piccolo volume di tampone di lisi all'interno del cerchio. Trasferire il blaster per biopsia nel tampone di lisi. Aggiungere il tampone di lisi se necessario per lisare la cellula.

Osservare il nucleo per assicurarsi che rimanga all'interno del cerchio e non vada perso. Se la cellula non ha un nucleo o ha più nuclei, eseguire la biopsia di un'altra cellula. Lasciare asciugare il vetrino all'aria a temperatura ambiente.

Innanzitutto, prelavare i campioni in barattoli coplan utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sciacquare due volte in acqua distillata sterile, disidratare con una serie di etanolo per due minuti ciascuno a temperatura ambiente e asciugare all'aria. Assicurarsi che i vetrini siano completamente immersi e se della polvere di grafite galleggia sulla superficie, immergerli con un fazzoletto pulito.

Registrare la posizione del nucleo all'interno del cerchio visualizzandola con un microscopio a contrasto di fase. Quindi disidratare i campioni con etanolo al 100% per due minuti a temperatura ambiente e asciugare all'aria. Ora applicare due microlitri di miscela di sonde e coprire con un vetrino coprioggetto da nove per nove millimetri.

Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con cemento di gomma. Eseguire la naturing codificata. Applicare un blocco termico a 75 gradi Celsius per cinque minuti, quindi ibridare per una notte in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per ogni barattolo di accoppiamento.

Equilibrare 50 millilitri di soluzione di lavaggio rigoroso 0,4 volte SSC in un bagno d'acqua a 71 gradi Celsius. Mettere il flacone di lavaggio rigoroso e il barattolo di accoppiamento vuoto nel bagnomaria a temperatura ambiente, calore a 71 gradi Celsius, pH il lavaggio rigoroso e decantare nei barattoli di cocincina. Procedere a rimuovere con cura il cemento di gomma da ogni vetrino e risciacquare il vetrino coprioggetti utilizzando quattro volte SSC 0,05% tra 20 pH sette a temperatura ambiente.

Lavare i campioni con il lavaggio rigoroso SSC 0,4 volte a 71 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da quattro volte SSC 0,05%Tween 20 a temperatura ambiente per due minuti. Per le sonde marcate indirettamente, drenare i vetrini dal liquido in eccesso e applicare 20 microlitri di anticorpo coniugato fluorescente sotto un quadrato di 20 x 20 millimetri di paraforma. Incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere la pellicola para ed eseguire i seguenti lavaggi a temperatura ambiente per due minuti. Una volta su quattro SSC 0,05% tra 20 e due volte per due minuti in PBS. Dopo aver drenato i vetrini, applicare sei microlitri di supporto di montaggio dello scudo vettoriale contenente DPI a 22 x 22 millimetri.

Assegnare il numero zero al vetrino coprioggetto e capovolgere il vetrino sul coperchio. Tamponare e sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Infine, analizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza.

Assegna un punteggio a ciascun nucleo da due analisti indipendenti. Utilizzare anche il software di imaging per acquisire un'immagine del nucleo per la conferma della diagnosi visiva e per l'archiviazione delle immagini come parte della garanzia di qualità del laboratorio. Qui una diffusione di metafase e un nucleo interfasico preparato da linfociti del sangue periferico indicano un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi cinque e nove con punti di rottura a cinque P 14,3 e nove P due, 4,1.

Le sonde di pesce illuminano sia i segmenti translocalizzati che il segmento centrico dei segnali del cromosoma nove. Nei nuclei di meri blast di interfaccia dal terzo giorno, gli embrioni possono essere catturati e poi fusi per formare un'immagine composita. Due segnali per ogni sonda indicano due copie di ciascun locus, il che è coerente con un complemento normale o bilanciato.

Per i cromosomi di traslocazione, i segnali colorati indicano una copia del segmento translocalizzato del cromosoma cinque, tre copie del segmento translocalizzato del cromosoma nove e due copie del segmento centrico del cromosoma CH nove. Questi dati sono coerenti con un prodotto sbilanciato di somi uomo per cinque P 14,3 a cinque PT e trisomia per nove P due, da 4,1 a nove pt. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare una biopsia di una singola cellula da un embrione umano e preparare un singolo nucleo utilizzando la tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza.

Questo è importante per ottenere risultati riproducibili e ottimali per determinare il complemento dei cromosomi sessuali o lo stato di traslocazione di un embrione.