Name: FISH per preimpianto Diagnosi Genetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Impara la tecnica FISH per la diagnosi genetica preimpianto su biopsie cellulari di embrioni umani. Questo metodo consente di identificare anomalie cromosomiche e migliorare la selezione embrionaria nelle tecnologie riproduttive.

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1. Lisi e diffondere un nucleo da una biopsia di blastomeri <ol><li> Buffer di lisi cellulare per diffusione di cellule (0,2% Tween20 di 0,01 M HCl, pH 2,0) deve essere preparato 24 ore di anticipo e conservati a -20 ° C. La preparazione di 100 ml e filtrare 20 ml in un contenitore sterile da 30 ml universale usando una siringa da 20 ml sterile e filtro siringa. Dispensare 1 ml di aliquote in 15/10 1,7 mL microcentrifuga sterili, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento. Si raccomanda di avere due partite diverse è uso, il nuovo lotto e il lotto precedente, che è stato testato e può essere utilizzato se il nuovo lotto non è soddisfacente. </li><li> Sbrinare il tampone di lisi a temperatura ambiente 30 minuti prima della procedura di biopsia. Ai fini pratici, la temperatura di esercizio sarà tra temperatura ambiente e temperatura della mano. </li><li> Punteggio ottenuto un piccolo cerchio (circa 5 mm di diametro) sul lato inferiore di una ammina rivestite scorrimento (ad esempio Genetix) utilizzando una penna di diamante e pre-etichetta la diapositiva con il numero del caso, numero di diapositiva unico, e data la biopsia. Utilizzare un vetrino separato per ogni blastomero in ordine numerico, e l'etichetta con il numero degli embrioni. Vetrini devono essere etichettati con una matita dura come 4H, e "cancellati" con un guanto in lattice per rimuovere la polvere di grafite. </li><li> Mettere un piccolo volume di tampone di lisi all'interno del cerchio. </li><li> Trasferire il blastomero biopsia nel buffer di lisi. Se necessario aggiungere tampone di lisi all'interno del cerchio fino a quando la cellula comincia a lisare, la cellula deve lisare completamente e il citoplasma disperdersi prima che si asciughi buffer. </li><li> Osservare il nucleo di modo che esso rimanga all'interno del cerchio e non è perduto, se la cella non ha un nucleo o ha nuclei multipli, biopsia un'altra cella. </li><li> Lasciare il vetrino asciugare all'aria a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Ibridazione in situ di un nucleo singolo blastomero <ol><li> Preparare una serie di etanolo (70, 90 e 100%) costituita in acqua distillata sterile. </li><li> Attivare e impostare il blocco caldo (ad esempio Hybaid Omnislide o Vysis Hybrite) a 75 ° C. </li><li> Sonde di sbrinamento, vortice, e centrifuga. I reagenti devono essere assistito e verificato di essere corretto prima che compongono la miscela della sonda. Volumi pipetta come specificato dal costruttore per costituire la miscela della sonda in una provetta da microcentrifuga 0,65 ml sterile e vortex e centrifugare prima dell'uso. Il volume totale della miscela sonda dovrebbe essere sufficiente per consentire 2 microlitri per ogni nucleo da testare e arrotondato al più vicino 10 microlitri per consentire un margine di sicurezza. </li><li> Prelavaggio i vetrini in vaschette Coplin con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M di NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i vetrini due volte in acqua distillata sterile. </li><li> Disidratare le diapositive con la serie di etanolo (70, 90 e 100%) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente e aria secca. Garantire scivoli sono completamente immersi e se la polvere di grafite galleggia in superficie, assorbire con un panno pulito. </li><li> Registrare la posizione del nucleo all'interno del cerchio da visualizzare con un microscopio a contrasto di fase. </li><li> Disidratare con il 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente e aria secca. </li><li> Applicare 2 l di miscela della sonda, e coprire con un 9 x 9 millimetri coprioggetto (un quarto di un 18 millimetri x 18 n.1 coprioggetto). </li><li> Sigillare i bordi del coprioggetto con gomma cemento (ad esempio Mucca Gum, correzione di mucca). </li><li> Codenature i vetrini su un blocco calda a 75 ° C per 5 minuti, e poi ibridare le diapositive durante la notte (16-20 ore) in una camera umidificata a 37 ° C. Mescola sonda che è interamente costituita da sonde centromero (ad esempio per casi legato al sesso) darà un risultato soddisfacente dopo 60 min di ibridazione. </li><li> Preparare un bagno d'acqua con sufficiente vaschette Coplin e calore a 71 ° C. </li><li> Preparare una 0.4x citrato standard di soluzione salina (CSD), soluzione di lavaggio stringente (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M di NaCl, 6 mm C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) e di calore nel bagno d'acqua. </li><li> Dispensare 50 ml di lavaggio stringente per Coplin vaso richiesti e controllare che la temperatura è 71 ° C immediatamente prima dell'uso con un termometro pulito. </li><li> Rimuovere con cura il mastice di ogni diapositiva e risciacquare il coprioggetto utilizzando 4x SSC/0.05 Tween20% (pH 7,0) a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le diapositive nel lavaggio 0.4x SSC stringenti a 71 ° C per 5 min. Lavare non più di 6 diapositive per vaschetta Coplin. </li><li> Lavare i vetrini in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Se la miscela contiene sonda sonda indirettamente etichettati (s), scaricare le diapositive del liquido in eccesso e applicare 20 l di anticorpo fluorescente coniugato con un 20 x 20 mm quadrati di Parafilm. </li><li> Incubare in una camera umidificata a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Rimuovere il Parafilm e lavare una volta in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Lavare due volte per 2 min in PBS, unt temperatura ambiente e drenare le diapositive. </li><li> Applica 6 ml di DAPI / Vectashield (160 ng di 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato in 1 ml di terreno Vectashield montaggio, Vector Laboratories) ad un 22 x 22 mm cod. 0 coprioggetto e invertire il vetrino sopra il coprioggetto. </li><li> Blot e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. </li></ol> 3. Analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza opportunamente attrezzato di appositi filtri per la sonde utilizzate. <ol><li> Segnali punteggio visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a fluorescenza e singoli filtri passa-banda per ogni fluorocromo nel saggio. Ogni nucleo dovrebbe essere segnato da due analisti. Una regola generale dovrebbe portare al gol di un segnale unico in cui due segnali molto vicine tra loro sono meno di un dominio (segnale di larghezza) a parte, tuttavia, il giudizio sulla base dell'esperienza deve essere esercitato per interpretare i segnali di varie dimensioni, intensità, e la separazione. </li><li> Utilizzare software di imaging (ad esempio Iside, MetaSystems, Altlußheim, Germania; CytoVision, Genetix) per catturare un'immagine del nucleo per la conferma della diagnosi visiva, e per la archiviazione delle immagini come parte di un piano di assicurazione della qualità da laboratorio. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Metafase e nuclei interfasici da colture di linfociti del sangue periferico devono essere esaminati per verificare che le sonde selezionati sono specifici per traslocazione dei cromosomi, informativo per i punti di interruzione (le sonde subtelomere dovrebbero ibridarsi solo ai segmenti traslocato e la sonda centromero (s) al centrica segmento (s)) e dei segnali in nuclei interfasici deve essere brillante e discreto. Segnando il numero di segnali per ogni sonda in 100 nuclei interfasici da ogni partner si consiglia di valutare l'efficacia del test. In questo caso 2 segnali sono stati segnati nel 95% -99% dei nuclei per ciascuna sonda. La figura 1 mostra una metafase e nucleo interfase da una preparazione per una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9. Segnali in nuclei interfasici da blastomeri dell'embrione deve essere brillante e discreto e valutato con separato filtri passa banda per i colori utilizzati. La Figura 2 mostra un nucleo blastomero con un modello normale segnale (2 copie per tutti i loci testati) coerenti con un corredo cromosomico normale o bilanciato per il cromosoma 5 e 9, e un nucleo con un modello di segnale anomalo in linea con un prodotto della traslocazione sbilanciata che ha monosomia (una copia) per il segmento del cromosoma 5 traslocato e trisomia (3 copie) per il segmento traslocato del cromosoma 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Uno spread metafase e un nucleo interfase preparati da colture di linfociti del sangue periferico da un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9 con punti di interruzione in 5p14.3 9p24.1 e:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +);. 9) 5ptel48-, 9ptel30 + ( Sonde FISH sono stati selezionati per entrambi i segmenti traslocato (5p14.3 → 5pter, rosso Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) e il segmento centrica del cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, blu Abbott CEP 9 alfa satellite SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Segnali Figura 2. Nuclei in interfase blastomero dal primo giorno-3 embrioni catturate utilizzando un filtro diverso per ogni fluorocromo e uniti per formare un'immagine composita. (A) due segnali per ogni sonda indicare due copie di ogni luogo, che è coerente con un complemento normale o bilanciato per traslocazione dei cromosomi. (B) Un segnale rosso, tre segnali verdi e due segnali blu che indica una copia del traslocato segmento del cromosoma 5, tre copie del segmento di traslocazione del cromosoma 9 e due copie del segmento centrica del cromosoma 9, che è coerente con adiacente -1 segregazione della traslocazione determinando un prodotto non bilanciato con monosomia per 5p14.3 → 5pter e la trisomia per 9p24.1 → 9pter.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;applicazione di ibridazione in situ fluorescente (FISH) in una singola cellula embrionale (blastomero) presenta sfide particolari sia nel aspetti pratici e per l&#39;interpretazione del modello del segnale. La cella biopsia deve essere diffuso all&#39;interno di una zona di pre-definito sulla diapositiva in modo da facilitare la sua localizzazione seguenti pesci; estrema cura deve essere presa per assicurare che la cellula subisce una lisi, che il citoplasma è stato disperso, e che il nucleo è visibile e intatto, e, come la diagnosi dipende dai risultati di questa singola cella, segnando rigorose e interpretazione linee guida dovrebbero essere applicate. Tuttavia, in mani esperte, FISH è una tecnica robusta per la pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) nella pratica clinica. Il principio della PGD mediante FISH è che l&#39;obiettivo sonde specifiche di DNA marcati con fluorocromi diversi o apteni possono essere usati per rilevare il numero di copie di loci specifici, e quindi di rilevare lo squilibrio dei cromosomi associati a segregazione meiotica di riarrangiamenti cromosomici (1), tra cui robertsoniane traslocazioni, traslocazioni reciproche, inversioni, e riarrangiamenti complessi (2). PESCE può anche essere usato per selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia, per cui non esiste nessuna mutazione specifica di test (3, 4). Più controverso, PESCE è stato utilizzato anche per lo screening per aneuploidie dei cromosomi sporadici al fine di cercare di migliorare l&#39;efficienza di riproduzione assistita (5, 6), ma il valore predittivo di questo test utilizzando FSIH è probabile che sia inaccettabilmente basso nella maggior parte delle persone mani e non è raccomandato per uso clinico di routine (7). Questo articolo si concentra sugli aspetti tecnici e le limitazioni della FISH applicata alla clinica cella singola diagnosi. Metodi di diffusione e di fissaggio blastomeri singolo includono metanolo / acido acetico (5, 8), Tween / HCl (9), e una combinazione di Tween / HCl e metanolo / acido acetico (10). Le variazioni includono il trattamento ipotonico delle cellule prima di diffondere e / o pepsina ed il trattamento paraformaldeide dopo la fissazione. Il metodo deve essere opportunamente convalidato per il laboratorio (14). Il Tween / HCl metodo è descritto in dettaglio in questo articolo. Il Tween / HCl metodo è tecnicamente semplice e altamente riproducibile in diversi laboratori. Questo metodo può essere utilizzato per preparare singoli nuclei per la diagnosi FISH della determinazione del sesso e riarrangiamenti cromosomici con accettabile accuratezza diagnostica (7). Mescola sonda può combinare direttamente etichettati e indirettamente sonde marcate, e le sonde di diversi produttori. Sonde per conoscere regioni cromosomiche polimorfici (11, 12), o quelli noti a cross-ibridare in modo significativo con altri cromosomi (13) dovrebbe essere evitata, anche se può essere utilizzato se dimostrato di essere appropriate e specifiche per la PGD da test prima su entrambi i partner riproduttivo . Fluorocromi disponibile / apteni e le strategie per sonde discriminanti sono le seguenti: Texas Red (TR), isotiocianato di fluorescina (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sonde biotinilato rilevati con TR-avidina, coniugati con avidina, o Cy-5 streptavidina (visualizzato per mezzo di un filtro FarRed), un mix di sonde rosso e verde per la produzione di un segnale giallo, un secondo round di ibridazione e di un terzo colore creato catturando in sequenza di SpectrumOrange utilizzando un TexasRed e un filtro SpectrumGold). Un insieme sonda contenente tre sonde, specifici per le regioni del centromero i cromosomi X e Y e autosoma uno, è raccomandato per la determinazione del sesso (14), la sonda autosomica viene utilizzato per stabilire ploidia e quindi a distinguere tra X trisomia (2n, 47 , XXX) e triploidia (3n, 69, XXX), e tra tetrasomia X (48, XXXX) e tetraploidia (4n, 92, XXXX). Una sonda applicata in tipico di questa impostazione è il mix AneuVysion Abbott contenenti alpha-satellite X, Y, e 18; questo set sonda ha dimostrato di avere un tasso di polimorfismo molto basso, e quindi pre-trattamento work-up dei partner riproduttivo non è necessaria (14). Il mix di sonda per qualsiasi riordinamento specifici devono: Idealmente contenere sonde almeno sufficiente a rilevare tutti i prodotti attesi del riassetto con squilibrio cromosomico. Se ciò non fosse possibile, la sonda si mescola in cui i prodotti non rilevati sbilanciato sono stati valutati per essere non vitali in una gravidanza riconoscibile e possono avere prevalenza molto bassa può essere accettabile (14). Essere testato su colture metafasi di linfociti da entrambi i partner riproduttivo. Almeno dieci diffonde metafase devono essere esaminati per la specificità della sonda, polimorfismi e cross-ibridazione, e, per il vettore riarrangiamento cromosomico, per garantire che le sonde ibridano come previsto ai diversi segmenti del riassetto. Inoltre, almeno 100 nuclei interfasici da questi preparati dovrebbero essere segnati per valutare la specificità del segnale, la luminosità e discretezza (14). Commercial set sonda PGS sono disponibili (ad esempio Abbott MultiVysion PB o PGT), intese a promuovere l&#39;cromosomi più frequentemente trovato per essere aneuploidi in prodotti del concepimento, e composta da una singola sonda per cromosoma mirati. In genere il nucleo può avere una seconda ibridazione con sonde per i cromosomi supplementari destinate a fornire un test per i cromosomi 13, 15, 16, 18, 21, 22, e XY (14). Il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH qui descritto è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l&#39;uso clinico di routine (7, 15). Tecniche come ibridazione genomica comparativa (CGH) applicata a singole cellule sono in grado di testare per il numero di copie di ogni cromosoma (Wilton et al. 2001), e l&#39;utilizzo di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) array e analisi quantitativa (Wells et al . 2008) o genotipizzazione &quot;karyomapping&quot; (Handyside et al. 2009) sono promettenti tecniche alternative per rilevare aneuploidie dei cromosomi. Tuttavia, il limite di risoluzione e precisione lo sbilanciamento segmento rimangono incerte ed è probabile che PESCE continuerà ad essere la tecnica di scelta per i riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono piccoli segmenti.

<table><tbody><tr><td>Acido cloridrico, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di sodio anidro, 500 g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Pastiglie di Idrossido di Sodio, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Dazio pagato</td></tr><tr><td>Tri-citrato di sodio, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Gomma da colla per bovini, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Non più disponibile</td><td>Vecchie scorte possono ancora essere trovate nei negozi di articoli per arte</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500 µl</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;il flaconcino rec&amp;rsquo;d con ogni sonda Cytocell TEL</td></tr><tr><td>Smalto per unghie, 12 mL</td><td>Stivali</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti con ammine, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidina, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Cy-5, 0,001 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga, 1,75 mL, confezione da 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga, 0,6 mL, confezione da 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori universali da 30 ml, confezione da 400</td><td>Sterilin</td><td>128B</td><td>Disponibile da NHS Supply Chain, n. cat. KCP053</td></tr><tr><td>Blocco riscaldato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruciatore a spirito Supporto per bruciatore a spirito Stoppino per bruciatore a spirito</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di vetro otturate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tessuti, 100 scatole</td><td>CATENA DI FORNITURA NHS</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi per coltura di metalli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vassoi in melammina plastica</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bocchino per pipetta a bocca</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa, 0,2&amp;mu;dimensione dei pori m, diametro 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Penna diamantata</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante per vetrini</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Camera di ibridazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotolo di tessuto</td><td>CATENA DI FORNITURA NHS</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker Jar</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Vaso Coplin</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, fini</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Pinze, smussate</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>Becher da 1000 mL</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Carte per blotting senza fibre, confezione da 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici blu satinati, scatola da 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip, 18x18 mm, No. 1, confezione da 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Coverslip, 22x22 mm, No. 0, confezione da 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip, 22x50 mm, No. 0, confezione da 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL, confezione da 100</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>Punta per pipetta da 1 mL, 10 rack da 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno a 37 °C</td><td>Attrezzature per finanziamenti</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Termometro a alcol</td><td></td><td></td><td>Diverse fonti disponibili</td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo pH</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Spina BNC per adattare il pHmetro Jenway 3305</td></tr><tr><td>Agitatore riscaldante</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur da 1 mL, scatola da 500</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm x 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish per preimpianto diagnosi genetica

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Diagnosi pre-impianto genetico (PGD) è un&#39;alternativa stabilito per la diagnosi prenatale, e coinvolge la selezione pre-impianto degli embrioni da una coorte generato dalla tecnologia di riproduzione assistita (ART). Questa selezione può essere richiesto a causa di malattie monogeniche familiare (per esempio la fibrosi cistica), o perché uno dei partner porta un riarrangiamento cromosomico (ad esempio un doppio senso traslocazione reciproca). PGD ​​è disponibile per coppie che hanno avuto precedenti figli affetti, e / o nel caso di riarrangiamenti cromosomici, aborti ricorrenti o infertilità. Ovociti aspirati stimolazione ovarica seguito vengono fecondati in vitro da parte in immersione nel liquido seminale (IVF) o mediante iniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo (ICSI). Pre-impianto scissione embrioni allo stadio sono sottoposte a biopsia, di solito con la rimozione di una singola cellula il 3 ° giorno post-fertilizzazione, e la cellula biopsia è testato per stabilire lo status genetico dell&#39;embrione. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei fisso di cellule sottoposte a biopsia con target specifici per sonde di DNA è la tecnica di scelta per rilevare squilibrio cromosoma associata a riarrangiamenti cromosomici, e di selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia per la quale non vi è nessuna mutazione specifica di test. PESCE è stato utilizzato anche per gli embrioni schermo per aneuploidie dei cromosomi spontanea (noto anche come PGS o PGD-AS) al fine di cercare di migliorare l&#39;efficienza di riproduzione assistita, tuttavia, il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH descritta qui è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l&#39;uso clinico di routine. Descriviamo la selezione di apposite sonde per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla PGD in ambito clinico.

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

La diagnosi genetica pre-impianto (PGD) è un'alternativa consolidata alla diagnosi prenatale e prevede la selezione di embrioni pre-impianto da un...

Lo scopo di questa procedura è utilizzare la tecnica di ibridazione in situ fluorescente a doppio bersaglio per determinare lo stato dei cromosomi sessuali o di traslocazioni in embrioni umani ottenuti in vitro e a rischio di anomalie genetiche. Questo viene ottenuto lisando una singola cellula prelevata da un embrione al terzo giorno di sviluppo su un vetrino e lasciando asciugare all'aria il nucleo. Il secondo passaggio consiste nel denaturare il DNA e ibridare il DNA nucleare bersaglio con sonde di DNA marcate con fluorocromi di diversi colori.Successivamente, il sonda in eccesso viene rimossa mediante un lavaggio rigoroso e il nucleo viene colorato con un colorante fluorescente specifico per il DNA. L'ultimo passaggio consiste nell'osservare il nucleo mediante microscopio a fluorescenza e nel catturare immagini digitali. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano il numero di copie delle regioni cromosomiche bersaglio attraverso la microscopia a fluorescenza.Generalmente, le persone nuove rispetto a questa tecnica incontreranno difficoltà perché essa si trova al limite stesso della tecnica di ibridazione fluorescente in situ. 24 ore prima, preparare il buffer di lisi cellulare per la dispersione delle cellule. Filtrare la soluzione ed aliquotare un millilitro in 10-15 provette microcentrifuga sterili da 1,7 millilitri, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento a meno 20 gradi Celsius, poco prima della procedura di biopsia.Scongelare il buffer di lisi a temperatura ambiente. Tracciare un piccolo cerchio di circa cinque millimetri di diametro sulla parte inferiore di un vetrino rivestito con ammine utilizzando una penna a diamante, quindi utilizzare una matita dura 4H per etichettare preventivamente il vetrino con la sigla BLO indossando un guanto in lattice. Per rimuovere eventuali polveri di grafite, utilizzare un vetrino separato per ogni specchio del blaster in ordine numerico.Ora posizionare un piccolo volume di buffer di lisi all'interno del cerchio. Trasferire il biopsy blaster nel buffer di lisi. Aggiungere il buffer di lisi secondo necessità per lisare la cellula.Osservare il nucleo per assicurarsi che rimanga all'interno del cerchio e non venga perso. Se la cellula non ha un nucleo o presenta più nuclei, eseguire una biopsia su un'altra cellula. Lasciare che il vetrino si asciughi all'aria a temperatura ambiente.Prima di tutto, eseguire un prelavaggio dei campioni in contenitori coplan utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi risciacquare due volte con acqua distillata sterile, disidratare con una serie di etanolo per due minuti ciascuno a temperatura ambiente e lasciare asciugare all'aria. Assicurarsi che i vetrini siano completamente immersi e, se della polvere di grafite galleggia in superficie, assorbirla con un tessuto pulito.Registrare la posizione del nucleo all'interno del cerchio visualizzandolo al microscopio a contrasto di fase. Quindi disidratare i campioni con etanolo al 100% per due minuti a temperatura ambiente ed essiccare all'aria. Applicare ora due microlitri di miscela del sonda e coprire con un coprioggetto di nove per nove millimetri.Sigillare i bordi del vetrino con colla di gomma. Eseguire la denaturazione codificata. Incubare su un blocco termico a 75 gradi Celsius per cinque minuti, quindi ibridare tutta la notte in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per ogni barattolo di accoppiamento.Equilibrare 50 millilitri di soluzione di lavaggio stringente 0,4 volte SSC in un bagno d'acqua a 71 gradi Celsius. Posizionare la bottiglia del lavaggio stringente e il barattolo di accoppiamento vuoto nel bagno d'acqua a temperatura ambiente e riscaldare a 71 gradi Celsius, regolare il pH del lavaggio stringente e travasare nei barattoli di Cochin. Procedere quindi rimuovendo con attenzione il cemento di gomma da ogni vetrino e risciacquare via il coverslip utilizzando SSC 4 volte con 0,05% Tween 20 a pH 7 a temperatura ambiente.Lavare i campioni nella soluzione di lavaggio stringente 0,4 volte SSC a 71 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da quattro volte SSC con 0,05% di Tween 20 a temperatura ambiente per due minuti. Per le sonde marcate in modo indiretto, asciugare le lamelle dall’eccesso di liquido e applicare 20 microlitri di anticorpo coniugato con fluorocromo sotto un quadrato di paraformaldeide di 20 per 20 millimetri. Incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Rimuovere la pellicola di parafilm ed eseguire i seguenti lavaggi a temperatura ambiente per due minuti: una volta in SSC 4 volte con tween 20 0,05% e due volte per due minuti in PBS. Dopo aver drenato i vetrini, applicare sei microlitri di mezzo di montaggio vector shield contenente DPI su un'area di 22 per 22 millimetri.Contrassegnare con lo zero il coprioggetto e capovolgere il vetrino sopra il coprioggetto. Asciugare delicatamente e sigillare i bordi del coprioggetto con vernice trasparente per unghie. Infine, analizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza.Valutare ciascun nucleo da parte di due analisti indipendenti. Utilizzare inoltre un software di imaging per acquisire un'immagine del nucleo al fine di confermare la diagnosi visiva e per l'archiviazione delle immagini, come parte della garanzia di qualità del laboratorio. Qui, una metafase distesa e un nucleo in interfase preparati da linfociti del sangue periferico indicano un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi cinque e nove, con punti di rottura in 5p14.3 e 9p2.4.1.I sonde per FISH evidenziano sia i segmenti translocati che il segmento centrico dei segnali del cromosoma nove. Nelle cellule in interfase di blastomeri nuclei provenienti da embrioni del terzo giorno, è possibile acquisire le immagini e quindi unirle per formare un'immagine composita. Due segnali per ciascuna sonda indicano due copie di ciascun locus, il che è coerente con un corredo normale o bilanciato.Per i cromosomi di traslocazione, i segnali colorati indicano una copia del segmento traslocato del cromosoma cinque, tre copie del segmento traslocato del cromosoma nove e due copie del segmento centrico del cromosoma CH nove. Questi dati sono compatibili con un prodotto squilibrato di monosomia per 5p14.3-5pt e trisomia per 9p24.1-9pt. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare una singola cellula prelevata da un embrione umano e preparare un singolo nucleo mediante la tecnica di ibridazione fluorescente in situ.Questo è importante per ottenere risultati del test riproducibili e ottimali al fine di determinare il complemento dei cromosomi sessuali o lo stato di traslocazione di un embrione.

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La funzione del gene può essere oscurato la perdita di funzione esperimenti se non vi è compensazione da un altro gene. Il modello di zebrafish fornisce un numero relativamente elevato throughput significa rivelare tale ridondanza funzionale negli embrioni viventi.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Il pesce zebra è un potente sistema modello per la biologia dello sviluppo e la ricerca sulle malattie umane grazie alla loro somiglianza genetica con i vertebrati superiori. Questo protocollo descrive una metodologia per creare embrioni aploidi di zebrafish che possono essere utilizzati per strategie di screening in avanti per identificare mutazioni recessive in geni essenziali per l'embriogenesi precoce.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Un protocollo di microiniezione semplice ed efficiente per l'editing di gene in embrioni di pesce gatto della manica usando il sistema CRISPR/Cas9 è presentato. In questo protocollo, guida RNA e proteina Cas9 erano microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Questo protocollo è stato convalidato battendo fuori due geni immuno-correlati di pesce gatto della manica.

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Qui, introduciamo un metodo di sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneeuploidy (PGT-A) con i vantaggi di tempi di consegna brevi, bassi costi e alta produttività.

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Lo sviluppo precoce dipende dai prodotti ereditari materni e il ruolo di molti di questi prodotti è attualmente sconosciuto. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza CRISPR-Cas9 per identificare i fenotipi di effetti materni in una singola generazione.

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Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

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Impara la tecnica FISH per la diagnosi genetica preimpianto su biopsie cellulari di embrioni umani. Questo metodo consente di identificare anomalie cromosomiche e migliorare la selezione embrionaria nelle tecnologie riproduttive.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

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